李曉波，徐 芳

(山東省滕州市棗莊科技職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)系 277500)

論著·基礎(chǔ)研究

姜黃素通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的放射敏感性

李曉波，徐 芳

(山東省滕州市棗莊科技職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)系 277500)

目的 探討姜黃素聯(lián)合放射治療對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞的活性及肺癌小鼠放射敏感性的影響。方法 把肺癌NCI-H460細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組、姜黃素組、γ射線(xiàn)組及γ射線(xiàn)照射與姜黃素的聯(lián)合組；然后對(duì)各組分別應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin-V/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)，RT-PCR 檢測(cè)核因子κB(NF-κB)基因表達(dá)情況。另外，建立小鼠肺癌模型同樣分為對(duì)應(yīng)的4組,姜黃素按照1 mg/kg經(jīng)尾靜脈注射于小鼠,腫瘤局部進(jìn)行劑量為5 Gy射線(xiàn)照射,處理28 d后，比較不同處理組小鼠瘤體體積。結(jié)果 與空白對(duì)照組、姜黃素組和γ射線(xiàn)組比較，聯(lián)合組NCI-H460增殖率明顯降低(P<0.05)，凋亡率明顯增加(P<0.05)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增高(P<0.05)，NF-κB mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，并且腫瘤的體積有明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 姜黃素可通過(guò)抑制γ射線(xiàn)處理?xiàng)l件下NF-κB的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞的G2/M期阻滯來(lái)增強(qiáng)肺癌NCI-H460細(xì)胞對(duì)γ射線(xiàn)的敏感性。

姜黃素；γ射線(xiàn)；細(xì)胞增殖；NF-κB;輻射耐受性

目前我國(guó)約有70%以上的腫瘤患者需要放療，并且對(duì)于許多肺瘤患者而言，放療是可用的治療方法之一[1]。但肺瘤患者往往在放療過(guò)程中出現(xiàn)抵抗，從而導(dǎo)致治療效果不理想[2-3]。因此，如何提高肺癌的放療敏感性，改善患者生活質(zhì)量是目前急需解決的問(wèn)題。

姜黃素(curcumin)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥姜黃的主要活性成分。其主要成分包括多種調(diào)控生長(zhǎng)因子，趨化因子及轉(zhuǎn)錄因子等，因此具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂等多方面生物功能[4]。研究顯示，姜黃素可抑制體內(nèi)、外腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，是一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌新藥[5]。體外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)抑制(NF-κB)信號(hào)通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[6-8]。但姜黃素能否增強(qiáng)肺癌的放療敏感性，目前還不清楚。本研究選用肺癌NCI-H460細(xì)胞系為研究對(duì)象，研究姜黃素對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞放療敏感性的影響，為探索肺癌治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源 小鼠Lewis肺癌瘤系,購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。C57BL/6純系小鼠，雄性，鼠齡4～6周，體質(zhì)量16～22 kg，購(gòu)自北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 姜黃素(上海同田生物技術(shù)公司)， RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，青霉素鈉和鏈霉素(華北制藥有限責(zé)任公司)，噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司)，二乙基亞硝胺(天津化學(xué)試劑研究所)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，抗體Bcl-2、Bax(Cell Signal公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)，Spectra MR型酶標(biāo)儀(美國(guó)Dynex公司)。

1.2 方法

1.2.1 NCI-H460細(xì)胞的γ射線(xiàn)照射條件 在室溫下采用60 Co γ 射線(xiàn)全身一次性照射，吸收劑量率1.701 Gy/min，一次性給予NCI-H460細(xì)胞5 Gy的吸收劑量。

1.2.2 NCI-H460的培養(yǎng)及傳代 采用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，按比例傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)取生長(zhǎng)狀況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、γ射線(xiàn)組(5 Gy)、姜黃素組(10 μmol/L)和γ射線(xiàn)聯(lián)合姜黃素的聯(lián)合組(5 Gy射線(xiàn)聯(lián)合10 μmol/L姜黃素)。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×104個(gè)/mL，接種于48孔培養(yǎng)板中，按照試驗(yàn)分組采用10 μmol/L姜黃素及5 Gy γ射線(xiàn)分別處理48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入50 μL MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加200 μL DMSO，使甲瓚結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀以參考波長(zhǎng)630 nm，測(cè)量波長(zhǎng)490 nm處的各孔的吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。計(jì)算公式為細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用PI和Annexin V染色的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中。根據(jù)分組加入10 μmol/L姜黃素及5 Gy γ射線(xiàn)分別處理48 h。收集細(xì)胞及其上清液，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用預(yù)冷PBS將沉淀細(xì)胞清洗3遍，然后加入500 μL的 Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)15 min；1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FITC陽(yáng)性代表細(xì)胞凋亡發(fā)生，PI陽(yáng)性代表細(xì)胞死亡。

1.2.5 細(xì)胞凋亡蛋白分析實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。取上述收集的細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組加入姜黃素及γ射線(xiàn)處理48 h后收集細(xì)胞。提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。半干轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉1 h；分別加入一抗Bcl-2(1∶500)和Bax(1∶500)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；洗膜液清洗3次(每次10 min)，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育3 h；洗膜液清洗3次(每次10 min)，用ECL發(fā)光顯色后在X射線(xiàn)洗片機(jī)(HQ 320XT)上曝光檢測(cè)，采用Quantity-One 4.6.2軟件進(jìn)行圖像分析，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn) 按照上述分組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460細(xì)胞，接種于6孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組加入姜黃素及γ射線(xiàn)分別處理48 h后，收集細(xì)胞。用70%冰乙醇懸浮，吹打均勻，4 ℃放置12 h，PBS洗滌去乙醇，加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入RNaseA至終濃度100 μg/mL，37 ℃ 溫浴30 min。加入PI至終濃度50 μg/mL室溫孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.7 mRNA表達(dá)水平的分析 采用RT-PCR檢測(cè)NF-κB mRNA表達(dá)水平,按照上述分組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460細(xì)胞，接種于6孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組加入姜黃素及γ射線(xiàn)處理48 h，收集細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA模板。采用RT-PCR分析NF-κB mRNA表達(dá)水平的變化。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s；72 ℃ 8 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，0.5%溴化乙錠(EB)染色后，凝膠成像儀觀察圖像，分析各組間mRNA表達(dá)水平的差異。

1.2.8 C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型建立及體內(nèi)給藥、獲取標(biāo)本 將小鼠Lewis肺癌瘤系制備成單細(xì)胞懸液，在小鼠右后肢皮下接種瘤細(xì)胞懸液，1×107個(gè)/只。將40只荷瘤小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，分為空白對(duì)照組、γ射線(xiàn)組(5 Gy)、姜黃素組(1 mg/kg)和γ射線(xiàn)聯(lián)合姜黃素的聯(lián)合組(5 Gyγ射線(xiàn)聯(lián)合1 mg/kg姜黃素)。姜黃素按照1 mg/kg經(jīng)尾靜脈注射于小鼠,腫瘤局部進(jìn)行照射，照射劑量為15 Gy,治療后28 d，分別將小鼠處死獲取腫瘤組織，標(biāo)本凍存于-20 ℃冰箱。用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組小鼠腫瘤長(zhǎng)徑(a)及短徑(b)，計(jì)算腫瘤平均體積。腫瘤體積計(jì)算公式：腫瘤體積(mm3)=a×b2/2。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法測(cè)定姜黃素與γ射線(xiàn)對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的影響 從圖1可以看出，空白對(duì)照組NCI-H460細(xì)胞增殖活躍，而經(jīng)過(guò)10 μmol/L姜黃素、5 Gy的γ射線(xiàn)或γ射線(xiàn)聯(lián)合姜黃素處理48 h后姜黃素組，γ射線(xiàn)組，聯(lián)合組，細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制，其中聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞增殖活性抑制最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

a:P<0.05，與其余各組比較。

圖1 姜黃素和γ射線(xiàn)對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γ射線(xiàn)與姜黃素對(duì)NCI-H460細(xì)胞凋亡率的影響 與空白對(duì)照組[(2.29±0.08)%]相比，γ射線(xiàn)組[(2.29±0.73)%]或姜黃素組[(2.41±0.59)%]細(xì)胞凋亡率有輕微增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而聯(lián)合組[(215.21±0.32)%]明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 γ射線(xiàn)與姜黃素對(duì)NCI-H460細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果表明，γ射線(xiàn)組或姜黃素組G2/M期細(xì)胞增多，但與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而聯(lián)合組與對(duì)照相比較則可明顯提高G2/M期細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 姜黃素和γ射線(xiàn)對(duì)NCI-H460 細(xì)胞周期的影響

a:P<0.05,與其余各組比較。

2.4 γ射線(xiàn)與姜黃素對(duì)NCI-H460細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，聯(lián)合組NCI-H460細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而γ射線(xiàn)和姜黃素單獨(dú)處理則對(duì)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖2。

A：Bcl-2蛋白表達(dá)；B：Bax蛋白表達(dá)；1：空白對(duì)照組；2：聯(lián)合組；3：姜黃素組；4：γ 射線(xiàn)組。

圖2 姜黃素和γ射線(xiàn)對(duì)NCI-H460細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5 γ射線(xiàn)與姜黃素對(duì)NCI-H460細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，聯(lián)合組NCI-H460細(xì)胞NF-κB mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而γ射線(xiàn)或姜黃素單獨(dú)處理對(duì)NF-κB的表達(dá)無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，與其余各組比較。

圖3 姜黃素和γ射線(xiàn)對(duì)NCI-H460細(xì)胞NF-κB mRNA表達(dá)的影響

2.6 γ射線(xiàn)與姜黃素對(duì)肺癌小鼠腫瘤體積的影響 C57BL/6小鼠經(jīng)過(guò)接種肺癌腫瘤細(xì)胞兩周后腫瘤直徑增至5～8 mm時(shí)，根據(jù)分組，對(duì)小鼠進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的治療，與空白對(duì)照組相比，聯(lián)合組明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，與其余各組比較。

圖4 姜黃素和γ射線(xiàn)對(duì)肺癌小鼠腫瘤體積的影響

3 討 論

肺癌逐漸成為危害人類(lèi)生命的一種主要疾病之一。近年來(lái)許多學(xué)者嘗試采用常規(guī)的化療藥等來(lái)增加放射治療的效果[9-10]。盡管在某些情況下這種方法可以引起更好的治療效果，但受到特定了一些因素的限制，包括增加的毒性反應(yīng)，正常組織的損傷，增加的不良反應(yīng)等，因此獲得最小毒性的放療增敏劑對(duì)肺癌患者至關(guān)重要。

目前中藥放射敏感性的研究較少，探索中藥在此方面的作用具有重要意義，姜黃素便是其中之一。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在達(dá)到12 mg/d的劑量時(shí)，無(wú)明顯的不良反應(yīng)出現(xiàn)。也有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)結(jié)腸癌具有預(yù)防作用[11]。本實(shí)驗(yàn)研究姜黃素對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞放療增敏的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)10 μmol/L姜黃素處理肺癌細(xì)胞，再進(jìn)行5 Gy γ射線(xiàn)處理，能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡及促進(jìn)促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，抑制抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)。說(shuō)明姜黃素可增強(qiáng)肺癌NCI-H460細(xì)胞對(duì)γ射線(xiàn)的敏感性。此外，肺癌動(dòng)物模型結(jié)果顯示，γ射線(xiàn)與姜黃素聯(lián)合處理可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明聯(lián)合治療能起到很好的抑瘤效果。

大量的研究表明，NF-κB與腫瘤的放射耐受性密切相關(guān)。例如，在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、膀胱癌、食道上皮細(xì)胞癌中均發(fā)現(xiàn)放射激活了 NF-κB，而激活的NF-κB可保護(hù)細(xì)胞免受放射影響而死亡，從而在細(xì)胞放射耐受性上起作用[12-13]。相反，通過(guò)對(duì)NF-κB的抑制可增加放射敏感性，主要表現(xiàn)為DNA 結(jié)合能力減弱、 凋亡增加，或細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆源生存下降[6,14-16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)姜黃素和γ射線(xiàn)處理肺癌細(xì)胞后，顯著抑制NF-κB mRNA表達(dá)水平，提示姜黃素可能是通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療敏感性。另外，NF-κB可控制細(xì)胞周期調(diào)控基因如 C-MYC、Cyclin D1的表達(dá)，從而使G1期及 S 期細(xì)胞增加，而G1/S 期、G2/M 期細(xì)胞減少[17]。而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期阻滯是影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性的重要原因[18]。本次研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)姜黃素和γ射線(xiàn)處理后的肺癌細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞的G2/M期阻滯，從而進(jìn)一步說(shuō)明姜黃素是通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)，并進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期阻滯達(dá)到增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療敏感性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠增強(qiáng)肺癌細(xì)胞系NCI-H460的放療敏感性，而這種作用可能與其對(duì)NF-κB活性的抑制相關(guān)。本研究為姜黃素應(yīng)用肺癌的增敏治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其在臨床中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Curcumin induce the radiosensitivity of human lung carcinoma NCI-H460 cells through the NF-κB pathway

LiXiaobo,XuFang

(DepartmentofMeolicme,VocationalCollegeofScienceandTechnology,Tengzhou,Shandong277500,China)

Objective To study the combination effect of curcumin and γ ray on the activity of human lung carcinoma NCI-H460 cells and explore the sensitization of curcumin to γ ray.Methods The NCI-H460 cells proliferation were detected by MTT,the cell cycle and apoptosis by flow cytometry.The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot and the NF-κB gene expression by RT-PCR.In addition,the mice model of lung cancer was randomly divided into 4 groups:control group,curcumin group,γ ray group and combination group.After 28 days,the tumor volume was measured.Results The proliferation and cell cycle of NCI-H460 cells were inhibited and the apoptosis was increased in combination group.In addition,compared with curcumin group or γ ray group,the expression of Bcl-2 was inhibited,but the expression of Bax was increased and the mRNA expression of NF-ΚB was inhibited in combination group(allP<0.05).Also in combination group the tumor volume was significantly inhibited compared with curcumin group or γ ray group(allP<0.05).Conclusion Curcumin might induce the radiosensitivity of Human Lung Carcinoma NCI-H460 cells through the pathway.

curcumin;γ ray;cell proliferation;NF-κB;radiation tolerance

李曉波(1980-),講師，碩士，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.009

R734.2

A

1671-8348(2017)06-0749-03

2016-10-19

2016-11-17)