王讓劍，楊 軍，孔祥瑞，陳常頌*，余文權(quán)

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福建 福州 350000)

茶樹世代周期長，是多年生異花授粉木本作物，多為二倍體，基因組大小約為3.02G且高度雜合[1]。目前茶樹新品種選育的主要方法仍然是常規(guī)育種法，包括選擇育種和有性雜交，該方法工作量大、效率低、時間長，已難以適應(yīng)快速發(fā)展的市場對多樣化茶樹品種的客觀需求。分子標記輔助選擇(Marker Assisted Selection，MAS)可顯著提高育種效率，已成為作物遺傳育種領(lǐng)域的研究重點。發(fā)掘與茶樹優(yōu)良經(jīng)濟性狀緊密連鎖的分子標記是開展茶樹分子標記輔助選擇育種的基礎(chǔ)，目前主要依靠QTL作圖(Quantitative Trait Loci Mapping)與關(guān)聯(lián)作圖(Association Mapping)兩種方法。近年來茶樹QTL作圖與關(guān)聯(lián)作圖相關(guān)研究正有條不紊的開展，本文擬簡述QTL作圖和關(guān)聯(lián)作圖在茶樹分子標記輔助選擇研究中的進展及存在的問題，并對其發(fā)展趨勢進行展望。

1 茶樹QTL作圖研究進展

1.1 茶樹遺傳圖譜構(gòu)建

構(gòu)建遺傳圖譜的關(guān)鍵步驟是建立合適的遺傳作圖群體及選擇合適的圖譜構(gòu)建方法。茶樹世代周期長、人工雜交結(jié)實率低，難以得到像水稻等一年生作物用于構(gòu)建遺傳圖譜的BC群體(回交群體)、NIL群體(近等基因系群體)；茶樹自交不親和，也很難得到F2群體、RIL群體(重組自交系群體)，因而基于上述群體的作圖理論均無法直接應(yīng)用于茶樹遺傳圖譜構(gòu)建。茶樹遺傳組成高度雜合，許多遺傳位點在F1代即發(fā)生分離，因此一般利用F1群體基于“擬測交”(Pseudo Testcross)方法構(gòu)建遺傳圖譜[2]，該方法在林木等多年生作物遺傳圖譜構(gòu)建中應(yīng)用較多[3-4]。

茶樹遺傳圖譜研究起步相對較晚，但隨著“擬測交”方法的應(yīng)用以及DNA分子標記技術(shù)的發(fā)展，茶樹分子遺傳圖譜的構(gòu)建工作得以逐步進行。從已發(fā)表的茶樹遺傳圖譜來看，其是伴隨茶樹分子標記發(fā)展的進程逐漸展開的，具有較明顯的代際界線(見表1)。起初，茶樹分子標記的開發(fā)是從顯性標記開始的，因此早期茶樹遺傳圖譜構(gòu)建以RAPD等顯性標記為主，雖然這類標記無需知曉基因組的序列信息，操作簡便，可迅速作圖，但這類標記是對基因組的隨機擴增，穩(wěn)定性較差，很難實際應(yīng)用，且其擴增片段多位于基因組的非編碼區(qū)，不能直接用于分離目的基因。隨后，由于SSR標記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強、共顯性的特點，在茶樹遺傳研究中備受青睞，伴隨茶樹SSR標記開發(fā)的逐漸深入，茶樹遺傳圖譜的構(gòu)建逐漸以SSR標記為主，但SSR標記需要對其多態(tài)性進行驗證，開發(fā)成本較高，費時費力。近年來，隨著功能基因組研究的逐步開展，茶樹基因組與轉(zhuǎn)錄組大規(guī)模測序成為現(xiàn)實，獲得大量的SNP標記已比較容易。SNP標記具有高分型效率、數(shù)量巨大、全基因組覆蓋、分析簡單、成本較低等特點，可以預(yù)測SNP標記將會成為今后茶樹遺傳圖譜構(gòu)建的主要分子標記。

1.2 茶樹QTL定位

進行QTL定位的遺傳圖譜，其標記的平均圖距宜在10 cM以下，倘開展基因圖位克隆研究，則目標區(qū)域的平均圖距應(yīng)在1 cM 以下[21-24]。早期構(gòu)建的茶樹遺傳圖譜其密度基本達不到要求，且均勻性不好，因此難以開展QTL定位工作。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的進一步發(fā)展及測序成本的持續(xù)降低，利用SSR、SNP等共顯性標記構(gòu)建符合QTL定位要求的茶樹遺傳連鎖圖譜已陸續(xù)報道出來，有關(guān)茶葉芽葉性狀、兒茶素含量、抗病(蟲)性狀等QTL定位工作正穩(wěn)步推進，并且取得了一些階段性的成果，這為開展茶樹分子標記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

Tan等[15]利用茶樹花轉(zhuǎn)錄組開發(fā)了2439個SSR標記并驗證了其中的720個，成功開發(fā)出431個SSR標記，利用其中的237個標記對龍井43(♀)×白毫早(♂)的F1群體構(gòu)建了一張茶樹遺傳圖譜，包括15個連鎖群，總圖距為1156.9 cM，標記間平均距離為5.2 cM。隨后，該課題組繼續(xù)整合483個SSR標記，利用上述群體重新構(gòu)建了一張圖譜，包括15個連鎖群，總圖距為1226.2 cM，標記間平均距離為2.5 cM，且定位了15個與春茶萌芽期，嫩梢顏色，成熟葉長，成熟葉寬以及葉形指數(shù)相關(guān)的QTL[19]。Ma等[16]使用406個SSR標記，運用“擬測交”策略對迎霜(♀)×北躍(♂)單株的F1群體構(gòu)建了一張茶樹遺傳圖譜，包含15個連鎖群，總圖距為1143.5 cM，標記間平均距離為2.9 cM，定位了25個與兒茶素含量相關(guān)的QTL，其中9個QTL年份之間表現(xiàn)穩(wěn)定，分布在LG03、LG11、LG12、LG15等連鎖群上，每個QTL對群體變異的解釋率在2.4%～71.0%之間。隨后，該課題組又利用SLAF-seq簡化基因組測序技術(shù)開發(fā)了茶樹SNP標記，并利用6042個SNP標記對前期構(gòu)建的圖譜進行了加密，最終構(gòu)建的圖譜包括6448個標記，總圖距為3965 cM，標記之間平均遺傳距離為1.0 cM，該圖譜是第一個基于SNP標記的茶樹遺傳圖譜，也是目前最飽和的一張圖譜[18]。徐禮羿[20]等以烏牛早(♀)×龍井43(♂)的F1群體，構(gòu)建了一張雙親整合的遺傳圖譜，該圖譜擁有16個連鎖群，包含175個SSR標記，圖譜總長為1165.4 cM，平均圖距6.7 cM。在LG03、LG06、LGll、LGl3連鎖群上共檢測到4個的茶橙癭螨抗性QTL，單個QTL的表型變異貢獻率的變幅為7.2%～13.0%，且LG11存在1個控制茶橙癭螨抗性的主效QTL，變異貢獻率為13.0%。在LG01、LG04、LG06共檢測到4個的日灼病抗性QTL，單個QTL的表型變異貢獻率的變幅為6.9%～69.8%，且LG01和LG04各存在1個茶日灼病抗性相關(guān)的主效QTL，變異貢獻率分別為16.5%、69.8%。在LG03、LG06、LG08、LG10、LG13、LG15連鎖群上共檢測到8個的炭疽病抗性QTL，單個QTL的表型變異貢獻率的變幅為5.6%～13.8%，且LG10存在1個茶炭疽病抗性相關(guān)的主效QTL，變異貢獻率分別為13.8%。

2 茶樹關(guān)聯(lián)作圖研究進展

關(guān)聯(lián)作圖是以自然群體為研究對象，以長期重組后保留下來的標記基因間連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)為依據(jù)，將目標性狀表型的多樣性與標記基因型的多態(tài)性結(jié)合分析，可直接鑒定出與表型變異密切相關(guān)的標記基因位點[25-26]。相比QTL作圖，關(guān)聯(lián)作圖不用構(gòu)建人工雜交的作圖群體，而且不存在QTL作圖時兩親本基因型的限制，可同時檢測同一座位的多個等位變異，并且定位更精確，甚至可以達到單基因的水準[27]。關(guān)聯(lián)作圖主要包括全基因組關(guān)聯(lián)作圖和候選基因關(guān)聯(lián)作圖兩種方法。

表1 已構(gòu)建的茶樹遺傳圖譜

注：“-”表示沒有。

2.1 全基因組關(guān)聯(lián)作圖

當(dāng)選取的標記數(shù)目可以覆蓋全基因組時，即可定位到所有影響表型的QTL，這種方法稱為全基因組關(guān)聯(lián)作圖，該方法所需標記的數(shù)目取決于物種的基因組大小以及LD水平，物種基因組大小相近時，LD衰減速度慢的物種所需標記少，其定位精度比衰減速度快的物種低[28]。

隨著SSR等標記的快速發(fā)展，茶樹全基因組關(guān)聯(lián)作圖研究開始了一些積極的嘗試。姚明哲等[29]利用自主開發(fā)的55個EST-SSR標記對112份茶樹品種(系)進行了基因分型，通過關(guān)聯(lián)分析共鑒定出5個與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的EST-SSR標記(P<0.01)，其中標記CS298、CS317、CS84分別與一芽二葉百芽重(BW)、葉片長度(LL)和茶多酚含量(TP)顯著關(guān)聯(lián)，對表型變異的解釋率分別為0.11、0.15和0.35；標記CS330和CS338均與咖啡堿含量(CAF)顯著關(guān)聯(lián)，對表型變異的解釋率分別為0.14和0.15。喬婷婷等[30]在110 個EST-SSR標記中共檢測到4656個成對位點組合存在連鎖不平衡(LD)，占所有可能成對位點組合的38.8%，其中301個成對位點組合存在較高程度的連鎖不平衡，39個標記與累計15個性狀表現(xiàn)為極顯著。蘇會[31]利用EST-SSR標記對豫南茶區(qū)115個茶樹種質(zhì)進行了標記基因型分型，并將標記與茶品質(zhì)相關(guān)性狀進行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，67對EST-SSR組成的共2211對成對位點組合中，259個成對位點連鎖不平衡程度較高，占所有位點的11.71%。當(dāng)K=4時，模型后驗概率LnP(D)最大，群體被分為四個亞群。與水浸出物關(guān)聯(lián)的標記有5個，其中TM066解釋率最高，為13.32%；與茶多酚關(guān)聯(lián)的標記有5個，其中TM092解釋率最高，為13.68%；與氨基酸關(guān)聯(lián)的標記有6個，其中TM083解釋率最高，為7.6%；與咖啡堿關(guān)聯(lián)的標記有3個，其中TM111解釋率最高，為7.8%；TM066、TM092、TM074-2與水浸出物、茶多酚同時關(guān)聯(lián)；TM086-1與茶多酚、氨基酸同時關(guān)聯(lián)；TM088、TM111、TM124與氨基酸，咖啡堿同時關(guān)聯(lián)。

2.2 候選基因關(guān)聯(lián)作圖

當(dāng)主效基因或者質(zhì)量性狀基因?qū)Ρ硇陀袥Q定性的影響，甚至單個堿基的變異亦可決定表型時，對可能影響表型性狀的部分基因組區(qū)段進行關(guān)聯(lián)分析，不用過多的基因型分析工作即可定位目的基因，這種方法稱候選基因關(guān)聯(lián)作圖。應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)作圖方法研究LD衰減速度快的作物時，標記與QTL處于LD狀態(tài)的概率相對較低，定位到目標基因的概率相對較小，這時采用候選基因關(guān)聯(lián)作圖法對這類作物進行分析效果更好[32]。利用候選基因關(guān)聯(lián)作圖法可鑒定到影響表型的基因組區(qū)段的多態(tài)性，并可估計其效應(yīng)值，因此該方法可對特定基因的等位變異是否控制目標性狀進行進一步驗證，從而發(fā)掘出優(yōu)異的等位基因[33-36]。候選基因關(guān)聯(lián)作圖法由于具有實驗的目的性更明確，基因型分析成本更低等優(yōu)點，因此備受研究者青睞。候選基因的選擇主要包括生理生化途徑中重要的功能基因、QTL研究定位區(qū)域所含的基因以及近緣物種研究中效應(yīng)較大的同源基因等[37-42]。

茶樹候選基因關(guān)聯(lián)作圖研究亦開始了一些積極的探索。Jin等[43]利用候選基因關(guān)聯(lián)作圖法研究了咖啡堿合成酶Ⅰ與咖啡堿含量之間的遺傳關(guān)系，通過對咖啡堿合成酶Ⅰ基因重測序從44個茶樹種質(zhì)資源中共鑒定出87個SNP，從序列變異中鑒定出2個CAPS標記，其中SNP4318在4個環(huán)境中與咖啡堿含量相關(guān)，表型變異結(jié)實率為4.0%～7.7%。隨后，該課題組又運用混合分離轉(zhuǎn)錄組測序(BSA-Seq)及候選基因關(guān)聯(lián)作圖法，在茶樹中鑒定出了一個影響兒茶素合成的重要功能基因類黃酮3’,5’-羥化酶基因(F3’5’H)，該基因位點有10個SNP標記與兒茶素指數(shù)CI、兒茶素組分含量、兒茶素總量等性狀顯著相關(guān)，并且基于F3’5’H中的SNP848標記開發(fā)了一個能鑒定和篩選高二羥基兒茶素茶樹資源的功能標記[44]。該項研究為今后茶樹重要性狀的遺傳解析及功能性分子標記開發(fā)提供了新的思路(如圖1所示)。

圖1 茶樹重要性狀遺傳解析流程圖Fig.1 Strategic procedure for analyzing critical genetic traits of tea plants

3 存在的問題與展望

3.1 茶樹QTL作圖

當(dāng)前多種作物在QTL作圖方面已經(jīng)取得了重要進展[45-47]，并成功地應(yīng)用于主效基因的導(dǎo)入和聚合，育成的水稻、玉米、大豆等大田作物品種亦在生產(chǎn)上得到了應(yīng)用[48-50]，相較而言，茶樹QTL作圖研究尚處起步階段，利用該方法開展標記輔助選擇育種研究面臨著巨大的挑戰(zhàn)。具體表現(xiàn)在：(1)茶樹人工雜交周期長，從授粉到果實成熟需要1年時間，結(jié)實率非常低，目前用于構(gòu)建茶樹遺傳圖譜所用的群體均不超過200個個體，難以滿足構(gòu)建高密度遺傳圖譜對群體數(shù)目的要求。研究表明，當(dāng)作圖群體大小一定，僅靠增加標記數(shù)量并不能提高QTL作圖的效率，只有群體個數(shù)達到400個以上時，檢測到的QTL效應(yīng)才趨于穩(wěn)定[51]。(2)已構(gòu)建的多數(shù)茶樹遺傳圖譜選擇材料構(gòu)建群體時，考慮較多的是圖譜繪制，而在實際育種應(yīng)用上考慮得較少，且選用的作圖群體不盡相同、標記類型多樣，很難將多個圖譜整合加以利用，此外，多數(shù)遺傳圖譜使用的標記為RAPD、AFLP等顯性標記，重現(xiàn)性和保守性較差，遠遠達不到標記輔助選擇育種的要求。(3)茶樹遺傳基礎(chǔ)研究相對薄弱，例如：茶樹性狀的遺傳力、性狀之間的上位性效應(yīng)以及QTL與環(huán)境互作等方面的研究基本處于空白階段，這就會導(dǎo)致一些QTL效應(yīng)估計不準確或QTL檢測不到，進而對QTL定位的準確性產(chǎn)生較大的影響。

3.2 茶樹關(guān)聯(lián)作圖

關(guān)聯(lián)作圖法雖然具有不用構(gòu)建人工雜交的作圖群體，可同時對多個等位基因進行分析，定位QTL精度更高等優(yōu)點，但關(guān)聯(lián)作圖法亦存在一些缺陷。具體表現(xiàn)在：(1)關(guān)聯(lián)作圖群體中的LD受到遺傳漂變、群體結(jié)構(gòu)以及自然選擇等諸多因素的影響，因此一些無關(guān)等位基因亦可與QTL形成LD，從而表現(xiàn)出與性狀的偽關(guān)聯(lián)或假陽性。研究表明，群體結(jié)構(gòu)可解釋表型性狀中約9.3%的變異[52]。(2)關(guān)聯(lián)作圖雖對QTL的檢測能力較高，但不能估計QTL在染色體上的具體位置及其加性、上位性效應(yīng)，因此關(guān)聯(lián)作圖結(jié)合QTL作圖結(jié)果一起分析效果才更好。

3.3 展望

利用QTL作圖及關(guān)聯(lián)作圖開展茶樹分子標記輔助育種研究，今后應(yīng)加強以下工作：(1)在親本選配時，盡量選擇與育種直接相關(guān)的材料，構(gòu)建的群體盡量做到既是遺傳研究群體，也是育種群體，縮短QTL定位研究與育種實際應(yīng)用的距離。(2)根據(jù)育種目標，選擇合適的QTL作圖群體及分子標記類型，構(gòu)建高密度的茶樹飽和遺傳圖譜，開展QTL精細定位與QTL克隆研究。(3)廣泛收集、保存、鑒定各類茶樹種質(zhì)資源，開展茶樹基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及生物信息學(xué)研究，加強茶樹次生代謝物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)及其重要功能基因研究。(4)相關(guān)單位協(xié)作，加強茶樹性狀的遺傳力，QTL與QTL間、QTL與環(huán)境間的互作研究等。

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