桂迪，黃曉穎，王良興

（1．溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

?綜 述?

單磷酸腺苷活化蛋白激酶調(diào)控細(xì)胞自噬的機(jī)制研究進(jìn)展

桂迪1，黃曉穎2，王良興2

（1．溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

自噬是細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境應(yīng)激所作出的反應(yīng)，是細(xì)胞降解自身成分以維持細(xì)胞活性和生存的過(guò)程。在動(dòng)物組織中，自噬機(jī)制的缺陷通常和細(xì)胞衰老、年齡相關(guān)性退化性疾病有關(guān)聯(lián)，這些疾病包括心血管疾病、癌癥、免疫系統(tǒng)功能受損和神經(jīng)系統(tǒng)病變等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多蛋白可以對(duì)能量、營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子水平以及應(yīng)激做出反應(yīng)，其中包括一些激酶，它們可以正向或負(fù)向調(diào)節(jié)自噬過(guò)程以調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性。最近研究表明細(xì)胞可以通過(guò)單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）對(duì)上述適應(yīng)反應(yīng)發(fā)揮重要作用，本文就近些年有關(guān)AMPK對(duì)自噬調(diào)控機(jī)制的研究成果作一綜述。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；ULK1；自噬；綜述文獻(xiàn)

自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體途徑來(lái)降解自身成分的過(guò)程[1]，胞內(nèi)待降解的蛋白復(fù)合物、受損的細(xì)胞器以及入侵的病原體等被自噬囊泡包裹并運(yùn)送到溶酶體，進(jìn)而被降解以維持細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài)[2]。YORIMITSU等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共存在3種形式的自噬，分別是大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。而這3種不同的自噬途徑最終都通過(guò)溶酶體體系對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)行蛋白水解。同時(shí)，自噬也是一個(gè)緊密調(diào)控的過(guò)程，自噬缺陷和很多人類疾病相關(guān)，包括腫瘤、心肌病和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等[5-7]。自噬在所有細(xì)胞中均處于較低的水平，有利于維持細(xì)胞的平衡狀態(tài)[4]。早期對(duì)自噬相關(guān)基因及其機(jī)制的研究大都來(lái)自酵母菌基因?qū)嶒?yàn)[8]，隨后也對(duì)高等真核生物進(jìn)行了研究，并命名了相應(yīng)的真核生物自噬相關(guān)基因[9-10]。大量研究提示單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）可以通過(guò)不同的通路調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的自噬過(guò)程[11-14]，因此，進(jìn)一步闡明其對(duì)自噬調(diào)控的作用，有可能為自噬相關(guān)性疾病的治療提供新思路。

1 自噬的起始調(diào)控元件

在自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）中，ATG1在自噬的起始調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，它可以和ATG13、ATG17形成復(fù)合物，然而雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，TOR）對(duì)ATG13的磷酸化調(diào)控可以抑制其與ATG1的結(jié)合進(jìn)而阻斷上述復(fù)合物的形成[19-23]。哺乳動(dòng)物中有與ATG1類似的同類物，包括ULK1和ULK2[24-25]，不同的是ULK1與ATG13則始終聯(lián)系在一起的，并且ULK1才是哺乳動(dòng)物自噬起始的關(guān)鍵調(diào)控單元[14]。

2 AMPK的結(jié)構(gòu)

AMPK是一種異源三聚體蛋白的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其包括1個(gè)催化亞單位α與2個(gè)調(diào)節(jié)亞單位β和γ[15-16]，其中α亞單位又分為α1和α2亞型，β亞單位包括β1和β2亞型，γ亞單位包括γ1、γ2和γ3亞型。α亞單位在N端含有絲/蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域，是其主要的催化部位，而C端則為與另外2個(gè)亞單位的結(jié)合位點(diǎn)[17]。激活的AMPK可以刺激產(chǎn)能的分解代謝途徑并抑制耗能的合成代謝過(guò)程，進(jìn)而在能量代謝平衡的調(diào)節(jié)上起到關(guān)鍵性的作用[15-16]。

3 AMPK對(duì)自噬信號(hào)的調(diào)節(jié)

目前的研究提示AMPK可以對(duì)自噬的起始進(jìn)行調(diào)控，在AMPK對(duì)ULK1的調(diào)控機(jī)制中，不同的研究有著不同的觀點(diǎn)，包括作用位點(diǎn)的不同以及其對(duì)ULK1是正向抑制或是負(fù)向的調(diào)控作用。同時(shí)，AMPK除了可以通過(guò)ULK1對(duì)自噬產(chǎn)生調(diào)控外，也可以通過(guò)哺乳動(dòng)物TOR（mTOR）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制物P27對(duì)自噬產(chǎn)生調(diào)控作用，其中對(duì)mTOR的調(diào)控可以間接通過(guò)磷酸化ULK1相應(yīng)位點(diǎn)而起到對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用，以下將對(duì)各條通路機(jī)制進(jìn)行總結(jié)。

3.1 AMPK通過(guò)直接作用于自噬相關(guān)蛋白ULK1參與自噬的調(diào)節(jié) AMPK可以直接作用于自噬起始調(diào)控單元，在KIM等[12]的研究中，他們以細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究AMPK在ULK1的磷酸化位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)ULK1的不同位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變的方法，共檢測(cè)了ULK1的蘇氨酸（Threonine，Thr）624、絲氨酸（Serine，Ser）494、Ser555、Ser574、Ser622、Ser693、Ser811、Ser317和Ser777共9個(gè)位點(diǎn)，最終發(fā)現(xiàn)在ULK1絲/蘇氨酸富集區(qū)的Ser317和Ser777 2個(gè)位點(diǎn)是AMPK對(duì)其主要的磷酸化位點(diǎn)。若同時(shí)突變這2個(gè)位點(diǎn)，可以明顯減少離體狀態(tài)下AMPK對(duì)ULK1的磷酸化，而突變其余的7個(gè)磷酸化位點(diǎn)則ULK1的磷酸化不受影響。更進(jìn)一步，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí)，AMPK可以通過(guò)直接磷酸化ULK1進(jìn)而促進(jìn)自噬的發(fā)生，而AMPK的抑制劑compoud C則可以抑制此狀態(tài)下細(xì)胞的ULK1位點(diǎn)的磷酸化。同時(shí)，在對(duì)AMPKα1和α2雙基因敲除的細(xì)胞檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，與未敲除基因的細(xì)胞相比，前者ULK1的Ser317和Ser777位點(diǎn)磷酸化明顯減少。

與前者的磷酸化位點(diǎn)不同的是，在EGAN等[11]的研究中，通過(guò)檢索真核生物蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)ULK1為AMPK的磷酸化作用蛋白之一，其中共篩選出4個(gè)可以和AMPK匹配的作用位點(diǎn)，分別是Ser467、Ser555、Ser637、Thr574。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究表明，在細(xì)胞水平，AMPK可以通過(guò)以上4個(gè)位點(diǎn)直接磷酸化ULK1。通過(guò)質(zhì)譜分析研究發(fā)現(xiàn)在體情況下AMPK僅通過(guò)Ser555、Ser637以及Thr574 3個(gè)位點(diǎn)直接作用于UKL1。

除了磷酸化位點(diǎn)的不同，也有研究表明AMPK對(duì)ULK1的作用可能不僅僅是簡(jiǎn)單的激活作用。SHANG等[14]研究指出，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）標(biāo)記細(xì)胞后，在饑餓的細(xì)胞中，ULK1的Ser638、Ser758位點(diǎn)的磷酸化減少了10倍以上。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)Ser638位點(diǎn)同時(shí)受AMPK和mTOR的調(diào)控，前者為去磷酸化作用，而后者為磷酸化作用，Ser758位點(diǎn)則單由mTOR的磷酸化作用調(diào)控。然而AMPK亞單元（AMPKα和AMPKγ1）可在營(yíng)養(yǎng)充足的狀態(tài)下與ULK1相結(jié)合，與AMPK結(jié)合后，ULK1啟動(dòng)自噬作用就會(huì)明顯減弱，此外mTOR對(duì)ULK1的Ser758位點(diǎn)的磷酸化作用可進(jìn)一步加強(qiáng)AMPK與ULK1的結(jié)合，進(jìn)而抑制自噬作用的發(fā)生。因而可能AMPK在自噬調(diào)控中存在著雙重作用，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí)，AMPK可以促進(jìn)自噬的發(fā)生，但當(dāng)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)豐富的情況下，AMPK則可以抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。

3.2 AMPK通過(guò)作用于mTOR參與自噬的調(diào)節(jié) TOR是能量（包括氨基酸、ATP等）和激素的感受器[29]，在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中起著非常重要的作用，同時(shí)也是自噬過(guò)程的重要門控基因。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，p70S6）可發(fā)揮強(qiáng)烈的自噬抑制作用，而mTOR激酶則可調(diào)節(jié)其活性大小[30]。同時(shí)，mTOR可以通過(guò)其他多條通路對(duì)自噬產(chǎn)生抑制作用:①轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）是溶酶體生成的主要調(diào)控者，而mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）可以通過(guò)負(fù)性調(diào)控TFEB使溶酶體的生成減少，進(jìn)而損傷自噬的進(jìn)程[31]；②mTORC2可以通過(guò)絲/蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）通路來(lái)下調(diào)AMPK，從而激活mTORC1-S6[32]，另外，在饑餓狀態(tài)的骨骼肌細(xì)胞中，阻斷mTORC2可以誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬[33-34]；③mTOR可以直接磷酸化ULK1的Ser757位點(diǎn)，使AMPK磷酸化ULK1減少[12]，同時(shí)使AMPK與ULK1相結(jié)合，抑制自噬的發(fā)生[14]；④在對(duì)酵母的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬過(guò)程的產(chǎn)生需要ATG13與ATG1的結(jié)合，然而TOR通路可以磷酸化ATG13，使其與ATG1的親和力明顯減低，進(jìn)而抑制自噬[21]。

然而，AMPK可以通過(guò)2條通路對(duì)mTOR進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生。INOKI等[28]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)下時(shí)，激活的AMPK可以直接磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)蛋白2（tuberous sclerosis proteins 2，TSC2）的Thr1277和Ser1345位點(diǎn)，進(jìn)而抑制mTOR的活性。通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲低細(xì)胞的TSC2蛋白的表達(dá)，則可以消除由于能量不足而被誘導(dǎo)的S6K的去磷酸化。

GWINN等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中，AMPK激活劑AICAR和苯乙雙胍可以通過(guò)TSC2快速地抑制mTORC1的活性，然而即使是在TSC 2-/-的MEFs中，mTORC1的活性仍然可以被上述2種藥物有效地抑制，這提示存在AMPK的其他下游通路可以直接或者間接的調(diào)節(jié)mTORC1的活性。隨后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提示，AMPK可以直接磷酸化mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白（regulatoryassociated protein of mTOR，raptor）的Ser722和Ser792 2個(gè)Ser位點(diǎn)，從而抑制mTORC1的活性。當(dāng)把這2個(gè)Ser位點(diǎn)進(jìn)行基因沉默后，發(fā)現(xiàn)兩者均可以防止AMPK激動(dòng)劑對(duì)mTORC1的活性抑制作用。同時(shí)NOJIMA等[27]的研究表明，raptor可以與真核細(xì)胞始動(dòng)因子（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）、核糖體S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase 1，P70S6K1）在其各自的保守TOR信號(hào)（conserved TOR signaling，TOS）區(qū)域結(jié)合進(jìn)而激活mTORC1的活性，使信號(hào)通路下傳。上述研究結(jié)果提示，AMPK對(duì)raptor的磷酸化調(diào)控可能影響了raptor的此作用途徑，進(jìn)而導(dǎo)致mTORC1活性下降。

3.3 AMPK通過(guò)作用于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制物P27參與自噬的調(diào)節(jié) 在相關(guān)研究中，研究者以人乳腺癌細(xì)胞系（michigan cancer foundation-7，MCF-7）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)AMPK激動(dòng)劑AICAR可以通過(guò)肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）-AMPK通路磷酸化P27 Thr198位點(diǎn)進(jìn)而提高其穩(wěn)定性，以誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，使細(xì)胞在生長(zhǎng)因素缺乏及代謝壓力下通過(guò)自噬而得以存活[18]。P27在自噬和細(xì)胞生存中所起的作用可能依賴于其阻止細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的作用。

4 小結(jié)

AMPK最初被認(rèn)為在細(xì)胞的代謝中起著關(guān)鍵性的作用，隨著研究的不斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)AMPK的作用遠(yuǎn)不止于此，目前發(fā)現(xiàn)其在自噬方面也起著重要的作用，AMPK可以通過(guò)作用于ULK1的不同的絲/蘇氨酸位點(diǎn)使其發(fā)生磷酸化進(jìn)而促進(jìn)自噬的發(fā)生，同時(shí)在營(yíng)養(yǎng)充足的狀態(tài)下其可以結(jié)合ULK1而抑制自噬的發(fā)生。另外，AMPK可以通過(guò)直接影響mTOR及細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制物P27進(jìn)而調(diào)控自噬。但目前在ULK1絲/蘇氨酸區(qū)域的作用位點(diǎn)方面，發(fā)現(xiàn)不同研究中存在著明顯差異，進(jìn)一步闡明差異的原因，如由于細(xì)胞類型、處理方式、刺激時(shí)間和強(qiáng)度的不同而致使其作用位點(diǎn)的不同，或是同一細(xì)胞中各個(gè)位點(diǎn)均有涉及，只是其中一個(gè)位點(diǎn)占主導(dǎo)地位等，可以為自噬缺陷相關(guān)疾病的防治提供依據(jù)、手段以及新的思路，值得我們進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

R445.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.016

2016-02-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81473406）；浙江省衛(wèi)生廳平臺(tái)計(jì)劃研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2012ZDA033）。

桂迪（1985-），男，浙江慈溪人，碩士生。

黃曉穎，主任醫(yī)師，副教授，Email:zjwzhxy@126. com。