唐 陽，曹 燕，楊立坤，肖越勝

(揚州市醫(yī)學檢驗中心，江蘇揚州225001)

揚州市乙型肝炎病毒的基因分型

唐 陽，曹 燕，楊立坤，肖越勝

(揚州市醫(yī)學檢驗中心，江蘇揚州225001)

目的研究分析揚州市乙型肝炎病毒基因型和病毒載量的關系。方法將278例乙肝患者按血清病毒拷貝數(shù)103-108等級分成6組，多重PCR(multiplex PCR，mPCR)分析基因型，按不同基因型在各組中的例數(shù)進行線性趨勢χ2檢驗，分析病毒基因型在各組中比例隨載量增加而出現(xiàn)的趨勢改變。結果B基因型244例，C基因型60例，混合感染B+C基因型9例，線性趨勢χ2檢驗存在統(tǒng)計學意義。結論揚州市乙型肝炎病毒感染以基因B和C型為主，未檢測出A、D基因型，基因B型感染比例多于C型，隨病毒載量的增高，基因B型百分比呈下降而C型呈上升趨勢。

乙型肝炎病毒；基因型；線性趨勢χ2檢驗

人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是乙型肝炎（hepatitis B，HB）的病原體，屬DNA病毒科，球形雙層衣殼。HBV基因組是不完全閉合環(huán)狀雙鏈DNA，長度約3.2kb，有四個開放式閱讀框（ORF），分別為S、C、P和X區(qū)，相互有重疊現(xiàn)象，具有轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白的功能，其中S區(qū)編碼大、中、小3種包膜蛋白。1972年根據(jù)HBV表面抗原的共同抗原決定簇將HBV分成四個血清型。1988年，Okamoto[1]等建立了以HBV全基因系列核苷酸異源性的分型標準，即根據(jù)S基因序列異源性大于或等于4%或全基因系列異源性大于或等于8%將HBV分為A-H 8種基因型[2]，最新研究發(fā)現(xiàn)HBV存在I和J基因型[3，4]。HBV基因型存在混合感染的現(xiàn)象[5]，有較為明顯的地域分布，B型C型流行于亞洲，D型見于全世界。我國的HBV感染以B和C型為主，占90%以上[6-9]，南方以B基因型為主，C基因型主要分布于北方，A和D基因型在我國東部地區(qū)也有少量存在。HBV基因型不僅與病毒復制程度、肝細胞損傷、肝炎病程有關，而且直接影響到治療過程、療效等。研究HBV基因型對了解病毒感染后形成的不同臨床表現(xiàn)，以及抗病毒藥物的治療效果具有重要的意義[10]。我國是HBV高感染HB高發(fā)病地區(qū)，文獻報道我國大眾人群HBsAg陽性率的修正數(shù)據(jù)為7.18%，以B和C基因型為主[11]。揚州市地處江蘇中部，長江北岸，HBV流行較為嚴重，但HBV的主流基因型、病毒載量與基因型之間是否存在關系以及不同基因型混合感染情況未見報道。

1 材料與方法

1.1 樣本來源樣本來自本中心臨床門診2015年10月至2016年9月的乙肝病毒核酸定量（HBV DNA）檢測的標本，血清采樣管采血，3000r/min離心，按試劑盒說明書進行實時熒光定量檢測。取典型的熒光擴增曲線，單位換算后大于1000copies/ml的樣品共278份，－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器HBV DNA熒光定量PCR：艾肯生物技術有限公司（杭州）；Viral Nucleic Acid Isolation Kit：碩世生物科技有限公司；S區(qū)A－D引物：上海生工生物有限公司；TaKaRa Ex Taq(Hot Start Version)：寶生物工程（大連）有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司；普通PCR儀和電泳儀，美國BIO－RAD公司；GelDoc－It Imaging System，UVP公司。

1.3 研究方法將凍存血清室溫融化后，3000r/min離心，根據(jù)實時熒光測定結果按103－108copies/ml分6組，按操作程序提取HBV DNA；對低病毒載量的標本，核酸提取時加大標本量，增加提取液中樣本核酸含量和mPCR的陽性率。擴增后瓊脂糖凝膠電泳成像判讀HBV基因型。

1.4 多重引物PCR(multiplex PCR，mPCR)根據(jù)HBV的基因特性和地域特性，考慮滿足本地病毒基因型種類的要求，研究采用的mPCR引物共四對（表1），分別為基因A－D型，引物位于HBV基因組的S區(qū)[12]。擴增體系25μl，擴增條件：95℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，35個循環(huán)；72℃，10min。

1.5 統(tǒng)計分析按HBV的病毒載量自然分層，即103～108分成6組，計算各組分基因B型和C型的百分數(shù)，采用同一基因型在各組中的例數(shù)分別進行B型和C型線性趨勢χ2檢驗[13]，分析HBV不同基因型是否隨著病毒載量的變化而出現(xiàn)比例上升或下降的趨勢。

2 結果

2.1 將樣本核酸進行HBV DNA S區(qū)片段mPCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段長度與目的基因片段長度對照確定基因型（圖1、圖2）。

2.2 樣本經(jīng)mPCR分析后，陽性結果253例，陽性檢出率91.0%。其中HBV B基因型184例，占65.8%，C基因型60例，占21.6%，B型和C型混合感染9例，占3.2%，未檢出A、D基因型。B基因型和C基因型在各組中例數(shù)進行線性趨勢χ2檢驗，顯示存在統(tǒng)計學意義，說明隨著血液中HBV載量的升高，出現(xiàn)B基因型比例下降，C基因型比例上升的趨勢（表2）。

表1 A-D基因型正反向引物核甘酸序列

表2 6組HBV基因型的檢測結果

3 討論

乙型肝炎病毒載量與病毒基因型之間關系的研究已很多，但運用線性趨勢χ2檢驗研究HBV載量與一種基因型不同組別間比例關系還未見報道，本次研究發(fā)現(xiàn)隨HBV載量的增加，B和C基因型間出現(xiàn)相反的變化趨勢，存在統(tǒng)計學意義?；駼型在低載量組為主流基因型，在高病毒載量組中基因B和C型所占比例區(qū)別不大，經(jīng)檢驗無統(tǒng)計學意義，說明基因C型在體內(nèi)主要以強復制狀態(tài)出現(xiàn)。由于病毒復制與肝細胞損傷有密切關聯(lián)，目前主要觀點認為，乙型肝炎的病理損傷是由于病毒復制過程中機體的免疫反應引起，病毒載量越高，所產(chǎn)生的免疫反應越強，引起肝損傷越嚴重。溫先勇[14]從乙肝患者的自身免疫角度研究了免疫損傷的機制，發(fā)現(xiàn)HBV DNA載量與自身免疫間有某種關聯(lián)。Lindh觀點認為C基因型易產(chǎn)生核心基因啟動子（BCP）的熱點突變，產(chǎn)生嚴重的肝臟炎癥、肝纖維化和進展性肝損害[15]。因此，感染基因C型HBV對肝的傷害較大?！堵砸倚透窝追乐沃改稀穂16]指出HBV DNA大于105(copies/ml)要進行抗病毒治療，且易產(chǎn)生嚴重肝臟疾病、進展為慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。隨病毒載量增高，C型百分比越大，造成肝的危害越大。

線性趨勢χ2檢驗是按自然順序的等級分層或連續(xù)變量等級化后再分層的情況下分析率隨該分層因素變化的趨勢，較一般卡方檢驗比較各組率之間的差異具整體性，本實驗是按HBV DNA拷貝數(shù)自然等級分層，檢驗后能觀察到不同基因型在分層上率的變化趨勢。

HBV基因型有地域分布差異，不同的基因在體內(nèi)復制水平也不同。本研究B基因型72.7%，超過C型的23.7%，未檢出A、D基因型，說明揚州市的HBV感染基因型譜較窄，符合中國南方HBV感染以基因B型為主的地域范圍；B型和C型混合感染的比率3.6%低于其他研究；基因C型占比不高，但基因C型中的96.7%處于高拷貝組，應引起感染者和臨床醫(yī)生的重視。有9.0%樣本未檢出，不存在血清HBV DNA載量小的原因，可能是保存過程中標本受損、血清在服藥后取得、或為非A-D基因型，有待進一步確定。

圖1 mPCR凝膠電泳

圖2 mPCR凝膠電泳

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The identification of hepatitis B virus genotypes in Yangzhou city

TANG Yang，CAO Yan，YANG Likun，XIAO Yuesheng.Yangzhou Center for Clinical Laboratory，Jiangsu Yangzhou 225001，China.

Objective To analyze the relationship between hepatitis B virus genotypes and the viral load in Yangzhou city. Methods 103-108ranks were divided into 6 groups according to the quantity of the grades of serum virus copy in 244 patients with hepatitis B from Yangzhou，Cochran Armitage trend test was carried out for multiple PCR(multiplex PCR，mPCR)according to the quantity of cases of different genotypes in each group and the trend of change was analyzed with the increased proportion of virus genotypes in each group increasing.Results The cases of genotype B were 244 in all samples and that of genotype C were 60，mixed genotype B and C were 9.Therefore Cochran Armitage trend test has statistical significance.Conclusion Hepatitis B virus infection are mainly B and C genotype in Yangzhou；A and D genotype are not tested；B genotype infection rates are higher than C genotype infection；with the increasing of viral load，percentage of B genotype is declining and C genotype is rise.

Hepatitis B Virus；Genotype；Cochran Armitage trend test

R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0036-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.010

2016-05-25；

2016-11-30)

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目。編號：LZ13199

唐陽，女，1988年生，本科，技師，專業(yè)方向：醫(yī)學檢驗。

肖越勝，男，1965年生，主任技師，研究方向：疾病控制與微生物檢驗。Email：xys_109@163.com