李英，欒麗英

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院，山東煙臺(tái)265713；2.魯東大學(xué)，山東煙臺(tái)264025）

HPLC法測(cè)定火腿腸中山梨酸、苯甲酸提取條件優(yōu)化

李英1，欒麗英2

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院，山東煙臺(tái)265713；2.魯東大學(xué)，山東煙臺(tái)264025）

研究了HPLC方法測(cè)定火腿腸中山梨酸、苯甲酸含量時(shí)影響山梨酸、苯甲酸提取的3個(gè)主要因素：超聲時(shí)間、沉淀劑用量和料液比。并通過單因素和正交試驗(yàn)得到火腿腸中山梨酸、苯甲酸提取的最優(yōu)工藝條件。當(dāng)超聲時(shí)間為15min、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各添加3mL、料液比為1∶11（g/mL）時(shí)提取效果最好。數(shù)據(jù)表明該方法線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)良好（0.999 9～1.000 0），平均加標(biāo)回收率均在90%以上，簡(jiǎn)化了預(yù)處理過程，具有檢測(cè)速度快、靈敏度和準(zhǔn)確度高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

高效液相色譜法；火腿腸；山梨酸；苯甲酸；提取

在火腿腸的生產(chǎn)加工中使用較廣泛的防腐劑以苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鉀鹽為主[1]。防腐劑可以抑制和殺滅微生物，但過量和超標(biāo)加入會(huì)破壞食品中維生素、在一定程度上會(huì)抑制骨骼生長，危害腎、肝臟的健康，并引起毒性反應(yīng)[2]。我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)火腿腸類肉制品中苯甲酸、山梨酸及其鉀鹽的使用范圍和最大使用量都有規(guī)定[3-4]。但由于不法生產(chǎn)廠家違規(guī)使用防腐劑，在流入市場(chǎng)的火腿腸制品的檢測(cè)中仍可檢出苯甲酸和超標(biāo)加入的山梨酸。

高效液相色譜技術(shù)（HPLC）廣泛應(yīng)用于各種食品添加劑的檢測(cè)[5-11]，是目前檢驗(yàn)防腐劑最常用且有效的方法，HPLC可以同時(shí)檢測(cè)多種防腐劑，在簡(jiǎn)便快捷、真實(shí)有效的基礎(chǔ)上還提高了檢測(cè)效率。在國標(biāo)GB/T 5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定》中苯甲酸、山梨酸測(cè)定的液相色譜法中，沒有提及火腿腸類肉制品的樣品處理方法[4]?；鹜饶c制品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基質(zhì)成份較多，并且苯甲酸、山梨酸的脂溶性造成了樣品處理的復(fù)雜，在HPLC檢測(cè)火腿腸中山梨酸鉀、苯甲酸鈉的過程中，用普通的提取方法不是很理想，提取不夠完全[12-15]，干擾因素很多。本文通過試驗(yàn)研究影響提取火腿腸中的山梨酸、苯甲酸的3個(gè)因素：超聲時(shí)間、沉淀劑選擇、料液比，對(duì)樣品處理方法進(jìn)行了改進(jìn)和研究，優(yōu)化了檢測(cè)過程，使得最終的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速、靈敏準(zhǔn)確、檢測(cè)限低、經(jīng)濟(jì)可行。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；AL104電子天平（精確至0.000 1 g）：梅特勒-托利多（中國）有限公司；HR7628/00食品加工機(jī)：飛利浦電子（上海）有限公司；VORTEX-6漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；JT-1027HT超聲波清洗機(jī)：深圳市潔拓超聲波清洗機(jī)設(shè)備有限公司；TOMYMX-307套筒式微量冷凍離心機(jī)：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；WP-UP-1510實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)：四川中浪科技有限公司。

其他：微量移液器（100、200、1 000μL）；刻度移液管（5、10mL）；離心管（100mL）；比色管（50mL）；有機(jī)相濾膜（0.45μm）；2mL注射器；2mL樣品瓶（Agilent）等。

1.2 試劑和材料

1）材料：火腿腸（市售）。

2）試劑：三氯乙酸（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅均為優(yōu)級(jí)純；山梨酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（美國sigma公司）；超純水。

2 方法

2.1 樣品制備

首先用食品加工機(jī)將火腿腸樣品絞碎，混勻，裝入樣品袋備用。每個(gè)樣品攪拌完后應(yīng)認(rèn)真清潔食品加工機(jī)，并擦干，防止樣品互相污染。

2.2 試樣提取時(shí)間的優(yōu)化

稱取5 g經(jīng)充分絞碎過的均勻試樣至50mL的比色管中，在稱取的過程中要避免交叉污染，加入30mL左右的甲醇-磷酸鹽緩沖液，1mL1%的三氯乙酸，在振蕩器上振蕩3min，放入超聲機(jī)中超聲處理。在單因素優(yōu)化試驗(yàn)中，超聲的時(shí)間分別選擇5、10、15、20min和25min。

2.3 試樣凈化沉淀劑種類的選擇及用量的優(yōu)化

向超聲后的樣品提取液中分別加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、鎢酸鈉或硫酸銅作為沉淀劑，定容后振蕩3 min，繼而轉(zhuǎn)入100mL離心管中，4 000 r/min離心5 min。在選取亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為最佳沉淀劑后，按照兩者各為1、2、3、4mL和5mL的添加量，以沉淀濕重為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行沉淀劑使用量的優(yōu)化。離心前對(duì)離心管進(jìn)行稱重，離心后對(duì)離心管和沉淀的總重進(jìn)行再次稱重，兩者的差值即為沉淀的濕重。

2.4 試樣提取料液比的優(yōu)化

按照火腿腸與甲醇-磷酸鹽溶劑1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13（g/mL）的比例進(jìn)行料液比的優(yōu)化，其中超聲波提取時(shí)間為15min，沉淀劑為亞鐵氰化鉀和乙酸鋅。

2.5 山梨酸和苯甲酸含量的測(cè)定

2.5.1 液相色譜條件

儀器配置：超高效液相色譜儀（Agilent1100）；色譜柱：Phenomenex C18液相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：A為5%甲醇-0.02mol/L乙酸銨水溶液，C為甲醇；流速：1.000mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長：230 nm。流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫Table1 Gradient elution of mobile phase

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取山梨酸、苯甲酸國標(biāo)液（1 mg/kg）5mL，至50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液密封后避光4℃保存，有效期為3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，至10mL比色管中，加水稀釋至刻度，配制成山梨酸、苯甲酸混標(biāo)，濃度為：0.2、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L。

2.5.3 樣品中山梨酸和苯甲酸含量的測(cè)定

樣品提取液過0.45 um濾膜后備用。測(cè)試條件同2.5.1。

3 結(jié)果分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取1mL 0.2、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)儀器，以山梨酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得出山梨酸、苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程、相關(guān)系數(shù)，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見表2。

3.2 波長的選擇

苯甲酸檢測(cè)的最佳波長在230 nm，而山梨酸檢測(cè)的最佳波長在254 nm，為了同時(shí)測(cè)定兩種組分，選擇檢測(cè)波長為230 nm，以獲得最大靈敏度。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table2 Linear equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

3.3 超聲提取時(shí)間選擇

在山梨酸、苯甲酸平均回收率大于90%時(shí)，當(dāng)超聲時(shí)間為5、10、15、20、25min在其他處理方法相同的條件下，同一個(gè)加標(biāo)的火腿腸樣品中山梨酸、苯甲酸提取效果見圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.1 The effect of ultrasonic time on results

由圖1可看出，在室溫條件下，超聲時(shí)間在5min～15 min之間時(shí)，隨著時(shí)間延長，提取效果明顯增強(qiáng)，超聲提取時(shí)間為15 min時(shí)，提取效果最明顯，超過15min，增加效果不明顯。選定提取時(shí)間10、15、20min做正交試驗(yàn)。

3.4 沉淀劑的選擇

火腿腸類制品蛋白質(zhì)含量較高，因而在樣品的處理過程中，應(yīng)該選取沉淀效果較好的沉淀劑以達(dá)到去除樣品中蛋白質(zhì)的目的。目前使用的最主要的蛋白質(zhì)沉淀劑有3種：亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、鎢酸鈉、硫酸銅。選取同一陰性火腿腸樣品，添加相同量的山梨酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用3種沉淀劑進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2。

由圖2可知，使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑能較好的沉淀蛋白質(zhì)，進(jìn)而防止了色譜柱的堵塞，延長了設(shè)備的使用壽命。

3.5 沉淀劑的用量

圖2 不同沉淀劑對(duì)提取效果的影響Fig.2 The effect of different precipitation agent on results

當(dāng)使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各1mL時(shí)，有少量沉淀析出，稱量后發(fā)現(xiàn)沉淀的濕重為2.05 g；當(dāng)使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各2mL時(shí)，有大量沉淀析出，稱量后發(fā)現(xiàn)沉淀的濕重為4.96 g；當(dāng)使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各3、4mL和5mL時(shí)，沉淀的析出量與使用2mL時(shí)大體相同，分別為5.13、5.20 g和5.18 g。以節(jié)約試劑為原則，選用兩種沉淀劑各2mL。

3.6 提取溶劑量的選擇

山梨酸、苯甲酸都是微溶于水的物質(zhì)，但易溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑?；鹜饶c是一種蛋白質(zhì)含量多的復(fù)雜基質(zhì)，比較適合用甲醇-磷酸鹽作為提取劑。本文選取甲醇-磷酸鹽作為提取溶劑來提取山梨酸和苯甲酸，按照樣品與提取溶劑1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13（g/mL）的比例進(jìn)行提取效率的研究。選取同一陰性火腿腸樣品添加相同量的山梨酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，試驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 不同料液比對(duì)提取效果的影響Fig.3 The effect of different ratio of material to liquid on results

由圖3可知，樣品質(zhì)量與提取溶劑甲醇-磷酸鹽緩沖液體積比為1∶9、1∶11、1∶13（g/mL）3種比例提取效果均較好，在試驗(yàn)結(jié)果良好的基礎(chǔ)上，以最佳的提取效果和最少的溶劑量為原則，選取樣品質(zhì)量與提取溶劑的體積比1∶9為最適的用量。選定料液比1∶7、1∶9、1∶11（g/mL）3種比例做正交試驗(yàn)。

3.7 脂肪對(duì)分析方法的干擾與消除

火腿腸樣品脂肪含量較高，這對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，比如可能會(huì)導(dǎo)致色譜的峰形不規(guī)則，影響試驗(yàn)結(jié)果的分析；也可能會(huì)使進(jìn)樣閥堵塞或磨損，甚至堵塞色譜柱，最終導(dǎo)致儀器的使用壽命降低。由于提取液所含脂肪在震蕩時(shí)可以產(chǎn)生球狀懸浮物，漂浮在提取液的上層，并且在加入蛋白質(zhì)沉淀劑后，減少了脂肪的乳化，脂肪與提取液充分離析。將樣品提取液于95℃的恒溫水浴鍋中加熱15min，使脂肪充分融化[12]。取出并冷卻至室溫后，于-1℃條件下冷藏，大部分的脂肪會(huì)在冰點(diǎn)處析出，經(jīng)處理后的樣品提取液中基本不含脂肪，以消除脂肪對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

3.8 采用不同提取方法測(cè)定火腿腸中山梨酸和苯甲酸含量的正交試驗(yàn)結(jié)果

選取超聲時(shí)間、料液比、沉淀劑3個(gè)關(guān)鍵因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定最佳提取條件，提取次數(shù)為1次。正交因素水平見表3[16-17]。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table3 Orthogonal experimental factor level table

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table4 Orthogonal experimental results

續(xù)表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table4 Orthogonal experimental results

表4的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以上3種因素的影響順序?yàn)锳﹥B﹥C，即極差R最大的是超聲時(shí)間，第2水平為優(yōu)，以超聲時(shí)間15min為最佳；其次是沉淀劑，第3水平為優(yōu)，以亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各加3mL為最好；極差最小的是料液比，第3水平為優(yōu)，即樣品質(zhì)量與提取溶劑的體積比1∶11（g/mL）時(shí)，對(duì)山梨酸、苯甲酸的提取效果最好。綜上所述，三因素的最優(yōu)水平組合為A2B3C3，即超聲提取時(shí)間為15min，沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各添加3mL，料液比1∶11（g/mL）試驗(yàn)效果最佳。以該最優(yōu)組合進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出平均回收得率為98.51%，說明該優(yōu)化工藝參數(shù)可用于指導(dǎo)火腿腸制品中山梨酸、苯甲酸的提取。

3.9 加標(biāo)回收率和方法精密度試驗(yàn)

本方法測(cè)量精密度主要是通過加標(biāo)回收率來表示。待測(cè)樣品選用未檢出山梨酸、苯甲酸的火腿腸（即陰性樣品）作為加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)樣品，向破碎均勻的火腿腸中添加0.25、0.5、1mg/kg 3個(gè)不同濃度的山梨酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照上述最優(yōu)前處理方法[即料液比1∶11（g/mL）、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各添加3mL、超聲15min]進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)每個(gè)不同濃度分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，然后取平均值，測(cè)得回收率如表5。

表5 山梨酸、苯甲酸的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果Table5 Recovery and precision results of sorbitol acid and benzoic acid

續(xù)表5山梨酸、苯甲酸的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果Continue table5 Recovery and precision results of sorbitol acid and benzoic acid

由表5可以看出，用本方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)時(shí)，回收率在91.95%到95.28%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)在1.6%到4.2%之間，說明此檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度都很高。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間為15min、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅添加量為3mL、料液比為1∶11（g/mL）時(shí)提取效果較好，并且本方法對(duì)火腿腸中的山梨酸、苯甲酸測(cè)定效果良好，回收率高。該方法線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)良好（0.999 9～1.000 0），平均加標(biāo)回收率均在90%以上。

本檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了火腿腸類制品中山梨酸和苯甲酸的優(yōu)良的提取分離，適用于各種火腿腸中山梨酸、苯甲酸的定性、定量測(cè)定。具有前處理方法簡(jiǎn)單、多個(gè)樣品同時(shí)測(cè)定、針對(duì)性強(qiáng)、分析周期短、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)方法實(shí)用，結(jié)果可靠，適于樣品大批量的樣品檢測(cè)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

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Optimization of Extraction Condition on the Determination of Sorbic Acid and Benzoic Acid in Ham Sausage by High Performance Liquid Chromatography

LI Ying1，LUAN Li-ying2
（1.Yantai Nanshan University，Yantai265713，Shandong，China；2.Ludong University，Yantai264025，Shandong，China）

The effects of three main factors on the extraction of sorbic acid and benzoic acid in HPLC：ultrasonic time，precipitation agent，and material liquid ratio were studied. By single factor extraction tests and the orthogonal tests the optimum extracting conditions for sorbic acid and benzoic acid in ham sausage were confirmed as follows：the ultrasonic time 15 min，added potassium ferrocyanide and zinc acetate each for 3 mL as precipitant，liquid material ratio 1 ∶ 11 （g/mL）. The results showed that the method had good linear correlation coefficient（0.999 9-1.000 0），and the average recovery rate of the method was more than 90 %，which had the advantages of simple，fast detection，high sensitivity，high accuracy，and high automation degree.

high performance liquid chromatography；ham sausage；sorbic acid；benzoic acid；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.028

2016-05-14

2015年度山東省青年教師教育教學(xué)研究課題（一般項(xiàng)目）（15SDJ160）

李英（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。