陳 瑛，寧 楊，黃 磊，李 莉，王玉蘭，李 瑞，田 訓，李賀梅，張慶華

(華中科技大學附屬武漢中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014)

·技術(shù)與方法·

10058-F4誘導宮頸癌CaSki細胞凋亡及其機制探索*

陳 瑛，寧 楊，黃 磊，李 莉，王玉蘭，李 瑞，田 訓，李賀梅，張慶華△

(華中科技大學附屬武漢中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014)

目的 探討10058-F4誘導宮頸癌CaSki細胞凋亡的現(xiàn)象及機制。方法 用CCK8的方法檢測不同濃度的10058-F4和10058-F4作用不同時間對CaSki細胞生長的影響；流式細胞術(shù)檢測10058-F4對CaSki凋亡率的影響；Western blot方法檢測10058-F4的藥物有效性(c-MYC的表達下調(diào))及對CaSki細胞的凋亡誘導作用；Western blot和RT-PCR的方法檢測線粒體蛋白的表達情況，流式細胞術(shù)檢測細胞ROS產(chǎn)生。結(jié)果 通過CCK8實驗檢測出10058-F4對CaSki的增殖抑制具有時間依賴性和濃度依賴性，始于第48小時，IC50為122 μmmol/L。用122 μmmol/L的10058-F4處理CaSki細胞48 h，通過流式細胞術(shù)檢測凋亡發(fā)現(xiàn)處理組細胞出現(xiàn)明顯凋亡(52%)，同時Western blot檢測發(fā)現(xiàn)剪切型PARP表達量上調(diào)。Western blot 和RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)122 μmmol/L的10058-F4處理CaSki細胞48 h可以明顯降低線粒體氧化磷酸化蛋白(NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COXIV、OSCP)的表達，引起線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生明顯增高，從而誘導細胞凋亡。結(jié)論 10058-F4可以通過降低線粒體氧化磷酸化蛋白的表達引起ROS產(chǎn)生來誘導CaSki細胞凋亡。

宮頸腫瘤;細胞凋亡;線粒體;活性氧;10058-F4

宮頸癌是當今世界上影響婦女健康最常見的腫瘤之一?，F(xiàn)在惡性腫瘤的治療手段有手術(shù)治療、化療、放療和分子靶向藥物，而手術(shù)治療和化療為治療宮頸癌的常用手段。現(xiàn)已有報道證實在多數(shù)宮頸癌病例中存在c-MYC基因高表達的情況且在宮頸癌病情進展中起著重要的作用[1]。作為c-MYC基因的一種小分子靶向抑制劑，10058-F4已經(jīng)被認作是治療多種腫瘤的分子靶向藥物[2-4]。但是10058-F4對宮頸癌的治療效果卻鮮有報道。本研究擬觀察10058-F4對宮頸癌細胞CaSki的殺傷作用,并初步探討10058-F4誘導CaSki細胞凋亡的作用機制，為以后宮頸癌新化療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和培養(yǎng)條件 CaSki細胞株來自美國細胞典藏中心(ATCC)，培養(yǎng)基為DMEM (Gibico公司)添加10%四季青胎牛血清，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗材料 10058-F4(中國Selleck公司),CCK8(日本的Dojindo公司)，凋亡試劑盒(美國BD公司)，TRIzol試劑盒(美國Life公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo)，蛋白裂解液RIPA(碧云天)，抗體c-MYC、GADPH 、NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COX Ⅳ、OSCP(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、PARP(美國Abcam公司)。線粒體活性率(ROS)染料(美國Life公司)。

1.3 CCK8實驗 10058-F4時間依賴實驗：取對數(shù)增長期的CaSki細胞，消化接種到96孔板(4 000個/孔)，12 h后分別加入二甲基亞砜(DMSO)和100 μmol/L(共100 μL)的10058-F4(每組4個復孔)。在24、36、48、60、72 h后加入10 μL CCK8,37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，450 nm波長條件下讀取吸光度(A)值。10058-F4濃度依賴實驗：取對數(shù)增長期的CaSki細胞，消化接種到96孔板(4 000個/孔)，12 h后分別加入 10、25、 50、100、200、 400 μmmol/L的10058-F4和等體積的DMSO,48 h后加入10 μL CCK8,37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，450 nm波長條件下讀取A值。

1.4 流式細胞術(shù)檢測凋亡 取處于對數(shù)增長期的CaSki細胞，消化接種到六孔板，待細胞融合度為50%左右時，加入122 μmmol/L的10058-F4和相同體積的DMSO，48 h后收取兩組細胞，用PBS洗滌1次，800 r/min離心5 min。棄上清，每管加入300 μL的1×Binding Buffer 懸浮細胞。加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，再加入5 μL的碘化丙啶(PI)染色5 min后上機以未加10058-FA細胞作為對照組。

1.5 Western blot檢測10058-F4處理細胞后的蛋白水平變化 取對數(shù)增長期的CaSki細胞，消化接種到六孔板，待細胞融合度為50%左右時，加入122 μmol/L的10058-F4和相同體積的DMSO，48 h后收取兩組細胞。每組加入60 μL RIPA蛋白裂解液，冰浴10 min，超聲充分裂解細胞，12 000×g離心10 min，取上清液。每組取1 μL 用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度。在蛋白上清中加入5 ×的含還原劑的蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min充分變性。取60 μg的蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2 h。用濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氯乙烯(PVDF)膜上，5%牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉10 min。一抗于4 ℃中孵育過夜。第2天用ECL顯色。

1.6 實時熒光定量檢測10058-F4處理細胞后的線粒體蛋白mRNA水平變化 按TRIzol試劑盒的說明書提取總RNA,取1 μg總RNA按照Toyobo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄(條件 42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min)。實時熒光定量PCR體系：1 μL cDNA,10 μL Mix (DBI),1 μL 引物(上游引物0.5 μL,下游引物 0.5 μL),8 μL 水。以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下。見表1。

表1 引物序列

1.7 流式細胞術(shù)檢測線粒體ROS產(chǎn)生 將Life公司的MitoSOX 加入培養(yǎng)基中37 ℃孵育細胞10 min后收取細胞，800 r/min離心，冰PBS洗滌1次，800 r/min離心再用冰PBS重懸細胞，上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1 10058-F4對宮頸癌CaSki細胞的作用具有時間依賴性和濃度依賴性 CCK8檢測顯示，100 μmol/L的10058-F4作用24、36、48、60、72 h對CaSki細胞的存活率分別為96.4%、91.9%、91.1%、73.7%、48.5%、34.6%，見圖1A。說明10058-F4作用細胞48 h的時候開始對細胞有明顯的生長存活，并具有時間依賴性。10、25、50、100、200、400 μmol/L的10058-F4處理48 h后對CaSki細胞進行CCK8檢測顯示，生長抑制率分別為91.7%、83.7%、84.9%、55.4%、33.3%、32.0%，見圖1B。通過SPSS軟件計算，作用48 h 10058-F4的IC50為122 μmol/L。同時表明,10058-F4對宮頸癌CaSki細胞的作用具有濃度依賴性。

A：時間依賴；B：濃度值依賴；以未加10058-FA細胞作為對照組。

圖1 CCK8實驗用來檢測10058-F4

對CaSki細胞增殖的影響

2.2 10058-F4可以誘導宮頸癌CaSki細胞凋亡 用122 μmmol/L的10058-F4作用CaSki細胞48 h后，白光顯微鏡下可以觀察到細胞開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，見圖2A，流式細胞術(shù)檢測顯示10058-F4組較對照組細胞出現(xiàn)明顯凋亡(凋亡率為52%)，見圖2B。同時Western blot實驗顯示處理組細胞的c-MYC表達受抑制的同時PARP表達量明顯升高，見圖2C。流式細胞術(shù)和Western blot兩個實驗同時說明10058-F4能夠明顯誘導CaSki細胞凋亡。

A：白光顯微鏡(×10)；B：流式細胞術(shù)；C：Western blot。

圖2 10058-F4可以誘導CaSki細胞發(fā)生明顯凋亡

A：Western blot圖；B:PCR分析圖；C：對照組流式細胞術(shù)；D：10058-F4組流式細胞術(shù)。

圖3 10058-F4降低了線粒體氧化磷酸化蛋白的

表達并引起線粒體活性氧簇增多

2.3 10058-F4明顯抑制線粒體氧化呼吸鏈組分的表達 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，10058-F4可以降低NDIFS1(線粒體復合體一組分)、SDHA(線粒體復合體二組分)、UQCRC2(線粒體復合體三組分)、COX Ⅳ(線粒體復合體四組分)、OSCP(線粒體復合體五組分)的蛋白表達(P<0.05)，見圖3A。實時熒光定量PCR表明NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COX Ⅳ、OSCPmRNA水平也明顯較對照組低(P<0.05)，見圖3B。證明10058-F4可以抑制線粒體氧化呼吸鏈蛋白的轉(zhuǎn)錄從而降低氧化呼吸鏈蛋白的表達水平。

2.4 10058-F4明顯誘導CaSki細胞線粒體ROS產(chǎn)生 122 μmmol/L的10058-F4處理細胞48 h后能夠明顯增高CaSki細胞線粒體ROS的產(chǎn)量，對照組ROS產(chǎn)生量為56.21，10058-F4組ROS產(chǎn)生量為519.46，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3C。

3 討 論

很多宮頸癌患者在就診時已失去最佳手術(shù)時機，改善這部分患者的手段目前主要包括系統(tǒng)性化療、放療、分子靶向治療[5]，以及近年來取得進展的免疫靶向治療。c-MYC在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了促進作用[6]，并且宮頸癌普遍存在c-MYC基因拷貝數(shù)的增高[7]。有文獻報道,宮頸癌組織中c-MYC的表達量較正常組織明顯升高[8]。而宮頸癌現(xiàn)在仍是威脅人類健康的惡性難治愈的疾病，近四十年發(fā)病率仍逐年上升。而c-MYC也是腫瘤治療的一個新靶點[9]。所以探尋宮頸癌新的治療方式仍然是目前科研工作者關(guān)注的重要方面。為尋找并證明10058-F4成為針對宮頸癌的治療藥物的可能性，筆者進行了相關(guān)的實驗。

首先通過CCK8實驗，確定了10058-F4對CaSki細胞的生長抑制具有時間依賴性和濃度依賴性，并且作用48 h 10058-F4的IC50為122 μmmol/L。藥物對腫瘤細胞造成生長抑制的原因有兩個：(1)抑制細胞通過有絲分裂進行增殖；(2)對腫瘤細胞進行殺傷，也就是誘導細胞凋亡。后續(xù)的流式細胞術(shù)檢測凋亡的實驗證實10058-F4對CaSki細胞的作用機制主要是誘導細胞凋亡。這一結(jié)果也通過Western blot進行了佐證。

目前關(guān)于c-MYC抑制劑誘導腫瘤細胞凋亡主要是通過抑制Bcl-2的表達同時促進Bax的表達[2,10]。本文發(fā)現(xiàn)并確認10058-F4能夠降低線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白的表達。在用122 μmmol/L的10058-F4處理CaSki細胞48 h后，線粒體氧化磷酸化復合體一、二、三、四、五的組成成分NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COX IV、OSCP在mRNA水平和蛋白水平都有明顯下降。線粒體氧化呼吸鏈除了是產(chǎn)生ATP提供能量的主要場所以外，還是清除超氧化物的場所[11-12]。因此，本研究進一步檢測發(fā)現(xiàn)10058-F4處理CaSki細胞48 h后線粒體ROS產(chǎn)生明顯增多。已經(jīng)有多篇文獻證明ROS產(chǎn)生增多可以促進細胞凋亡[6,13]。

本文認為，10058-F4抑制降低線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白的表達，增加線粒體ROS產(chǎn)生，進而誘導細胞凋亡。目前越來越多的文獻證實腫瘤細胞中線粒體的量和功能活躍，并給腫瘤細胞增殖提供原材料[14]。本文中的細胞實驗從10058-F4抑制線粒體功能的角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)10058-F4誘導宮頸癌細胞凋亡的機制，為以后10058-F4成為治療宮頸癌的化療藥物提供理論依據(jù)。本實驗結(jié)果為探尋宮頸癌新治療方案提供了理論依據(jù)。

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10058-F4 could cause cervical cancer cells apoptosis*

ChenYing,NingYang,HuangLei,LiLi,WangYulan,LiRui,TianXun,LiHemei,ZhangQinghua△

(DepartmentofGynaecologyandObstetrics,WuhanCentralHospitalAffiliatedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hebei430014,China)

Objective To explore the role and mechanism of 10058-F4 on cervical cancer SaSki cells in the apoptosis.Methods The CCK8 assay was used to confirmed 10058-F4 inhibited the proliferation of CaSki cells in a dose-dependent and time dependent manner.Cell apoptosis and the ROS production was analyzed by flow cytometry.The mRNA and protein levels after cells treated with 10058-F4 were detected by real time PCR and Western blot.Results 10058-F4,an inhibitor of c-MYC,could inhibit the proliferation of CaSki cells in a dose-dependent and time dependent manner.Cells grow much slower after treated with 10058-F4 for 48 h,and IC50was 122 μmmol/L.In addition,cells which were treated with 10058-F4 for 48 h show apparent apoptosis and the level of cleaved-PARP confirm that.We also found that 10058-F4 reduced the expression levels of NDUFS1,SDHA,UQCRC2,COXIV and OSCP and caused excess production of ROS.Conclusion 10058-F4 leads to the decreased expression level of mitochondrial complexes,increased production of ROS,then induce apoptosis.

uterine cervical neoplasms; apoptosis; mitochondria; reactive Oxygen species; 10058-F4

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.024

武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學科研項目資助(WX11B05)。

陳瑛(1979-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科研究?！?/p>

，E-mail:zhangqh66@qq.com。

R737.33

A

1671-8348(2017)06-0796-03

2016-10-01

2016-11-29)