郭鳳倩，黃祖順，朱寶磊，劉謙

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

忍冬藤可溶性膳食纖維提取及性能分析

郭鳳倩，黃祖順，朱寶磊，劉謙*

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

探討纖維素酶法提取忍冬藤中水溶性纖維素的最佳工藝并對其性能進(jìn)行分析。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化得到最佳工藝條件組合為pH=4.8，溫度45 ℃，料液比1:12(g/mL)，纖維素酶體積分?jǐn)?shù)1.2%，提取時間6 h，浸提3次。在此條件下，水溶性膳食纖維的提取率為3.57%，所提取的水溶性纖維素持水力為6.1 g/g，膨脹力為5.3 mL/g，持油力為4.53 g/g，陽離子交換能力為0.58 mmol/g，DPPH自由基最大清除率為80.13%，具有較好的理化性能。研究認(rèn)為，纖維素酶解法可用于提取忍冬藤中的水溶性膳食纖維。

忍冬藤；水溶性膳食纖維；纖維素酶；性能

膳食纖維是一種復(fù)雜的混合物的總稱，具有多種生理功能，可預(yù)防痔瘡、直腸癌、結(jié)腸癌、糖尿病、乳腺癌和肥胖癥等癥，被列為繼糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水、礦物質(zhì)和維生素之后的“第七營養(yǎng)素”[1]。膳食纖維主要存在于大部分谷物、水果和蔬菜中，分為水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber， SDF)和水不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber ，IDF)。SDF存在于果膠和凝膠中，為半纖維素多糖，易被腸道微生物所用。IDF存在于植物細(xì)胞壁中，為纖維素、木質(zhì)素和半纖維素，有利于促進(jìn)腸道蠕動，幫助消化。

忍冬藤為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)干燥的藤莖?！侗静菥V目》載“忍冬，莖葉及花，功用皆同”，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效。目前山東省金銀花藥材年產(chǎn)量達(dá)2萬噸，忍冬藤產(chǎn)量至少10萬噸。目前忍冬藤主要用于飼料加工、直接喂養(yǎng)牲畜或次生代謝成分提取，用于提取次生代謝物質(zhì)的忍冬藤纖維素部分作為廢棄物。利用忍冬藤SDF作為膳食纖維可以提高忍冬藤的利用率，提升忍冬藥材的附加值。本試驗參照國內(nèi)多采用的化學(xué)-酶法相結(jié)合的提取膳食纖維方法[2]，以忍冬藤為原料，采用纖維素酶水解法從忍冬藤中提取SDF，并優(yōu)化了提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

忍冬藤：采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)張永清教授鑒定為忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的藤莖，105～120 ℃殺青，60 ℃下干燥 48 h，粉碎，過40目篩，備用。

試劑：α-淀粉酶(A109181-100g)、糖化酶(液化型 104U/mL)、纖維素酶C109262-5g(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH分析純，和光純藥工業(yè)株式會社)；乙醇、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸銀、水楊酸、硫酸亞特、雙氧水、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液等均為分析純；豆油。

1.2 儀器與設(shè)備

微型植物粉碎機(長沙市雨花區(qū)中誠制藥機械廠)；PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；TDZ4-MS低速離心機(長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司)；SHZ-D(III) 循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪高科儀器廠)；恒溫水浴鍋(功率15 kW,常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器廠)；202-00S恒溫干燥箱(長沙科儀儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 忍冬藤SDF提取工藝

1.3.1 工藝流程

準(zhǔn)確稱取忍冬藤粉末(過40目篩)3.0 g，以蒸餾水為溶劑，加入α-淀粉酶，調(diào)節(jié)pH，60 ℃恒溫水浴酶解，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH，加入糖化酶，45 ℃恒溫水浴酶解，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH，加入纖維素酶，45 ℃恒溫水浴酶解[3]，真空抽濾，4 000 r/min離心，濃縮，加入4倍量體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇醇析8 h，離心，傾去上清液，80～90 ℃干燥，得到SDF。

1.3.2 忍冬藤SDF提取率的計算

(1)

1.3.3 試驗設(shè)計

以忍冬藤SDF提取率為指標(biāo)，主要考察料液比、纖維素酶體積分?jǐn)?shù)、酶解時間和浸提次數(shù)對SDF提取率的影響，根據(jù)公式(1)計算SDF，每個因素試驗重復(fù)3次，所得結(jié)果取平均值。

1.3.3.1 最佳料液比的確定

準(zhǔn)確稱取5份樣品，每份3.0 g，在pH=4.8，溫度45 ℃，加入纖維素酶體積分?jǐn)?shù)分別為1.0%的條件下，料液比(g/mL)分別設(shè)為1:9、1:12、1:15、1:17、1:25，均酶解6 h提取。

1.3.3.2 最佳酶解時間的確定

準(zhǔn)確稱取5份樣品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)為1:12，pH=4.8，溫度45 ℃，加入纖維素酶體積分?jǐn)?shù)為1.0%的條件下，分別酶解4、6、8、10、12 h，提取膳食纖維。

1.3.3.3 纖維素酶最佳添加量的確定

準(zhǔn)確稱取5份樣品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)為1:12，pH=4.8，溫度45 ℃，纖維素酶添加量體積分?jǐn)?shù)為0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的條件下，均酶解6 h。

1.3.2.4 最佳浸提次數(shù)的確定

準(zhǔn)確稱取5份樣品，每份3.0 g，在料液比(g/mL)為1:12，pH=4.8，溫度45 ℃，加入纖維素酶添加量體積分?jǐn)?shù)為 0.2%的條件下，酶解6 h，分別提取1、2、3、4、5次。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

考察料液比、纖維素酶體積分?jǐn)?shù)、浸提次數(shù)和提取時間，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對SDF提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化，每個因素設(shè)置3個水平，根據(jù)SDF提取率優(yōu)化試驗工藝，見表1。

表1 正交試驗設(shè)計

1.3.5 忍冬藤SDF性能測定

1.3.4.1 持水力測定

準(zhǔn)確稱取0.100 g樣品，置于10 mL離心管中，加蒸餾水5 mL，室溫下浸泡24 h后，5 000 r/min離心5 min，傾去上層溶液，甩干水分，稱重[4]。

(2)

1.3.4.2 膨脹力測定

準(zhǔn)確稱取樣品100 mg于帶刻度的玻璃試管中，加蒸餾水5 mL。放置24 h ，不斷攪拌。觀察其自由膨脹體積，計算每克纖維素的膨脹體積[4]。

(3)

1.3.4.3 持油力

準(zhǔn)確稱取干物料0.2 g，放入50 mL離心管中，加入豆油10 mL，混合均勻，密封后于37 ℃下靜置1 h，4 000 r/min離心15 min，棄上層油脂，稱量剩余殘渣的濕重[5]。

(4)

1.3.4.4 陽離子交換能力

37 ℃恒溫條件下，用0.1 mol/L HCl溶液浸置樣品24 h ，邊抽濾邊用蒸餾水洗去過量的酸，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%的AgNO3溶液鑒定至不含 Cl-為止，干燥樣品。稱取250 mg干燥樣品，溶解于100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% NaCl溶液中，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定，記錄pH，作VNaOH- pH曲線圖，以pH達(dá)到 7 時，每克樣品所消耗 0.1 mol/L NaOH來衡量陽離子交換能力[6]。

(5)

1.3.4.5 DPPH自由基清除能力的測定

準(zhǔn)確稱取2.0 mg DPPH溶解定容于50 mL容量瓶中，于冰箱中避光保存。將SDF配成系列濃度梯度(1～200 mg/L)，精密量取2 mL樣品溶液加入10 mL具塞試管中，再加入2 mL DPPH溶液，于30 ℃恒溫條件下避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后于517 nm波長下測定吸光度Ai。同等質(zhì)量濃度的抗壞血酸溶液作為陽性對照(A0為2 mL DPPH+2 mL甲醇的吸光度，Aj為2 mL樣品溶液+2 mL甲醇的吸光度)。

(6)

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF提取的單因素分析

2.1.1最佳料液比的確定

由圖1可知，隨著料液比的增加，SDF提取率逐漸增加；當(dāng)料液比(g/mL)大于1:12以后，SDF提取率逐漸下降。這可能是由于隨著料液比的增加，單位面積內(nèi)底物與酶的有效接觸面積減少造成的。因此，確定纖維素酶酶解較佳的料液比(g/mL)為1:12。

2.1.2 最佳酶解時間的確定

由圖2可知，隨著反應(yīng)時間的增加，SDF提取率逐漸增加，反應(yīng)時間達(dá)6 h以后，其提取率下降。這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物的生成一定程度上抑制了反應(yīng)的進(jìn)行。因此確定最佳反應(yīng)時間為6 h。

圖1 不同料液比對SDF提取率的影響Fig.1 The effect of material to liquid ratio on yield of SDF

圖2 不同酶解時間對SDF提取率的影響Fig.2 The effect of enzymolysis time on yield of SDF

2.1.3 纖維素酶最佳添加量的確定

由圖3可知，在纖維素酶體積分?jǐn)?shù)為1.0 %的條件下SDF的提取率最高，纖維素酶體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，提取率顯著下降。這是因為在纖維素酶體積分?jǐn)?shù)較低時，SDF產(chǎn)量隨著纖維素酶的增加而增加；隨著纖維素酶增加到一定程度，酶解產(chǎn)物的增加抑制了SDF的降解，SDF 得率逐漸降低。因此，初步確定纖維素酶的最適加入體積分?jǐn)?shù)為1.0% 。

2.1.4 最佳浸提次數(shù)的確定

由圖4可知，提取率隨浸提次數(shù)增加而增大，浸提次數(shù)超過3次后提取率基本上無變化。

圖3 不同纖維素酶體積分?jǐn)?shù)對SDF提取率的影響Fig.3 The effect of cellulase volume fraction on the yield of SDF

圖4 浸提次數(shù)對SDF提取率的影響Fig.4 The effect ofextraction times on the yield of SDF

2.2 SDF提取的正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知，根據(jù)極差大小分析，各因素對SDF提取率的影響次序為：B>A>D>C，即纖維素酶體積分?jǐn)?shù)大于料液比大于提取時間大于浸提次數(shù)。最佳提取工藝條件組合為A2B2C3D1，采用此最佳提取工藝，在料液比1:12(g/mL)、纖維素酶體積分?jǐn)?shù)1.2%、提取時間6 h的條件下，SDF的提取率為3.57%，較正交試驗中最高浸提率得率3.36%有所提高。

表2 正交試驗結(jié)果及分析

注：*用SPSS16.0進(jìn)行方差分析，P<0.05；X1、X2、X3為同一水平提取率的平均值，R為極差。

2.3 忍冬藤SDF性能分析

SDF作為一種膳食纖維，所具有的理化性能是衡量其商品特性的重要指標(biāo)，影響其保健價值的大小。忍冬藤SDF性能見表3。

表3 忍冬藤SDF性能表

2.3.1 持水力和膨脹力

忍冬藤SDF因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羥基等親水基團(tuán)，能吸收相當(dāng)于自身質(zhì)量數(shù)倍的水分,因而具有較高的持水力，可增加人體排便的體積和速度[7]，從而減輕直腸內(nèi)和泌尿系統(tǒng)的壓力，對便秘、高血壓以及冠心病等有一定的預(yù)防和治療作用。SDF吸水膨脹后，對腸道產(chǎn)生容積作用，易引起飽腹感，對預(yù)防肥胖癥也大有益處。表3結(jié)果顯示，忍冬藤SDF的持水力為6.1 g/g，膨脹力為5.3 mL/g，吸水力和膨脹力較好，高于小麥膳食纖維[8]。

2.3.2 持油力

表3結(jié)果顯示，忍冬藤SDF持油力為4.53 g/g，與蘆筍老莖吸附油脂的能力接近，高于米糠膳食纖維的持油力[9]。

2.3.4 陽離子交換能力

膳食纖維的陽離子交換能力是指SDF在水溶液中離解出某些陽離子，通過吸附溶液中原有的陽離子來進(jìn)行離子交換，從而起到排毒、降血壓的生理功效。表3結(jié)果顯示，忍冬藤SDF的陽離子交換能力為0.58 mmol/g，低于脫脂米糠膳食纖維陽離子交換能力。

2.3.3 DPPH自由基清除率

由圖5可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，忍冬藤SDF對DPPH自由基的清除率隨濃度的升高而增大。質(zhì)量濃度為1 g/L時，清除率為10.09%，最大清除率為80.13%。半數(shù)有效濃度(median effective concentration， EC50)低于10 g/L，表明其具有很好的抗氧化活性[10]。

圖5 DPPH自由基清除能力Fig.5 The DPPH Free radical scavenging capacity of SDF

3 討論

生物酶在各種動植物中大量存在，是一種天然物質(zhì)，生物酶的作用條件溫和，經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且提取率高，在天然產(chǎn)物的提取中備受青睞。本研究利用淀粉酶和糖化酶除去淀粉，然后調(diào)節(jié)pH，在堿性環(huán)境下除去蛋白質(zhì)，可加速蛋白質(zhì)堿解完全，利用纖維素酶提取膳食纖維，更加高效安全。通過單因素試驗和正交試驗分析，影響忍冬藤中SDF提取率的因素依次為纖維素酶體積分?jǐn)?shù)大于料液比大于提取時間大于浸提次數(shù)。最佳工藝條件為pH=4.8，溫度45 ℃，料液比1:12(g/mL)，纖維素酶體積分?jǐn)?shù)1.2%，提取時間6 h，在此條件下，SDF的提取率為3.57%。

膳食纖維資源開發(fā)的來源多種多樣，谷物、豆類、水產(chǎn)、蔬菜和水果等均可提取膳食纖維[11]，其優(yōu)良的理化性質(zhì)可改善加工產(chǎn)品的品質(zhì)，并有較好的保健功能，燕麥、魔芋、菊苣、蘋果以及甜菜等中的SDF已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。忍冬藤SDF較高的持水力和膨脹力可以提高面團(tuán)的蓬松度，改善面粉品質(zhì)。持油力、陽離子交換能力和DPPH自由基最大清除率都表明其保健價值較高。尤其是忍冬藤SDF具有的抗氧化性，是目前膳食纖維開發(fā)的熱點方向，較高的抗氧化性與其自身具有的抗氧化性物質(zhì)如有機酚酸類成分密不可分[12]。該研究可以豐富膳食纖維來源，提高忍冬的綜合利用價值，有利于促進(jìn)金銀花藥材的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.005

Extraction and property analysis of soluble dietary fiber from stems ofLonicerajaponica

GUO Feng-qian, HUANG Zu-shun, ZHU Bao-lei, LIU Qian*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶The optimal technology of extracting soluble dietary fiber (SDF) from stems ofLonicerajaponicaby cellulose method was investigated and the properties of SDF were also analyzed. Based on single-factor experiments, orthogonal experiments were performed to optimize the extractive conditions, and the results showed the optimum conditions were pH 4.8, at 45 ℃, 1∶12(g/mL)of material and water, cellulase 1.2% by volume, extracting for 6 h, 3 times.Under the above conditions, the yield of SDF was 3.57%, whose water holding capacity was 6.1 g/g, expansion force was 5.3 mL/g, oil holding capacity was 4.53 g/g, cation exchange capacity was 0.58 mmol/g, highest free radical scavenging rate on DPPH was 80.13%, and the SDF had excellent physical and chemical properties. The study indicated that the cellulose method can be used to extracting SDF from stems ofLonicerajaponica.

∶ stems ofLonicerajaponica; water soluble dietary fiber; cellulase; properties

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.004

2016-04-26

山東省科技發(fā)展計劃(2014GSF11903)；2015年度大學(xué)生研究訓(xùn)練計劃(SRT)(201510441023)

郭鳳倩(1993—)，女，研究方向為中藥資源與質(zhì)量控制。

*通信作者，劉謙(1982—)，女，講師，研究方向為中藥資源與質(zhì)量控制。

R284.2

A

1002-4026(2017)02-0020-06