吳高松，匡海學(xué)，王知斌，楊炳友，劉華，孟永海，姜海，王振月

分析測試

RP-HPLC法同時(shí)測定刺五加葉中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量*

吳高松，匡海學(xué)，王知斌，楊炳友，劉華，孟永海，姜海，王振月*

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040）

目的：建立反相高效液相紫外法同時(shí)測定刺五加葉中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量測定方法。方法：采用Diamasil C18色譜柱（200×4.6mm,5μm），以乙腈-0.3%磷酸水為流動(dòng)相，流速為1mL·min-1，檢測波長為360nm，柱溫為30℃。結(jié)果：在40min內(nèi)，刺五加葉中3個(gè)成分（蘆丁、金絲桃苷、槲皮素）完全分離，峰面積的對(duì)數(shù)與進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.9995～0.9999）；平均加樣回收率在95.4%～99.7%，RSD為2.3%～3.3%。結(jié)論：該方法簡便、迅速、可靠，適用于刺五加葉中黃酮類成分的含量測定。

刺五加葉；HPLC；含量測定

刺五加Acanthopanax senticocus（Rupr.et Maxim.）Harms為五加科五加屬植物[1]。又名五加參，為五加屬多年生落葉灌木。刺五加主要分布在東三省地區(qū)，在河北、山西也有分布，為五加屬的藥食兩用植物，其嫩莖既是遼東人們習(xí)食的最佳山野菜之一，又是新型的保健性食品的極好原料，同時(shí)刺五加具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞等作用，此外還可以治療心腦血管疾病、神經(jīng)衰落、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[2，[4-8]。但是尚未見對(duì)蘆丁、金絲桃苷、槲皮素3種成分同時(shí)測定的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立了同時(shí)測定刺五加葉中上述3中成分的HPLC-UV法，實(shí)驗(yàn)表明該方法簡便快捷，分離度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與材料

Waters 2695型高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，waters 2998紫外檢測器、Empower工作站）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

HPLC流動(dòng)相乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為哇哈哈純凈水（杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司）；其余試劑均為分析；對(duì)照品蘆?。ɑ衔?）、金絲桃苷（化合物2）、槲皮素（化合物3）均為中國藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，采用面積歸一化法測定，含量均≥98%；刺五加葉分別采集于黑龍江省哈爾濱阿城區(qū)等6個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為刺五加A.senticocus（Rupr.et Maxim.）Harms的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇定容，配成每1mL含1.130mg蘆丁、1.241mg金絲桃苷、0.974mg槲皮素的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液精確稱取10g刺五加葉，粉碎，置于250mL錐形瓶中，加入100mL甲醇超聲（功率250W，頻率50kHz）處理40min，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2 色譜條件

采用Diamasil C18色譜柱（200×4.6mm,5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以0.3%的磷酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫條件見表1，檢測波長：360nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。在上述條件下，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的色譜峰達(dá)到較為理想的分離效果，理論塔板數(shù)按被測成分色譜峰計(jì)算均不不低于3000。對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

表1 刺五加葉含量測定流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab.1Gradient elution and mobile phase conditions of Acanthopanax senticosus leaves

圖1 對(duì)照品與樣品的HPLC色譜圖Fig.1HPLC chromatograms of reference substance（A）and sample（B）

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、2、4、6、8、10mL分別置于10mL容量瓶中，定容至刻度，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)計(jì)算回歸方程?；衔?～3的回歸方程分別為Y=1.541X-4.741（r=0.9995），線性范圍0.3912～7.514 μg·mL-1；Y=1.378X-2.019（r=0.9996），線性范圍0.1101～2.270 μg·mL-1；Y=1.754X-3.244（r=0.9999），線性范圍0.4004～3.360μg·mL-1。

2.4 儀器精密度考察

取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，化合物1～3的峰面積RSD分別為0.46%、1.6%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性考察

取刺五加葉藥材粉末1.0 g·份-1，6份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，測得樣品中化合物1～3的RSD分別為1.2%、1.9%、2.6%。各RSD＜3%，表明該方法重復(fù)性好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12h按照上述色譜條件進(jìn)樣測定，化合物1～3的峰面積RSD分別為0.82%、0.79%、0.98%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已經(jīng)含量的樣品0.5g，共6份，分別精密加入低、中、高3個(gè)加入量的對(duì)照品儲(chǔ)備液（每個(gè)加入量3份），按照“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，然后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果化合物1～3的平均加樣回收率分別為97.9%（RSD =2.9%）、95.4%（RSD=3.3%）、99.7%（RSD=2.3%）。表示該提取方法準(zhǔn)確度較好，基本符合試驗(yàn)要求。

2.8 樣品含量測定

取刺五加葉樣品，按上述方法進(jìn)行測定，由回歸方程計(jì)算樣品中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量。結(jié)果見表2。

表2 不同采集地地刺五加葉中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量（mg·g-1,n=3）Tab.2Contents of hyperin,rutin and quercetin in Acanthopanax senticosus leaves from different origins

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

在本實(shí)驗(yàn)分別考察了超聲提取、回流提取的提取效率，結(jié)果回流提取和超聲提取效率相差不大，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)考察后故最后選擇簡單的超聲提取，同時(shí)又比較了不同比例的甲醇、乙醇的提取效果及超聲不同時(shí)間的效果，結(jié)果表明以甲醇提取優(yōu)于乙醇提取，其中純甲醇提取40min的效果最佳。

3.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.3% H3PO4水等流動(dòng)相系統(tǒng)，綜合考慮，選擇乙腈-0.3%磷酸水梯度洗脫最佳，所得峰形對(duì)稱且分離度適宜，柱后處理簡便，省時(shí)，同時(shí)可以減少背景噪音干擾，提高檢測靈敏度，由于水相中加入H3PO4基線平緩，所以選擇加入H3PO4，且加入0.3%的H3PO4，相鄰色譜峰均達(dá)到基線分離。

3.3 檢測波長的選擇

在190～400nm對(duì)蘆丁、金絲桃苷、槲皮素進(jìn)行紫外吸收掃描，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷均在258nm、360nm處有最大吸收，槲皮素在210、360nm處有最大吸收360nm處有最大吸收，為了兼顧所有化合物同時(shí)測定，增加檢測靈敏度，故選擇360nm作為檢測波長。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)刺五加葉中的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素3種成分的含量同時(shí)進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)表明該方法簡便快捷，重復(fù)性及分離度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為刺五加中上述成分的測定提供了一定的依據(jù)。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.206.

［2］劉鳳華.短梗五加的利用價(jià)值及市場開發(fā)前景［J］.生物學(xué)通報(bào),2007,42（06）:14-15.

［3］董文婷,霍金海,張海燕,等.刺五加葉的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21（23）:220-223.

［4］姜文紅,劉靜,仲昭慶,等.HPLC法同時(shí)測定刺五加浸膏中3種有效成分的含量［J］.藥物分析雜志,2010,30（06）:1145-1147.

［5］張海豐,孫健,滕坤,等.HPLC法同時(shí)測定刺五加果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.中國藥物警戒,2010,7（12）:708-710.

［6］朱燕燕,尉小慧,吳弢,等.HPLC-PAD測定刺五加中刺五加苷B與刺五加苷E的含量［J］.中國藥學(xué)雜志,2011,46（16）: 1280-1282.

［7］鄒盛勤,黃玉倫.HPLC法測定刺五加中兩種三萜酸成分的含量［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,30（3）:290-292.

［8］姚慧敏,關(guān)穎麗,朱俊義,等.HPLC-UV法測定野生刺五加果實(shí)中6種成分的含量［J］.藥物分析雜志,2015,35（10）:1825-1828.

Simultaneous determination of rutin,hyperin and quercetin in Acanthopanax senticocus leaves by RP-HPLC*

WU Gao-song,KUANG Hai-xue,WANG Zhi-bin,YANG Bing-you,LIU Hua,MENG Yong-hai, JIANG Hai,WANG Zhen-yue*
（Key Laboratory of Chinese Materia Medica（Ministry of Education）,Heilongjang Key Laboratory of TCM Pharmacodynamic Material Bases,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China）

Objective:To establish a reversed phase high performance liquid chromatography with ultro violet detector（RP-HPLC-UV）method for the simultaneous determination of three compounds in A.senticocus leaves.Methods:The Diamonsil C18column（250 mm×4.6 mm,5μm）was used for separated and analysis using gradient elution with a mobile phase of acetonitrile as solvent A and 0.3%（v/v）phosphoric acid in water as solvent B,the flow rate was 1.0 mL·min-1,detection wavelength was 360 nm and the column temperature was maintained at 30℃.Results:The three compounds（rutin,hyperin,quercetin）were completely separated within 40 min.The regression equation showed good liner relationship between logarithm of the peak area and logarithm of the content of each compound（r=0.9995-0.9999）.the average recoveries was 96.7%～99.1%and RSD was 2.3%～3.3%.Conclusion:The method is simple,fast and reliable,which can be used to determine the contents of three compounds in A.senticocus leaves.

acanthopanax senticocus;HPLC;determination

R284

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170232

2016-11-22

十三·五國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（No.2016YFC0500303）-東北森林區(qū)道地林藥資源生態(tài)開發(fā)利用技術(shù)與示范

吳高松（1989-），男，在讀碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

王振月（1956-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥資源與開發(fā)研究。