王讓劍，楊 軍，孔祥瑞，陳常頌*，余文權(quán)

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福建 福州 350000)

茶樹世代周期長(zhǎng)，是多年生異花授粉木本作物，多為二倍體，基因組大小約為3.02G且高度雜合[1]。目前茶樹新品種選育的主要方法仍然是常規(guī)育種法，包括選擇育種和有性雜交，該方法工作量大、效率低、時(shí)間長(zhǎng)，已難以適應(yīng)快速發(fā)展的市場(chǎng)對(duì)多樣化茶樹品種的客觀需求。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker Assisted Selection，MAS)可顯著提高育種效率，已成為作物遺傳育種領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。發(fā)掘與茶樹優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記是開展茶樹分子標(biāo)記輔助選擇育種的基礎(chǔ)，目前主要依靠QTL作圖(Quantitative Trait Loci Mapping)與關(guān)聯(lián)作圖(Association Mapping)兩種方法。近年來(lái)茶樹QTL作圖與關(guān)聯(lián)作圖相關(guān)研究正有條不紊的開展，本文擬簡(jiǎn)述QTL作圖和關(guān)聯(lián)作圖在茶樹分子標(biāo)記輔助選擇研究中的進(jìn)展及存在的問(wèn)題，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 茶樹QTL作圖研究進(jìn)展

1.1 茶樹遺傳圖譜構(gòu)建

構(gòu)建遺傳圖譜的關(guān)鍵步驟是建立合適的遺傳作圖群體及選擇合適的圖譜構(gòu)建方法。茶樹世代周期長(zhǎng)、人工雜交結(jié)實(shí)率低，難以得到像水稻等一年生作物用于構(gòu)建遺傳圖譜的BC群體(回交群體)、NIL群體(近等基因系群體)；茶樹自交不親和，也很難得到F2群體、RIL群體(重組自交系群體)，因而基于上述群體的作圖理論均無(wú)法直接應(yīng)用于茶樹遺傳圖譜構(gòu)建。茶樹遺傳組成高度雜合，許多遺傳位點(diǎn)在F1代即發(fā)生分離，因此一般利用F1群體基于“擬測(cè)交”(Pseudo Testcross)方法構(gòu)建遺傳圖譜[2]，該方法在林木等多年生作物遺傳圖譜構(gòu)建中應(yīng)用較多[3-4]。

茶樹遺傳圖譜研究起步相對(duì)較晚，但隨著“擬測(cè)交”方法的應(yīng)用以及DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，茶樹分子遺傳圖譜的構(gòu)建工作得以逐步進(jìn)行。從已發(fā)表的茶樹遺傳圖譜來(lái)看，其是伴隨茶樹分子標(biāo)記發(fā)展的進(jìn)程逐漸展開的，具有較明顯的代際界線(見(jiàn)表1)。起初，茶樹分子標(biāo)記的開發(fā)是從顯性標(biāo)記開始的，因此早期茶樹遺傳圖譜構(gòu)建以RAPD等顯性標(biāo)記為主，雖然這類標(biāo)記無(wú)需知曉基因組的序列信息，操作簡(jiǎn)便，可迅速作圖，但這類標(biāo)記是對(duì)基因組的隨機(jī)擴(kuò)增，穩(wěn)定性較差，很難實(shí)際應(yīng)用，且其擴(kuò)增片段多位于基因組的非編碼區(qū)，不能直接用于分離目的基因。隨后，由于SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、共顯性的特點(diǎn)，在茶樹遺傳研究中備受青睞，伴隨茶樹SSR標(biāo)記開發(fā)的逐漸深入，茶樹遺傳圖譜的構(gòu)建逐漸以SSR標(biāo)記為主，但SSR標(biāo)記需要對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證，開發(fā)成本較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來(lái)，隨著功能基因組研究的逐步開展，茶樹基因組與轉(zhuǎn)錄組大規(guī)模測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)，獲得大量的SNP標(biāo)記已比較容易。SNP標(biāo)記具有高分型效率、數(shù)量巨大、全基因組覆蓋、分析簡(jiǎn)單、成本較低等特點(diǎn)，可以預(yù)測(cè)SNP標(biāo)記將會(huì)成為今后茶樹遺傳圖譜構(gòu)建的主要分子標(biāo)記。

1.2 茶樹QTL定位

進(jìn)行QTL定位的遺傳圖譜，其標(biāo)記的平均圖距宜在10 cM以下，倘開展基因圖位克隆研究，則目標(biāo)區(qū)域的平均圖距應(yīng)在1 cM 以下[21-24]。早期構(gòu)建的茶樹遺傳圖譜其密度基本達(dá)不到要求，且均勻性不好，因此難以開展QTL定位工作。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展及測(cè)序成本的持續(xù)降低，利用SSR、SNP等共顯性標(biāo)記構(gòu)建符合QTL定位要求的茶樹遺傳連鎖圖譜已陸續(xù)報(bào)道出來(lái)，有關(guān)茶葉芽葉性狀、兒茶素含量、抗病(蟲)性狀等QTL定位工作正穩(wěn)步推進(jìn)，并且取得了一些階段性的成果，這為開展茶樹分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

Tan等[15]利用茶樹花轉(zhuǎn)錄組開發(fā)了2439個(gè)SSR標(biāo)記并驗(yàn)證了其中的720個(gè)，成功開發(fā)出431個(gè)SSR標(biāo)記，利用其中的237個(gè)標(biāo)記對(duì)龍井43(♀)×白毫早(♂)的F1群體構(gòu)建了一張茶樹遺傳圖譜，包括15個(gè)連鎖群，總圖距為1156.9 cM，標(biāo)記間平均距離為5.2 cM。隨后，該課題組繼續(xù)整合483個(gè)SSR標(biāo)記，利用上述群體重新構(gòu)建了一張圖譜，包括15個(gè)連鎖群，總圖距為1226.2 cM，標(biāo)記間平均距離為2.5 cM，且定位了15個(gè)與春茶萌芽期，嫩梢顏色，成熟葉長(zhǎng)，成熟葉寬以及葉形指數(shù)相關(guān)的QTL[19]。Ma等[16]使用406個(gè)SSR標(biāo)記，運(yùn)用“擬測(cè)交”策略對(duì)迎霜(♀)×北躍(♂)單株的F1群體構(gòu)建了一張茶樹遺傳圖譜，包含15個(gè)連鎖群，總圖距為1143.5 cM，標(biāo)記間平均距離為2.9 cM，定位了25個(gè)與兒茶素含量相關(guān)的QTL，其中9個(gè)QTL年份之間表現(xiàn)穩(wěn)定，分布在LG03、LG11、LG12、LG15等連鎖群上，每個(gè)QTL對(duì)群體變異的解釋率在2.4%～71.0%之間。隨后，該課題組又利用SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)開發(fā)了茶樹SNP標(biāo)記，并利用6042個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)前期構(gòu)建的圖譜進(jìn)行了加密，最終構(gòu)建的圖譜包括6448個(gè)標(biāo)記，總圖距為3965 cM，標(biāo)記之間平均遺傳距離為1.0 cM，該圖譜是第一個(gè)基于SNP標(biāo)記的茶樹遺傳圖譜，也是目前最飽和的一張圖譜[18]。徐禮羿[20]等以烏牛早(♀)×龍井43(♂)的F1群體，構(gòu)建了一張雙親整合的遺傳圖譜，該圖譜擁有16個(gè)連鎖群，包含175個(gè)SSR標(biāo)記，圖譜總長(zhǎng)為1165.4 cM，平均圖距6.7 cM。在LG03、LG06、LGll、LGl3連鎖群上共檢測(cè)到4個(gè)的茶橙癭螨抗性QTL，單個(gè)QTL的表型變異貢獻(xiàn)率的變幅為7.2%～13.0%，且LG11存在1個(gè)控制茶橙癭螨抗性的主效QTL，變異貢獻(xiàn)率為13.0%。在LG01、LG04、LG06共檢測(cè)到4個(gè)的日灼病抗性QTL，單個(gè)QTL的表型變異貢獻(xiàn)率的變幅為6.9%～69.8%，且LG01和LG04各存在1個(gè)茶日灼病抗性相關(guān)的主效QTL，變異貢獻(xiàn)率分別為16.5%、69.8%。在LG03、LG06、LG08、LG10、LG13、LG15連鎖群上共檢測(cè)到8個(gè)的炭疽病抗性QTL，單個(gè)QTL的表型變異貢獻(xiàn)率的變幅為5.6%～13.8%，且LG10存在1個(gè)茶炭疽病抗性相關(guān)的主效QTL，變異貢獻(xiàn)率分別為13.8%。

2 茶樹關(guān)聯(lián)作圖研究進(jìn)展

關(guān)聯(lián)作圖是以自然群體為研究對(duì)象，以長(zhǎng)期重組后保留下來(lái)的標(biāo)記基因間連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)為依據(jù)，將目標(biāo)性狀表型的多樣性與標(biāo)記基因型的多態(tài)性結(jié)合分析，可直接鑒定出與表型變異密切相關(guān)的標(biāo)記基因位點(diǎn)[25-26]。相比QTL作圖，關(guān)聯(lián)作圖不用構(gòu)建人工雜交的作圖群體，而且不存在QTL作圖時(shí)兩親本基因型的限制，可同時(shí)檢測(cè)同一座位的多個(gè)等位變異，并且定位更精確，甚至可以達(dá)到單基因的水準(zhǔn)[27]。關(guān)聯(lián)作圖主要包括全基因組關(guān)聯(lián)作圖和候選基因關(guān)聯(lián)作圖兩種方法。

表1 已構(gòu)建的茶樹遺傳圖譜

注：“-”表示沒(méi)有。

2.1 全基因組關(guān)聯(lián)作圖

當(dāng)選取的標(biāo)記數(shù)目可以覆蓋全基因組時(shí)，即可定位到所有影響表型的QTL，這種方法稱為全基因組關(guān)聯(lián)作圖，該方法所需標(biāo)記的數(shù)目取決于物種的基因組大小以及LD水平，物種基因組大小相近時(shí)，LD衰減速度慢的物種所需標(biāo)記少，其定位精度比衰減速度快的物種低[28]。

隨著SSR等標(biāo)記的快速發(fā)展，茶樹全基因組關(guān)聯(lián)作圖研究開始了一些積極的嘗試。姚明哲等[29]利用自主開發(fā)的55個(gè)EST-SSR標(biāo)記對(duì)112份茶樹品種(系)進(jìn)行了基因分型，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析共鑒定出5個(gè)與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的EST-SSR標(biāo)記(P<0.01)，其中標(biāo)記CS298、CS317、CS84分別與一芽二葉百芽重(BW)、葉片長(zhǎng)度(LL)和茶多酚含量(TP)顯著關(guān)聯(lián)，對(duì)表型變異的解釋率分別為0.11、0.15和0.35；標(biāo)記CS330和CS338均與咖啡堿含量(CAF)顯著關(guān)聯(lián)，對(duì)表型變異的解釋率分別為0.14和0.15。喬婷婷等[30]在110 個(gè)EST-SSR標(biāo)記中共檢測(cè)到4656個(gè)成對(duì)位點(diǎn)組合存在連鎖不平衡(LD)，占所有可能成對(duì)位點(diǎn)組合的38.8%，其中301個(gè)成對(duì)位點(diǎn)組合存在較高程度的連鎖不平衡，39個(gè)標(biāo)記與累計(jì)15個(gè)性狀表現(xiàn)為極顯著。蘇會(huì)[31]利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)豫南茶區(qū)115個(gè)茶樹種質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記基因型分型，并將標(biāo)記與茶品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，67對(duì)EST-SSR組成的共2211對(duì)成對(duì)位點(diǎn)組合中，259個(gè)成對(duì)位點(diǎn)連鎖不平衡程度較高，占所有位點(diǎn)的11.71%。當(dāng)K=4時(shí)，模型后驗(yàn)概率LnP(D)最大，群體被分為四個(gè)亞群。與水浸出物關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有5個(gè)，其中TM066解釋率最高，為13.32%；與茶多酚關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有5個(gè)，其中TM092解釋率最高，為13.68%；與氨基酸關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有6個(gè)，其中TM083解釋率最高，為7.6%；與咖啡堿關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有3個(gè)，其中TM111解釋率最高，為7.8%；TM066、TM092、TM074-2與水浸出物、茶多酚同時(shí)關(guān)聯(lián)；TM086-1與茶多酚、氨基酸同時(shí)關(guān)聯(lián)；TM088、TM111、TM124與氨基酸，咖啡堿同時(shí)關(guān)聯(lián)。

2.2 候選基因關(guān)聯(lián)作圖

當(dāng)主效基因或者質(zhì)量性狀基因?qū)Ρ硇陀袥Q定性的影響，甚至單個(gè)堿基的變異亦可決定表型時(shí)，對(duì)可能影響表型性狀的部分基因組區(qū)段進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，不用過(guò)多的基因型分析工作即可定位目的基因，這種方法稱候選基因關(guān)聯(lián)作圖。應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)作圖方法研究LD衰減速度快的作物時(shí)，標(biāo)記與QTL處于LD狀態(tài)的概率相對(duì)較低，定位到目標(biāo)基因的概率相對(duì)較小，這時(shí)采用候選基因關(guān)聯(lián)作圖法對(duì)這類作物進(jìn)行分析效果更好[32]。利用候選基因關(guān)聯(lián)作圖法可鑒定到影響表型的基因組區(qū)段的多態(tài)性，并可估計(jì)其效應(yīng)值，因此該方法可對(duì)特定基因的等位變異是否控制目標(biāo)性狀進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，從而發(fā)掘出優(yōu)異的等位基因[33-36]。候選基因關(guān)聯(lián)作圖法由于具有實(shí)驗(yàn)的目的性更明確，基因型分析成本更低等優(yōu)點(diǎn)，因此備受研究者青睞。候選基因的選擇主要包括生理生化途徑中重要的功能基因、QTL研究定位區(qū)域所含的基因以及近緣物種研究中效應(yīng)較大的同源基因等[37-42]。

茶樹候選基因關(guān)聯(lián)作圖研究亦開始了一些積極的探索。Jin等[43]利用候選基因關(guān)聯(lián)作圖法研究了咖啡堿合成酶Ⅰ與咖啡堿含量之間的遺傳關(guān)系，通過(guò)對(duì)咖啡堿合成酶Ⅰ基因重測(cè)序從44個(gè)茶樹種質(zhì)資源中共鑒定出87個(gè)SNP，從序列變異中鑒定出2個(gè)CAPS標(biāo)記，其中SNP4318在4個(gè)環(huán)境中與咖啡堿含量相關(guān)，表型變異結(jié)實(shí)率為4.0%～7.7%。隨后，該課題組又運(yùn)用混合分離轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(BSA-Seq)及候選基因關(guān)聯(lián)作圖法，在茶樹中鑒定出了一個(gè)影響兒茶素合成的重要功能基因類黃酮3’,5’-羥化酶基因(F3’5’H)，該基因位點(diǎn)有10個(gè)SNP標(biāo)記與兒茶素指數(shù)CI、兒茶素組分含量、兒茶素總量等性狀顯著相關(guān)，并且基于F3’5’H中的SNP848標(biāo)記開發(fā)了一個(gè)能鑒定和篩選高二羥基兒茶素茶樹資源的功能標(biāo)記[44]。該項(xiàng)研究為今后茶樹重要性狀的遺傳解析及功能性分子標(biāo)記開發(fā)提供了新的思路(如圖1所示)。

圖1 茶樹重要性狀遺傳解析流程圖Fig.1 Strategic procedure for analyzing critical genetic traits of tea plants

3 存在的問(wèn)題與展望

3.1 茶樹QTL作圖

當(dāng)前多種作物在QTL作圖方面已經(jīng)取得了重要進(jìn)展[45-47]，并成功地應(yīng)用于主效基因的導(dǎo)入和聚合，育成的水稻、玉米、大豆等大田作物品種亦在生產(chǎn)上得到了應(yīng)用[48-50]，相較而言，茶樹QTL作圖研究尚處起步階段，利用該方法開展標(biāo)記輔助選擇育種研究面臨著巨大的挑戰(zhàn)。具體表現(xiàn)在：(1)茶樹人工雜交周期長(zhǎng)，從授粉到果實(shí)成熟需要1年時(shí)間，結(jié)實(shí)率非常低，目前用于構(gòu)建茶樹遺傳圖譜所用的群體均不超過(guò)200個(gè)個(gè)體，難以滿足構(gòu)建高密度遺傳圖譜對(duì)群體數(shù)目的要求。研究表明，當(dāng)作圖群體大小一定，僅靠增加標(biāo)記數(shù)量并不能提高QTL作圖的效率，只有群體個(gè)數(shù)達(dá)到400個(gè)以上時(shí)，檢測(cè)到的QTL效應(yīng)才趨于穩(wěn)定[51]。(2)已構(gòu)建的多數(shù)茶樹遺傳圖譜選擇材料構(gòu)建群體時(shí)，考慮較多的是圖譜繪制，而在實(shí)際育種應(yīng)用上考慮得較少，且選用的作圖群體不盡相同、標(biāo)記類型多樣，很難將多個(gè)圖譜整合加以利用，此外，多數(shù)遺傳圖譜使用的標(biāo)記為RAPD、AFLP等顯性標(biāo)記，重現(xiàn)性和保守性較差，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到標(biāo)記輔助選擇育種的要求。(3)茶樹遺傳基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，例如：茶樹性狀的遺傳力、性狀之間的上位性效應(yīng)以及QTL與環(huán)境互作等方面的研究基本處于空白階段，這就會(huì)導(dǎo)致一些QTL效應(yīng)估計(jì)不準(zhǔn)確或QTL檢測(cè)不到，進(jìn)而對(duì)QTL定位的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大的影響。

3.2 茶樹關(guān)聯(lián)作圖

關(guān)聯(lián)作圖法雖然具有不用構(gòu)建人工雜交的作圖群體，可同時(shí)對(duì)多個(gè)等位基因進(jìn)行分析，定位QTL精度更高等優(yōu)點(diǎn)，但關(guān)聯(lián)作圖法亦存在一些缺陷。具體表現(xiàn)在：(1)關(guān)聯(lián)作圖群體中的LD受到遺傳漂變、群體結(jié)構(gòu)以及自然選擇等諸多因素的影響，因此一些無(wú)關(guān)等位基因亦可與QTL形成LD，從而表現(xiàn)出與性狀的偽關(guān)聯(lián)或假陽(yáng)性。研究表明，群體結(jié)構(gòu)可解釋表型性狀中約9.3%的變異[52]。(2)關(guān)聯(lián)作圖雖對(duì)QTL的檢測(cè)能力較高，但不能估計(jì)QTL在染色體上的具體位置及其加性、上位性效應(yīng)，因此關(guān)聯(lián)作圖結(jié)合QTL作圖結(jié)果一起分析效果才更好。

3.3 展望

利用QTL作圖及關(guān)聯(lián)作圖開展茶樹分子標(biāo)記輔助育種研究，今后應(yīng)加強(qiáng)以下工作：(1)在親本選配時(shí)，盡量選擇與育種直接相關(guān)的材料，構(gòu)建的群體盡量做到既是遺傳研究群體，也是育種群體，縮短QTL定位研究與育種實(shí)際應(yīng)用的距離。(2)根據(jù)育種目標(biāo)，選擇合適的QTL作圖群體及分子標(biāo)記類型，構(gòu)建高密度的茶樹飽和遺傳圖譜，開展QTL精細(xì)定位與QTL克隆研究。(3)廣泛收集、保存、鑒定各類茶樹種質(zhì)資源，開展茶樹基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及生物信息學(xué)研究，加強(qiáng)茶樹次生代謝物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)及其重要功能基因研究。(4)相關(guān)單位協(xié)作，加強(qiáng)茶樹性狀的遺傳力，QTL與QTL間、QTL與環(huán)境間的互作研究等。

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