王苗苗，張凡慶，王 曼，朱建國

(上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240)

豬五種繁殖障礙性疫病病原體多重PCR的建立及初步應(yīng)用

王苗苗，張凡慶，王 曼，朱建國*

(上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240)

為了建立能夠同時檢測豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬細小病毒(PPV)的多重PCR，并用于豬場感染情況的動態(tài)監(jiān)控以及臨床診斷，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的5種病毒的基因序列，針對CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因，分別設(shè)計了特異性引物。在建立的單項PCR基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了能同時檢測5種病毒的多重PCR，并具有較高的靈敏性和良好的特異性。采用建立的多重PCR對127份疑似病豬的扁桃體活體組織進行檢測，檢出了5種病毒的存在，其中感染2種及以上病毒的樣品比例為38.6%(49/127)，表明該方法是一種快速、靈敏、高效的病原學檢測手段。

豬瘟病毒；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬偽狂犬病病毒；豬圓環(huán)病毒2型；豬細小病毒；多重聚合酶鏈反應(yīng)

在豬場常發(fā)生的各類疫病中，豬繁殖障礙性疾病給豬場的整體經(jīng)濟效益造成了嚴重影響[1-3]，這類疫病主要表現(xiàn)為感染母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等，公豬發(fā)生一定的繁殖障礙，感染仔豬出現(xiàn)大量死亡，或發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染[4]。如何有效預(yù)防和控制此類傳染性疾病的發(fā)生，保證豬群的良性發(fā)展，是一項亟待解決的艱巨任務(wù)，因此，做好豬群的疫病監(jiān)控工作就顯得尤為重要。豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙性疫病的主要病原[5-6]。由于這幾種疫病在臨床上呈現(xiàn)相似的癥狀，又常常發(fā)生混合感染，根據(jù)臨床癥狀較難進行鑒別診斷[5,7]。常規(guī)的診斷方法如病毒分離、血清學診斷方法等存在著耗時長、敏感度低的缺陷，已不能滿足現(xiàn)實臨床診斷需要。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，各種分子生物學檢測手段接連出現(xiàn)，大大提高了疫病的檢測水平，其中多重PCR具有敏感性高且可以一次檢測多種病原的優(yōu)勢，更加適于混合感染的快速診斷[8]。因此，建立能夠同時檢測CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV的多重PCR診斷方法，并用于豬群的實時監(jiān)控，及時準確地對疫病進行定性檢測，對于這些疫病的防控具有重要意義，也可為流行病學調(diào)查提供技術(shù)手段[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品采集于2014年—2015年間上海、江蘇、安徽地區(qū)部分豬場，采集臨床表現(xiàn)疑似患病豬的扁桃體活體組織，共127份。

1.1.2 病毒株、陽性對照 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，上海交通大學抗體工程實驗室保存；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)，上海市動物疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑 Trizol Reagent，Invitrogen公司產(chǎn)品；dNTP、TaqDNA 聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker DL 2 000、Agarose，TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Axygen公司產(chǎn)品；病毒DNA抽提試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細胞，上海交通大學抗體工程實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的序列，應(yīng)用Primer5.0軟件對各自保守區(qū)設(shè)計5對引物(表1)，分別選擇CSFV的E2基因、PRRSV的NSP2基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因、PPV的VP2基因為其擴增靶序列，同時通過NCBI網(wǎng)站對其特異性進行鑒定，結(jié)果顯示，所設(shè)計引物均具有良好的特異性。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 多重PCR引物

1.2.2 病毒核酸的提取 取疑似病豬扁桃體活體組織于DEPC水處理過的2 mL離心管中，并加入1 mL PBS(pH7.2)，經(jīng)全自動組織研磨機混合研磨勻漿后，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)移至DEPC水處理過的1.5 mL離心管中，按照DNA/RNA提取試劑盒說明書操作步驟分別進行。

1.2.3 RNA病毒模板制備 取抽提好的病毒RNA，按TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為10 μL，其中RNA 8 μL、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒中5×Primer Script RT Master Mix 2 μL。經(jīng)37℃1 5min，85℃ 5 s，4℃ 1 min后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單項PCR檢測方法的建立 分析測定PCR最佳反應(yīng)條件，包括退火溫度、引物濃度、MgCl2濃度等。分別確定每種病毒的單項PCR最佳反應(yīng)條件。單項PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL∶150 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10×Taqbuffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(每條引物濃度25 nmol/L)，模板1 μL，0.5 U/μLTaq酶2 μL，加滅菌雙蒸水補足25 μL。單項PCR擴增條件：CSFV、PRRSV擴增：95℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。PRV、PCV2、PPV擴增：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 50 s，72℃ 45 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

1.2.5 構(gòu)建模板質(zhì)粒 將得到的陽性樣品PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后，分別克隆至PMD-18T Vector載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后用質(zhì)粒抽提試劑盒進行提取。提取的質(zhì)粒經(jīng)測序驗證后用超微量紫外分光光度計測定濃度。

1.2.6 多重PCR檢測方法的建立 在建立的5種病毒單項PCR基礎(chǔ)上，對多重PCR反應(yīng)體系中各項條件進行優(yōu)化，確定多重PCR最佳反應(yīng)條件：總體積25 μL，包括150 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×Taqbuffer 2.5 μL，5種病毒上下游引物各0.5 μL(每條引物濃度25 nmol/L)，DNA/cDNA模板2 μL，0.5 U/μLTaq酶2 μL，加滅菌雙蒸水補足25 μL。多重PCR擴增條件：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 50 s，72℃ 45 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。

1.2.7 敏感性試驗 采用超微量紫外可見分光光度計對5種病毒的質(zhì)粒濃度進行測定，PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV初始濃度分別為92、39、12、10、21 ng/μL，然后分別進行10倍系列稀釋，100～10-5倍。等比混合后按上述優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)條件進行檢測，確定其敏感性。

1.2.8 特異性試驗 在加入5種被檢病毒引物的前提下，分別對CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV及該5種病毒混合物、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬鏈球菌(S.streptococcus)、副豬嗜血桿菌(H.parasuis)、大腸埃希菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)及陰性對照進行多重PCR，以檢測其特異性。

1.2.9 重復(fù)性試驗 采用已優(yōu)化的多重PCR對PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒的陽性樣品各2份重復(fù)試驗3次，以確定該多重PCR的穩(wěn)定性。

1.2.10 臨床樣品檢測 從上海及其周邊地區(qū)部分豬場采集疑似病豬活體的扁桃體組織樣品，用已建立的多重PCR進行檢測。

1.2.11 序列分析 將PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒的陽性PCR產(chǎn)物膠回收并純化后，連接至PMD-18T Vector載體，轉(zhuǎn)化后進行質(zhì)粒提取，將提取的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，以驗證結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增

用相應(yīng)引物分別對CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV進行單項及多重PCR擴增，擴增結(jié)果如圖1，可觀察到843 bp(PRV)、627 bp(CSFV)、506 bp(PCV2)、404 bp(PRRSV)和254 bp(PPV)的條帶，大小與預(yù)期相符，陰性對照沒有擴增出條帶。

M.DNA 標準DL 1 000;1.陰性對照；2.PPV；3.PRRSV；4.PCV2；5.CSFV；6.PRV；7.CSFV+PRRSV；8.PRV+PCV2+PPV；9.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV

M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2.PPV;3.PRRSV;4.PCV2;5.CSFV;6.PRV;7.CSFV+PRRSV;8.PRV+PCV2+PPV;9.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV

圖1 PCR對5種病毒的擴增結(jié)果

Fig.1 PCR results of five viruses

2.2 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

對多重PCR退火溫度進行優(yōu)化(圖2)，結(jié)果顯示，不同退火溫度對擴增結(jié)果影響不大，最終選擇56℃作為多重PCR最佳退火溫度。

M.DNA 標準DL 1 000;1～6.退火溫度分別為52、54、56、58、60、62℃的擴增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 1 000;1-6.Temperature 52,54,56,58,60 and 62℃ respectively

圖2 多重PCR最佳退火溫度的確定

Fig.2 Optimizing results of annealing temperature

2.3 敏感性試驗結(jié)果

采用優(yōu)化后的條件進行擴增，結(jié)果顯示(圖3)，在多重PCR中，PRV、CSFV、PCV2、PPV敏感性達到10-4倍稀釋度，最低檢出量分別為9.2、3.9、1.2、2.1 pg/μL，PRRSV敏感性達到10-3倍稀釋度，最低檢出量為10 pg/μL。

M.DNA 標準DL 1 000;1～6.PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV分別按100至10-5倍稀釋

M.DNA Marker DL 1 000;1-6.Dilutions respectively 100-10-5of PRV,CSFV,PCV2,PRRSV,PPV

圖3 多重PCR敏感性試驗

Fig.3 Sensitivity test of the multiplex PCR

2.4 特異性試驗結(jié)果

按照已優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進行特異性試驗。結(jié)果顯示，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬鏈球菌(S.streptococcus)、副豬嗜血桿菌(H.parasuis)、大腸埃希菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)及陰性對照均未擴增出條帶，而CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV及該5種病毒混合模板可見清晰目的條帶(圖4)。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

重復(fù)檢測5種病毒陽性樣品3次，結(jié)果均一致，說明建立的多重PCR具有較好的穩(wěn)定性。

M.DNA 標準DL 1 000;1.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV；2.PRV；3.CSFV；4.PCV2；5.PRRSV；6.PPV；7.TGEV；8.PEDV；9.S.streptococcus；10.H.parasuis；11.E.coli；12.S.aureus；13.ddH2O

M.DNA Marker DL 1 000;1.CSFV+PRRSV+PRV+PCV2+PPV;2.PRV;3.CSFV;4.PCV2;5.PRRSV;6.PPV;7.TGEV;8.PEDV;9.S.streptococcus;10.H.parasuis;11.E.coli;12.S.aureus;13.ddH2O

圖4 多重PCR特異性試驗

Fig.4 Specificity test of the multiplex PCR

2.6 多重PCR對臨床樣品的檢測

應(yīng)用多重PCR對127份疑似病豬活體扁桃體組織進行檢測，并與單項PCR檢測結(jié)果相比較，結(jié)果見表2、表3和圖5。從表2中可看出，PCV2、PRRSV的陽性率較高，分別為44.9%和40.2%，PPV、PRV、CSFV次之，陽性率分別為9.5%、5.5%、2.4%。表3中可看出，感染2種及以上病毒的陽性比例為38.6%，其中PCV2和PRRSV混合感染陽性率最高，達23.6%，另外出現(xiàn)三重感染PRRSV+PCV2+PRV 2份、PRRSV+PCV2+CSFV 1份。

2.7 測序結(jié)果

將測序結(jié)果與GenBank中收錄的PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒參考序列進行比較，結(jié)果顯示，該5種病毒比對后的基因序列核苷酸同源性均在98%～99%范圍內(nèi)，說明多重PCR檢測的陽性結(jié)果為上述5種病毒。

表2 檢測結(jié)果

表3 混合感染統(tǒng)計結(jié)果

M.DNA 標準DL 2 000;1.陽性對照；2.陰性對照照；3～20.部分臨床樣品

M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control;2.Negative control;3-20.Clinical samples

圖5 多重PCR對部分臨床樣品的檢測

Fig.5 Detection of clinical samples by multiplex PCR

3 討論

本試驗成功建立了能夠同時檢測PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV 5種病毒的多重PCR，并通過采集上海及其周邊地區(qū)部分豬場疑似病豬的扁桃體活體組織，實現(xiàn)了對被檢豬場患病情況的動態(tài)監(jiān)測。通過對127份樣品進行檢測，檢出PCV2、PRRSV陽性率最高，均達到40%以上，以此可推測被檢豬群所屬地區(qū)主要感染病原為PCV2和PRRSV，可為豬場凈化豬群提供借鑒。

在多重PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計至關(guān)重要，它決定著多重PCR反應(yīng)的成功與否[10-12]。本試驗在自行設(shè)計引物時，選取了5種病毒各自相對保守的基因序列，同時考慮到5種病毒擴增片段大小的差異，結(jié)果表明，所設(shè)計引物均得到了良好的擴增效果。另外，試驗通過優(yōu)化反應(yīng)條件，使建立的多重PCR具有較高的敏感性和良好的特異性及穩(wěn)定性。陳光達等[8]建立了檢測PCV2、PPV、PRV、CSFV、PRRSV和JEV的多重PCR，其最低檢測限為450 pg。本試驗所建立的多重PCR，5種病毒的最低檢出限均在1.2 pg～10 pg范圍內(nèi)，具有更高的敏感性，顯示出更高的檢出效率。

建立5種豬繁殖障礙性疫病病原體的多重PCR檢測方法，并用于種豬場的實時監(jiān)控，對于凈化種豬群和推廣優(yōu)良種豬具有重要意義。同時該方法可用于臨床診斷，為豬場采取必要防疫措施提供有力依據(jù)。

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Establishment and Application of a Multiplex PCR for Detecting Five Swine Viruses

WANG Miao-miao,ZHANG Fan-qing,WANG Man,ZHU Jian-guo

(ShanghaiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai,200240,China)

To establish the multiple PCR for detecting classical swine fever virus(CSFV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),porcine pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2(PCV2) and porcine parvovirus(PPV),five pairs of primers were designed to amplify CSFV E2,PRRSV Nsp2,PRV gB,PCV2 ORF2 and PPV VP2 according to the gene sequences in GenBank of these five viruses.Reaction conditions were optimized to establish the multiplex PCR on the basis of the single PCR.The multiplex PCR had good sensitivity and specificity.To evaluate the multiplex PCR,127 clinical samples were detected for detecting the five viruses,among which 38.6%(49/127) samples were detected for two or more viruses,which means the multiplex PCR can be used as rapid diagnosis for single or mixed clinical samples infected with CSFV,PRRSV,PRV,PCV2,PPV.

CSFV;PRRSV;PRV;PCV2; PPV;multiplex PCR

2016-07-27

上海市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目[滬農(nóng)科產(chǎn)字(2016)第6號]

王苗苗(1991-)，女，河南沈丘人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學研究。*通訊作者

SS854.44;S858.28

A

1007-5038(2017)03-0027-05