郭鳳倩，黃祖順，朱寶磊，劉謙

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

忍冬藤可溶性膳食纖維提取及性能分析

郭鳳倩，黃祖順，朱寶磊，劉謙*

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

探討纖維素酶法提取忍冬藤中水溶性纖維素的最佳工藝并對(duì)其性能進(jìn)行分析。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化得到最佳工藝條件組合為pH=4.8，溫度45 ℃，料液比1:12(g/mL)，纖維素酶體積分?jǐn)?shù)1.2%，提取時(shí)間6 h，浸提3次。在此條件下，水溶性膳食纖維的提取率為3.57%，所提取的水溶性纖維素持水力為6.1 g/g，膨脹力為5.3 mL/g，持油力為4.53 g/g，陽(yáng)離子交換能力為0.58 mmol/g，DPPH自由基最大清除率為80.13%，具有較好的理化性能。研究認(rèn)為，纖維素酶解法可用于提取忍冬藤中的水溶性膳食纖維。

忍冬藤；水溶性膳食纖維；纖維素酶；性能

膳食纖維是一種復(fù)雜的混合物的總稱(chēng)，具有多種生理功能，可預(yù)防痔瘡、直腸癌、結(jié)腸癌、糖尿病、乳腺癌和肥胖癥等癥，被列為繼糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水、礦物質(zhì)和維生素之后的“第七營(yíng)養(yǎng)素”[1]。膳食纖維主要存在于大部分谷物、水果和蔬菜中，分為水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber， SDF)和水不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber ，IDF)。SDF存在于果膠和凝膠中，為半纖維素多糖，易被腸道微生物所用。IDF存在于植物細(xì)胞壁中，為纖維素、木質(zhì)素和半纖維素，有利于促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，幫助消化。

忍冬藤為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)干燥的藤莖?！侗静菥V目》載“忍冬，莖葉及花，功用皆同”，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效。目前山東省金銀花藥材年產(chǎn)量達(dá)2萬(wàn)噸，忍冬藤產(chǎn)量至少10萬(wàn)噸。目前忍冬藤主要用于飼料加工、直接喂養(yǎng)牲畜或次生代謝成分提取，用于提取次生代謝物質(zhì)的忍冬藤纖維素部分作為廢棄物。利用忍冬藤SDF作為膳食纖維可以提高忍冬藤的利用率，提升忍冬藥材的附加值。本試驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)多采用的化學(xué)-酶法相結(jié)合的提取膳食纖維方法[2]，以忍冬藤為原料，采用纖維素酶水解法從忍冬藤中提取SDF，并優(yōu)化了提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

忍冬藤：采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)張永清教授鑒定為忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的藤莖，105～120 ℃殺青，60 ℃下干燥 48 h，粉碎，過(guò)40目篩，備用。

試劑：α-淀粉酶(A109181-100g)、糖化酶(液化型 104U/mL)、纖維素酶C109262-5g(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH分析純，和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)；乙醇、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸銀、水楊酸、硫酸亞特、雙氧水、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液等均為分析純；豆油。

1.2 儀器與設(shè)備

微型植物粉碎機(jī)(長(zhǎng)沙市雨花區(qū)中誠(chéng)制藥機(jī)械廠)；PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；TDZ4-MS低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SHZ-D(III) 循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪高科儀器廠)；恒溫水浴鍋(功率15 kW,常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠)；202-00S恒溫干燥箱(長(zhǎng)沙科儀儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 忍冬藤SDF提取工藝

1.3.1 工藝流程

準(zhǔn)確稱(chēng)取忍冬藤粉末(過(guò)40目篩)3.0 g，以蒸餾水為溶劑，加入α-淀粉酶，調(diào)節(jié)pH，60 ℃恒溫水浴酶解，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH，加入糖化酶，45 ℃恒溫水浴酶解，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH，加入纖維素酶，45 ℃恒溫水浴酶解[3]，真空抽濾，4 000 r/min離心，濃縮，加入4倍量體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇醇析8 h，離心，傾去上清液，80～90 ℃干燥，得到SDF。

1.3.2 忍冬藤SDF提取率的計(jì)算

(1)

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以忍冬藤SDF提取率為指標(biāo)，主要考察料液比、纖維素酶體積分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間和浸提次數(shù)對(duì)SDF提取率的影響，根據(jù)公式(1)計(jì)算SDF，每個(gè)因素試驗(yàn)重復(fù)3次，所得結(jié)果取平均值。

1.3.3.1 最佳料液比的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份樣品，每份3.0 g，在pH=4.8，溫度45 ℃，加入纖維素酶體積分?jǐn)?shù)分別為1.0%的條件下，料液比(g/mL)分別設(shè)為1:9、1:12、1:15、1:17、1:25，均酶解6 h提取。

1.3.3.2 最佳酶解時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份樣品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)為1:12，pH=4.8，溫度45 ℃，加入纖維素酶體積分?jǐn)?shù)為1.0%的條件下，分別酶解4、6、8、10、12 h，提取膳食纖維。

1.3.3.3 纖維素酶最佳添加量的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份樣品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)為1:12，pH=4.8，溫度45 ℃，纖維素酶添加量體積分?jǐn)?shù)為0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的條件下，均酶解6 h。

1.3.2.4 最佳浸提次數(shù)的確定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5份樣品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)為1:12，pH=4.8，溫度45 ℃，加入纖維素酶添加量體積分?jǐn)?shù)為 0.2%的條件下，酶解6 h，分別提取1、2、3、4、5次。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察料液比、纖維素酶體積分?jǐn)?shù)、浸提次數(shù)和提取時(shí)間，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)SDF提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，根據(jù)SDF提取率優(yōu)化試驗(yàn)工藝，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5 忍冬藤SDF性能測(cè)定

1.3.4.1 持水力測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 g樣品，置于10 mL離心管中，加蒸餾水5 mL，室溫下浸泡24 h后，5 000 r/min離心5 min，傾去上層溶液，甩干水分，稱(chēng)重[4]。

(2)

1.3.4.2 膨脹力測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品100 mg于帶刻度的玻璃試管中，加蒸餾水5 mL。放置24 h ，不斷攪拌。觀察其自由膨脹體積，計(jì)算每克纖維素的膨脹體積[4]。

(3)

1.3.4.3 持油力

準(zhǔn)確稱(chēng)取干物料0.2 g，放入50 mL離心管中，加入豆油10 mL，混合均勻，密封后于37 ℃下靜置1 h，4 000 r/min離心15 min，棄上層油脂，稱(chēng)量剩余殘?jiān)臐裰豙5]。

(4)

1.3.4.4 陽(yáng)離子交換能力

37 ℃恒溫條件下，用0.1 mol/L HCl溶液浸置樣品24 h ，邊抽濾邊用蒸餾水洗去過(guò)量的酸，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%的AgNO3溶液鑒定至不含 Cl-為止，干燥樣品。稱(chēng)取250 mg干燥樣品，溶解于100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% NaCl溶液中，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，記錄pH，作VNaOH- pH曲線圖，以pH達(dá)到 7 時(shí)，每克樣品所消耗 0.1 mol/L NaOH來(lái)衡量陽(yáng)離子交換能力[6]。

(5)

1.3.4.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 mg DPPH溶解定容于50 mL容量瓶中，于冰箱中避光保存。將SDF配成系列濃度梯度(1～200 mg/L)，精密量取2 mL樣品溶液加入10 mL具塞試管中，再加入2 mL DPPH溶液，于30 ℃恒溫條件下避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度Ai。同等質(zhì)量濃度的抗壞血酸溶液作為陽(yáng)性對(duì)照(A0為2 mL DPPH+2 mL甲醇的吸光度，Aj為2 mL樣品溶液+2 mL甲醇的吸光度)。

(6)

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF提取的單因素分析

2.1.1最佳料液比的確定

由圖1可知，隨著料液比的增加，SDF提取率逐漸增加；當(dāng)料液比(g/mL)大于1:12以后，SDF提取率逐漸下降。這可能是由于隨著料液比的增加，單位面積內(nèi)底物與酶的有效接觸面積減少造成的。因此，確定纖維素酶酶解較佳的料液比(g/mL)為1:12。

2.1.2 最佳酶解時(shí)間的確定

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，SDF提取率逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間達(dá)6 h以后，其提取率下降。這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物的生成一定程度上抑制了反應(yīng)的進(jìn)行。因此確定最佳反應(yīng)時(shí)間為6 h。

圖1 不同料液比對(duì)SDF提取率的影響Fig.1 The effect of material to liquid ratio on yield of SDF

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)SDF提取率的影響Fig.2 The effect of enzymolysis time on yield of SDF

2.1.3 纖維素酶最佳添加量的確定

由圖3可知，在纖維素酶體積分?jǐn)?shù)為1.0 %的條件下SDF的提取率最高，纖維素酶體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，提取率顯著下降。這是因?yàn)樵诶w維素酶體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，SDF產(chǎn)量隨著纖維素酶的增加而增加；隨著纖維素酶增加到一定程度，酶解產(chǎn)物的增加抑制了SDF的降解，SDF 得率逐漸降低。因此，初步確定纖維素酶的最適加入體積分?jǐn)?shù)為1.0% 。

2.1.4 最佳浸提次數(shù)的確定

由圖4可知，提取率隨浸提次數(shù)增加而增大，浸提次數(shù)超過(guò)3次后提取率基本上無(wú)變化。

圖3 不同纖維素酶體積分?jǐn)?shù)對(duì)SDF提取率的影響Fig.3 The effect of cellulase volume fraction on the yield of SDF

圖4 浸提次數(shù)對(duì)SDF提取率的影響Fig.4 The effect ofextraction times on the yield of SDF

2.2 SDF提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，根據(jù)極差大小分析，各因素對(duì)SDF提取率的影響次序?yàn)椋築>A>D>C，即纖維素酶體積分?jǐn)?shù)大于料液比大于提取時(shí)間大于浸提次數(shù)。最佳提取工藝條件組合為A2B2C3D1，采用此最佳提取工藝，在料液比1:12(g/mL)、纖維素酶體積分?jǐn)?shù)1.2%、提取時(shí)間6 h的條件下，SDF的提取率為3.57%，較正交試驗(yàn)中最高浸提率得率3.36%有所提高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

注：*用SPSS16.0進(jìn)行方差分析，P<0.05；X1、X2、X3為同一水平提取率的平均值，R為極差。

2.3 忍冬藤SDF性能分析

SDF作為一種膳食纖維，所具有的理化性能是衡量其商品特性的重要指標(biāo)，影響其保健價(jià)值的大小。忍冬藤SDF性能見(jiàn)表3。

表3 忍冬藤SDF性能表

2.3.1 持水力和膨脹力

忍冬藤SDF因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羥基等親水基團(tuán)，能吸收相當(dāng)于自身質(zhì)量數(shù)倍的水分,因而具有較高的持水力，可增加人體排便的體積和速度[7]，從而減輕直腸內(nèi)和泌尿系統(tǒng)的壓力，對(duì)便秘、高血壓以及冠心病等有一定的預(yù)防和治療作用。SDF吸水膨脹后，對(duì)腸道產(chǎn)生容積作用，易引起飽腹感，對(duì)預(yù)防肥胖癥也大有益處。表3結(jié)果顯示，忍冬藤SDF的持水力為6.1 g/g，膨脹力為5.3 mL/g，吸水力和膨脹力較好，高于小麥膳食纖維[8]。

2.3.2 持油力

表3結(jié)果顯示，忍冬藤SDF持油力為4.53 g/g，與蘆筍老莖吸附油脂的能力接近，高于米糠膳食纖維的持油力[9]。

2.3.4 陽(yáng)離子交換能力

膳食纖維的陽(yáng)離子交換能力是指SDF在水溶液中離解出某些陽(yáng)離子，通過(guò)吸附溶液中原有的陽(yáng)離子來(lái)進(jìn)行離子交換，從而起到排毒、降血壓的生理功效。表3結(jié)果顯示，忍冬藤SDF的陽(yáng)離子交換能力為0.58 mmol/g，低于脫脂米糠膳食纖維陽(yáng)離子交換能力。

2.3.3 DPPH自由基清除率

由圖5可知，在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，忍冬藤SDF對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的升高而增大。質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，清除率為10.09%，最大清除率為80.13%。半數(shù)有效濃度(median effective concentration， EC50)低于10 g/L，表明其具有很好的抗氧化活性[10]。

圖5 DPPH自由基清除能力Fig.5 The DPPH Free radical scavenging capacity of SDF

3 討論

生物酶在各種動(dòng)植物中大量存在，是一種天然物質(zhì)，生物酶的作用條件溫和，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且提取率高，在天然產(chǎn)物的提取中備受青睞。本研究利用淀粉酶和糖化酶除去淀粉，然后調(diào)節(jié)pH，在堿性環(huán)境下除去蛋白質(zhì)，可加速蛋白質(zhì)堿解完全，利用纖維素酶提取膳食纖維，更加高效安全。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，影響忍冬藤中SDF提取率的因素依次為纖維素酶體積分?jǐn)?shù)大于料液比大于提取時(shí)間大于浸提次數(shù)。最佳工藝條件為pH=4.8，溫度45 ℃，料液比1:12(g/mL)，纖維素酶體積分?jǐn)?shù)1.2%，提取時(shí)間6 h，在此條件下，SDF的提取率為3.57%。

膳食纖維資源開(kāi)發(fā)的來(lái)源多種多樣，谷物、豆類(lèi)、水產(chǎn)、蔬菜和水果等均可提取膳食纖維[11]，其優(yōu)良的理化性質(zhì)可改善加工產(chǎn)品的品質(zhì)，并有較好的保健功能，燕麥、魔芋、菊苣、蘋(píng)果以及甜菜等中的SDF已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。忍冬藤SDF較高的持水力和膨脹力可以提高面團(tuán)的蓬松度，改善面粉品質(zhì)。持油力、陽(yáng)離子交換能力和DPPH自由基最大清除率都表明其保健價(jià)值較高。尤其是忍冬藤SDF具有的抗氧化性，是目前膳食纖維開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)方向，較高的抗氧化性與其自身具有的抗氧化性物質(zhì)如有機(jī)酚酸類(lèi)成分密不可分[12]。該研究可以豐富膳食纖維來(lái)源，提高忍冬的綜合利用價(jià)值，有利于促進(jìn)金銀花藥材的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.005

Extraction and property analysis of soluble dietary fiber from stems ofLonicerajaponica

GUO Feng-qian, HUANG Zu-shun, ZHU Bao-lei, LIU Qian*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶The optimal technology of extracting soluble dietary fiber (SDF) from stems ofLonicerajaponicaby cellulose method was investigated and the properties of SDF were also analyzed. Based on single-factor experiments, orthogonal experiments were performed to optimize the extractive conditions, and the results showed the optimum conditions were pH 4.8, at 45 ℃, 1∶12(g/mL)of material and water, cellulase 1.2% by volume, extracting for 6 h, 3 times.Under the above conditions, the yield of SDF was 3.57%, whose water holding capacity was 6.1 g/g, expansion force was 5.3 mL/g, oil holding capacity was 4.53 g/g, cation exchange capacity was 0.58 mmol/g, highest free radical scavenging rate on DPPH was 80.13%, and the SDF had excellent physical and chemical properties. The study indicated that the cellulose method can be used to extracting SDF from stems ofLonicerajaponica.

∶ stems ofLonicerajaponica; water soluble dietary fiber; cellulase; properties

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.004

2016-04-26

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GSF11903)；2015年度大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(SRT)(201510441023)

郭鳳倩(1993—)，女，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與質(zhì)量控制。

*通信作者，劉謙(1982—)，女，講師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與質(zhì)量控制。

R284.2

A

1002-4026(2017)02-0020-06