何 瑩，謝芝勛，羅思思，李 孟 ,謝志勤，謝麗基，黃 莉，鄧顯文，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧 530001)

研究論文

H5亞型和N6亞型禽流感病毒二重RT-PCR檢測方法的建立

何 瑩1,2，謝芝勛2*，羅思思2，李 孟2,謝志勤2，謝麗基2，黃 莉2，鄧顯文2，黃嬌玲2，張艷芳2，曾婷婷2

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧 530001)

為了建立一種快速、簡便的H5亞型、N6亞型禽流感病毒(AIV)的檢測方法，根據(jù)GenBank中H5亞型、N6亞型AIV的HA和NA基因保守序列，分別設計了2對特異性引物，通過優(yōu)化條件，建立了H5亞型和N6亞型AIV二重RT-PCR檢測方法。特異性試驗結果顯示，該方法對H5N6亞型AIV特異性擴增出418 bp和251 bp目的片段，對 H5Ny(y≠6)亞型AIV擴增出418 bp目的片段，對 HxN6(x≠5)亞型AIV擴增出251 bp目的片段，對其他亞型和常見的禽病病原體均未擴增出目的片段；敏感性結果顯示，該方法對H5亞型和N6亞型最低檢測限為1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亞型和N6亞型AIV檢測方法，具有特異性強，靈敏度高的特點，為H5亞型和N6亞型AIV臨床檢測以及防控提供了有效方法。

禽流感病毒；H5亞型； N6亞型； 二重逆轉錄-聚合酶鏈反應

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，根據(jù)血凝素(henmagglutinin,HA)和神經氨基酸酶(neuraminidase,NA)抗原性差異可分為不同亞型。目前已發(fā)現(xiàn)有18種HA(H1-H18)亞型和11種NA(N1-N11)亞型[1-2]，其中H5亞型屬于高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)，HPAIV H5N1引起的香港大流行，給養(yǎng)禽業(yè)和人類的公共衛(wèi)生造成巨大的沖擊[3]。H5亞型AIV一直在不斷進化和重組， 2013年，我國江蘇省首次在活禽市場監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)H5N6亞型AIV，并對其基因分析發(fā)現(xiàn)，H5N6亞型AIV由H5N1和H6N6兩種亞型AIV基因重組而來，并且多個基因來源于H5N1 HPAIV，使其具備了高致病的特性[4-5]。2014年，四川省南充市首次從人類中分離了高致病性H5N6亞型AIV[6]。目前，已確診15例人類感染H5N6亞型AIV病例[7]。H5N6亞型AIV不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經濟損失，還可以跨越宿主屏障直接感染人，進而危害人類健康。因此，建立一種能同時快速鑒別H5亞型和N6亞型AIV的檢測方法對養(yǎng)禽業(yè)及公共衛(wèi)生事業(yè)具有重要意義。

病毒分離及分子生物學技術是診斷H5N6亞型AIV的主要方法。病毒分離一般采用雞胚分離，血凝試驗和血凝抑制試驗鑒定，診斷周期長和敏感性低，具有一定的局限性。分子生物學技術中RT-PCR因具有特異性好和敏感性高而得到廣泛的臨床應用，但目前大部分只能鑒別單一的H5亞型或者N6亞型AIV,并不能同時檢測H5和N6亞型AIV[8]。本試驗構建H5和N6亞型AIV二重RT-PCR是同一管反應中加入2對引物，同時擴增兩條不同核苷酸目的條帶的PCR反應，具有經濟、快速、同時檢測兩種不同病原體的特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 Nano Drop2000超微量分光光度計，美國 Thermo Scientific公司產品；PCR 儀，Biometra公司產品；病毒DNA/RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、2×EasyTaqPCR Super Mix，北京全式金生物技術有限公司產品；MMLV反轉錄酶、dNTP、DNA Marker DL 1 000、DNA Marker 100 bp，TaKaRa公司產品。

1.1.2 毒株來源 AIV (H1N1、H3N2、H3N6、H4N6、H4N8、H6N6、H9N2、H11)[9-13]、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV),由廣西獸醫(yī)研究所實驗室分離鑒定保存；H5N6、H5N2、H5N9、H13N6亞型AIV滅活抗原,由美國賓夕法尼亞州立大學禽病診斷研究室贈送；H2N3、H8N4、H10N3、H12N3亞型AIV,由香港大學贈送；H7N9亞型AIV的陽性cDNA,由廣西壯族自治區(qū)疫病控制中心贈送。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù) GenBank中 H5亞型AIV的HA基因和N6亞型AIV的NA基因的核苷酸序列，用DNA Star軟件進行比對篩選出保守區(qū)域和Primer 5.0軟件設計針對H5亞型、N6亞型2對特異性引物，并通過NCBI Blast驗證。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物核酸序列見表1。

表1 H5和N6引物的核苷酸序列

1.2.2 病毒RNA抽提與RNA反轉錄 根據(jù)病毒DNA/RNA抽提試劑盒使用說明書抽提病毒RNA；抽提后的RNA用30 μL DEPC水溶解，對RNA產物反轉錄成cDNA；反轉錄體系(50 μL)如下：5×MMLV buffer 10μL，反轉錄引物 1.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，40 U/μL RRI酶抑制劑 0.6 μL，MMLV反轉錄酶 1 μL，DEPC水補足50 μL。所得到的cDNA置于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 質粒的制備 參照文獻[14]的方法，用H5亞型AIV和N6亞型AIV全長引物分別與對應的cDNA進行PCR擴增，用膠回收試劑盒對目的條帶回收純化后，連接到pMD18-T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性菌落接種于LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)37℃培養(yǎng)過夜，送至上海Invitrogen公司測序驗證。以測序結果正確的菌液抽提質粒，根據(jù)其濃度和分子質量分別計算質粒的拷貝數(shù)。

1.2.4 反應條件的優(yōu)化 二重RT-PCR反應體系 25 μL；2×EasyTaqPCR 12.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物在0.1 μmol/L～0.6 μmol/L，退火溫度在52℃～58℃之間，進行梯度優(yōu)化，以超純水補足25 μL，篩選出二重RT-PCR最佳反應條件。

1.2.5 特異性試驗 按照優(yōu)化好的條件，用該法對H1N1、H2N3、H3N2、H3N6、H4N6、H5N2、H6N6、H7N7、H9N2、H10N3、H11、H12N3、H13N6、NDV、IBV、ILTV進行特異性擴增，檢驗其特異性。

1.2.6 敏感性試驗 將H5基因和N6基因的AIV核酸用超微量分光光度計測量濃度后進行10倍倍比稀釋，按照優(yōu)化好的條件，用該法對其進行擴增，檢驗其敏感性。

2 結果

2.1 二重RT-PCR條件優(yōu)化

通過對H5和N6亞型AIV的引物濃度、擴增溫度、時間等條件的優(yōu)化，最終確定二重RT-PCR最佳反應體系(25 μL)：H5-F、H5-R引物均為0.2 μmol/L，N6-F、N6-R引物均為0.4 μmol/L，2×EasyTaqPCR 12.5 μL，cDNA模板1 μL，超純水補足25 μL。二重RT-PCR最佳擴增程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃結束擴增。用上述程序擴增H5、N6亞型AIV核酸擴增結果與預期目的條帶一致(圖1)。

M.DNA標準DL 1 000；1.陰性對照；2.H5亞型；3.N6亞型；4.H5+N6亞型

M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2.H5 subtype;3.N6 subtype;4.H5+N6 subtypes

圖1 二重RT-PCR擴增結果

Fig.1 Amplification results of duplex RT-PCR

2.2 特異性試驗結果

對AIV亞型、NDV、IBV、ILTV核酸擴增結果顯示,對H5、N6亞型AIV擴增結果出現(xiàn)2條特異性條帶，分別為418 bp和251 bp；對H5N2亞型AIV即H5Ny (y≠6)亞型AIV擴增結果僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為418 bp；H3N6、H4N6、H6N6、H13N6亞型AIV即HxN6(x≠5)亞型AIV僅擴增出1條特異性條帶，片段大小為251 bp，對其他亞型AIV以及常見的禽病病原體的擴增均未出現(xiàn)條帶(圖2)。

2.3 敏感性試驗結果

對H5、N6亞型AIV核酸濃度1.59×10-1ng/μL～1.59×10-6ng/μL分別擴增出418 bp、251 bp目的條帶，H5、N6亞型AIV核酸濃度1.59×10-6ng/μL無擴增的目的條帶。敏感性結果表明，二重RT-PCR 最低能檢測到1.59×10-5ng/μL(圖3)。

M.DNA 標準DL 1 000;1.H5N2+H13N6；2.H5N9+H13N6；3.H5N2；4.H3N6；5.H4N6；6.H1N1；7.H2N3；8.H3N2；9.H4N8；10.H6N6；11.H7N9；12.H8N4；13.H9N2；14.H10N3；15.H11；16.H12N3；17.H13N6；18.NDV；19.IBV；20.ILTV；21.陰性對照

M.DNA Marker DL 1 000;1.H5N2+H13N6；2.H5N9+H13N6；;3.H5N2; 4.H3N6;5.H4N6;6.H1N1;7.H2N3;8.H3N2;9.H4N8;10.H6N6;11.H7N9;12.H8N4;13.H9N2;14.H10N3;15.H11;16.H12N3;17.H13N6;18.NDV;19.IBV;20.ILTV;21.Negative control

圖2 特異性試驗結果

Fig.2 Specificity test results

M.DNA 標準DL 1 000;1.1.59×10-1ng/μL；2.1.59×10-2ng/μL；3.1.59×10-3ng/μL；4.1.59×10-4ng/μL；5.1.59×10-5ng/μL；6.1.59×10-6ng/μL；7.陰性對照

M.DNA Marker DL 1 000;1.1.59×10-1ng/μL;2.1.59×10-2ng/μL;3.1.59×10-3ng/μL;4.1.59×10-4ng/μL;5.1.59×10-5ng/μL;6.1.59×10-6ng/μL;7.Negative control

圖3 敏感性試驗結果

Fig.3 Sensitivity test results

3 討論

禽流感病毒亞型較多，H5、H7亞型HPAIV引起的禽類發(fā)病迅速，具有極高的發(fā)病率和病死率，造成養(yǎng)禽業(yè)的巨大損失。隨著抗原的轉變和基因重排， H5亞型AIV由原來的H5N1到H5N5、H5N6、H5N8等亞型的轉變[15-17]，更為驚訝的是這些亞型多數(shù)處于2.3.2和2.3.4分支上[18]，具有HPAIV特性。N6亞型基因主要由H6N6亞型基因重排而來，以往H6N6亞型屬于LPAIV，對于養(yǎng)禽業(yè)的危害較小[6]，缺乏對該亞型的研究。H5亞型和N6亞型的重排組合，對禽類乃至人類都是一種極大的危害。據(jù)世界動物衛(wèi)生組織報道，我國哈爾濱、廈門等地區(qū)暴發(fā)H5N6亞型HPAIV，導致大量家禽死亡，造成巨大的經濟損失。自2014年以來，H5N6亞型AIV不僅僅引起禽類感染，跨越物種傳播給人類[19]，嚴重危害人類健康。HPAIV傳播快，危害大，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早控制是預防病毒在家禽和人群中傳播的關鍵。因此，建立一種能同時快速檢測H5、N6亞型AIV的方法，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

本研究構建的H5亞型和N6亞型AIV二重RT-PCR是根據(jù)其保守序列設計的2對特異性引物，成功構建H5亞型和N6亞型AIV二重TR-PCR檢測方法。對H5亞型和N6亞型AIV只需一管反應就可以快速把H5N6亞型AIV及其他H5N1、H5N2、H5N8、H6N6、H13N6等不同HA與NA亞型搭配中的H5和N6亞型AIV鑒別診斷。本研究構建的H5亞型和N6亞型AIV二重RT-PCR特異性試驗和敏感性試驗擴增條帶與預期結果一致，具有特異性強、靈敏度高、快速便捷的特點，可為早期快速檢測和臨床診斷提供參考依據(jù)。

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Development of a Duplex RT-PCR for Detecting AIV H5 and N6 Subtypes

HE Ying1,2, XIE Zhi-xun2,LUO Si-si2, LI Meng2, XIE Zhi-qin2, XIE Li-ji2, HUANG Li2,DENG Xian-wen2,HUANG Jiao-ling2, ZHANG Yan-fang2, ZENG Ting-ting2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,Guangxiuniversity,Nangning,Guangxi,530001,China;2.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnosis,Nangning,Guangxi,530001,China)

In order to establish a rapid,simple H5 and N6 subtypes avian influenza virus (AIV) detection method,according to the sequences of HA and NA genes of H5 and N6 subtypes of AIV,two pairs of specific primers were designed respectively,the conditions were optimized and the duplex RT-PCR assay for detection of AIV H5 and N6 subtypes was established.It was shown that H5N6 AIV could be amplified into two specific bands by this duplex RT-PCR, the lengths of bands were 418 bp(H5 AIV) and 251 bp(N6 AIV),respectively.Samples containing H5 or N6 subtype AIV could be amplified into one specific band,which was 418 bp,251 bp,respectively.No specific band was amplified from other subtypes AIV and avian pathogenic virus.Sensitivity test results showed that as low as 1.59×10-5ng/μL H5N6 AIV could be detected.This duplex RT-PCR assay is a specific,sensitive method for the detection of H5 and N6 subtypes AIV in the same tube,and provided an effective tool to determine the infection of AIV H5 and N6 subtypes.

Avian influenza virus; H5 subtype; N6 subtype; duplex RT-PCR

2016-06-30

廣西自然科學基金項目(2015GXNSFBA139070)；廣西科技項目(桂科AD16380009，14123001-8)； 廣西水產畜牧局科研項目(桂漁牧科201452001)；；南寧市科技項目(20152308)

何 瑩(1990-)，女，廣西北流人，碩士，主要從事獸醫(yī)生物技術研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2017)03-0001-04