楊 斌 龐文生 胡 娟.2*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122； 2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

藥物研究

太子參均一多糖的分離與表征

楊 斌1龐文生1胡 娟1.2*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122； 2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

目的：對(duì)太子參抗二型糖尿病多糖活性部位(PF40)，進(jìn)行分離純化得到均一多糖并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。方法：太子參粉碎后，通過(guò)水提醇沉法(40%乙醇)得到太子參粗多糖，采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠柱對(duì)其分離純化，得到一種均一多糖，采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-柱前衍生高效液相色譜法分析單糖組成。結(jié)果：分離得到一種均一多糖，由葡萄糖組成，分子量為18400Da，命名為HPh-1-1。結(jié)論：太子參均一多糖HPh-1-1是一種葡聚糖。

太子參均一多糖；分子量；單糖組成

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm．的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺作用[1]。多糖是太子參重要活性成分之一，研究表明，太子參多糖具有降低血糖、血脂[2～3]、改善胰島素抵抗[4]等功效。課題組前期對(duì)太子參粗多糖以40%的乙醇沉淀，經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到其抗二型糖尿病活性部位(PF40)[5]。本研究采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠柱層析方法，對(duì)PF40進(jìn)行分離純化，得到均一多糖；并分析其分子量及單糖組成，為進(jìn)一步探討太子參多糖的化學(xué)組成及藥理相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(Dionex公司)；UV-3200型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；MOKULYOD-230型冷凍干燥儀(Thermo Fisher公司)；層析柱(上海錦華層析設(shè)備廠)；HL-2D定時(shí)數(shù)顯恒流泵；DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；AE240S型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；BC-R501B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海生物化工設(shè)備有限公司)；HH-4型恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 太子參(福建柘參種業(yè)有限公司)；Cellulose DE-52(Whatman公司，批號(hào)：1030A024)；Sephacryl S-300HR(GE公司，批號(hào)：10222040)；葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)套(中國(guó)食品藥品鑒定研究院,批號(hào)，201203)；D-葡萄糖、D-甘露糖(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140117)；L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-阿拉伯糖(分析純，Sigma公司，批號(hào)：20120203)，乙腈(色譜純，Merck公司，批號(hào)：608000203)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、氯化鈉、硝酸鈉、無(wú)水乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚、濃鹽酸、氫氧化鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140617)。

2 方法與結(jié)果

2.1 太子參均一多糖的提取與分離 干燥太子參粉碎后過(guò)40目篩，經(jīng)90%乙醇回流提取3次；藥渣經(jīng)水提3次，每次2h，過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾濃縮至原體積1/20；Sevage法脫蛋白，溶液經(jīng)90%乙醇沉淀，離心；沉淀用蒸餾水溶解，以終濃度40%的乙醇沉淀；離心，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌后冷凍干燥，得PF40多糖。經(jīng)Cellulose DE-52柱和Sephacryl S-300HR柱進(jìn)一步分離純化，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，收集水洗脫餾分，經(jīng)濃縮、透析后冷凍干燥，得到1種均一多糖組分，命名為HPh-1-1，分離流程見(jiàn)圖1。

2.2 太子參均一多糖的相對(duì)分子質(zhì)量

2.2.1 色譜條件 Ultrahydrogel 500、1000凝膠色譜柱串聯(lián)(7.8×300mm)；流動(dòng)相為0.1mol/LNaNO3溶液作，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫35℃。2.2.2 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取葡聚糖對(duì)照品，分子量分別為2700、5250、9750、13050、36800、64650、135350Da，用流動(dòng)相配制成4mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，供HPGPC分析用。將葡聚糖分子量的對(duì)數(shù)值(logM)對(duì)保留時(shí)間(tR)作圖，得線性回歸方程為logM=-0.1901tR+11.2723，相關(guān)系數(shù)r=0.9721。

2.2.3 樣品分析 精密稱取HPh-1-1，用流動(dòng)相配制成濃度為4mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPGPC分析。結(jié)果顯示，樣品色譜峰具有良好的對(duì)稱性，純度>97.92%；保留時(shí)間為36.82min，代入回歸方程，計(jì)算得出HPh-1-1分子量為18400Da。見(jiàn)圖2。

2.3 柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定單糖組成

2.3.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為0.1mol/L磷酸緩沖鹽(pH6.7)-乙腈(83:17，V/V)，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃。

2.3.2 單糖對(duì)照品的衍生化 精密稱取甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖對(duì)照品，各配制成2mg/mL溶液。分別吸取對(duì)照品溶液0.3mL，依次加入0.3mol/L的PMP甲醇溶液0.3mL，0.3mol/L的NaOH溶液0.3mL，混勻，于70℃水浴中反應(yīng)100min，冷卻至室溫，加0.3mol/L的HCl溶液0.3mL中和，再加2mL三氯甲烷，充分混勻，離心，棄去下層液體。重復(fù)操作3次，上層水相經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果顯示，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的保留時(shí)間分別為10.71、13.66、15.91、18.19、21.44、24.39、26.14min。

2.3.3 混合對(duì)照品的衍生化 精密稱取甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖對(duì)照品各5mg置于10mL的容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容，吸取0.3mL，按“2.3.2”項(xiàng)下衍生化方法操作，上層水相經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，供HPLC分析用。

2.3.4 樣品的衍生化 精密稱取HPh-1-12mg，于具塞樣品瓶中，加入2mol/L 三氟乙酸水溶液4mL，封瓶，于110℃水解4h。水解液經(jīng)減壓濃縮至干，加3mL甲醇后蒸干，重復(fù)操作4次；加1mL 蒸餾水溶解樣品。吸取樣品溶液0.3mL，按“2.3.2”項(xiàng)下衍生化方法操作，上層水相經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，供HPLC分析用。

2.3.5 樣品的單糖組成分析 在所確定的柱前衍生高效液相色譜條件下，樣品HPh-1-1僅出現(xiàn)1個(gè)色譜峰，與混合對(duì)照品譜圖比較，為葡萄糖。HPh-1-1主要由葡萄糖單糖組成，其結(jié)構(gòu)特征為葡聚糖。見(jiàn)圖3。

3 討論

近年來(lái)，太子參多糖的研究在化學(xué)成分、藥理等各方面都不斷深入。本研究采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠柱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)太子參多糖進(jìn)一步分離提純切實(shí)可行。分離出一種均一多糖HPh-1-1，通過(guò)高效滲透色譜法測(cè)得其分子量為18400Da，PMP-柱前衍生高效液相色譜分析表明HPh-1-1是一種葡聚糖。為太子參多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理相關(guān)性進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]王文凱，賈靜，丁仁偉，等．太子參近年研究概況[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(12)：264-267．

[2] 姚先梅，段賢春，吳健，等．太子參多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血糖、血脂代謝和腎臟病理的影響[J]．安徽醫(yī)藥，2014(1)：23-26．

[3] 徐錦龍，徐愛(ài)仁，應(yīng)景艷，等．太子參多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血糖及胰島素的影響[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012(2)：423-424．

[4] 王琪，柴單單，吳曉華，等．太子參多糖減輕高脂誘導(dǎo)的小鼠肝臟胰島素抵抗[J]．中國(guó)病理生理雜志，2015，31(4)：685-689．

[5] Juan Hu，Wensheng Pang，Jinlong Chen,et al．Hypoglycemic effect of polysaccharides with different molecular weight of Pseudostellaria heterophylla [J].BMC Complementary And Alternative Medicine，2013，13(1)：267．

Isolation and Characterization of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide

YANG Bin1PANG Wensheng1HU Juan1,2*

1．The college of Pharmacy, FuJian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122，China; 2．Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China

ObjectiveTo further purified and characterized of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide. Methods After crushing Radix Pseudostellariae, the polysaccharide was extracted by water and ethanol precipitation method(40% ethanol). The column of Cellulose DE-52 and Sephacryl S-300HR was used to separate and purify it. High performance gel permeation chromatography(HPGPC) was used to analyze the average molecular weight, high performance liquid chromatography(HPLC) of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) pre-column derivatization was used to analyze its monosaccharide components. ResultsA novel homogeneous polysaccharide, named as H-1-1, was obtained. The mean molecular weight of HPh-1-1was 18400Da and it was only composed of glucose. ConclusionThe Pseudostellaria heterophylla homogeneous polysaccharide HPh-1-1was a kind of dextran．

Pseudostellaria Heterophylla Polysaccharide；Molecular Weigh；Monosaccharide Components

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81470175)。

楊斌(1990-)，男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：1300808526@qq.com

胡娟，女，土家族，教授，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞峙c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R248.2

A

1007-8517(2017)04-0011-02

2016-12-02 編輯：梁志慶)