張 順 杜 濤 蔣小華 宋 純

上海市東方醫(yī)院(同濟大學附屬東方醫(yī)院)胃腸外科(200127)

缺氧誘導因子-2α在小鼠DSS結(jié)腸炎中的作用及其機制研究

張 順*杜 濤 蔣小華 宋 純#

上海市東方醫(yī)院(同濟大學附屬東方醫(yī)院)胃腸外科(200127)

背景：對炎癥性腸病(IBD)發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)微循環(huán)缺氧是IBD的重要特征之一，轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導因子(HIFs)在缺血缺氧損傷的調(diào)節(jié)中起關鍵作用。目的：探討HIF-2α在小鼠葡聚糖硫酸鈉(DSS)結(jié)腸炎中的作用及其可能機制。方法：以Mx-Cre/LoxP 重組方法獲得HIF-2α基因條件性敲除(HIF-2α -/-)小鼠，將C57BL/6、HIF-2α +/+和HIF-2α -/-小鼠分別隨機分入DSS模型組和飲水對照組，前者予4% DSS溶液自由飲用7 d制作結(jié)腸炎模型，造模過程中每天評估疾病活動指數(shù)(DAI)。各組小鼠分別于造模開始后第1、3、5、7 d處死，取結(jié)腸組織觀察組織病理學變化，real-time PCR檢測HIF-2α、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA表達。結(jié)果：造模過程中，C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜HIF-2α mRNA表達明顯升高，DAI和結(jié)腸黏膜炎癥評分顯著高于C57BL/6飲水對照組(第5、第7 d，P<0.05)。HIF-2α -/- DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥損傷較HIF-2α +/+ DSS模型組進一步加重，DAI和炎癥評分進一步升高(除第7 d炎癥評分外，P均<0.05)，結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA表達亦較HIF-2α+/+ DSS模型組顯著升高(第5、第7 d，P<0.05)。結(jié)論：HIF-2α可能通過抑制TNF-α表達發(fā)揮減輕小鼠DSS結(jié)腸炎炎癥損傷的作用。

結(jié)腸炎； 缺氧誘導因子2，α亞基； 腫瘤壞死因子α； 小鼠，基因敲除

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一類病因不明、以腸道慢性炎性反應為特征的疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)[1]。IBD嚴重危害人類健康且患者發(fā)生結(jié)直腸癌的概率明顯高于一般人群，因此越來越受到研究者的關注[2-3]。近年來，缺血缺氧與IBD的關系逐漸成為IBD發(fā)病機制的研究方向之一[4]。IBD患者的腸道上皮細胞處于缺氧環(huán)境中，微循環(huán)缺氧是IBD的一個重要特征，而機體通過分子調(diào)控保護上皮細胞是組織缺氧適應性反應的重要組成部分[4-5]。近年來，眾多實驗研究表明缺氧誘導因子-1α亞基(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在腸道炎癥中起保護作用[6-7]。本研究以HIF-2α基因條件性敲除小鼠為實驗對象，探討HIF-2α在實驗性結(jié)腸炎中的作用及其可能機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，自由進食、飲水。Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠(JAXMICE:003556)和HIF-2α-LoxP標記小鼠(JAXMICE:008407)引進自美國Jackson實驗室。HIF-2α-LoxP標記小鼠與Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配后，經(jīng)兩次傳代和基因型鑒定篩選，獲得Mx-Cre陽性HIF-2α純和子LoxP標記小鼠。對此種小鼠連續(xù)3次腹腔注射聚肌胞，通過誘導干擾素產(chǎn)生獲得全身HIF-2α基因敲除小鼠(HIF-2α -/-)[8]。同時構建Mx-Cre陰性HIF-2α純合子LoxP標記小鼠(HIF-2α +/+)作為對照組。

葡聚糖硫酸鈉(DSS)(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，TRIzol?RNA分離試劑(Thermo Fisher Scientific Inc.)，PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)。

二、方法

1. 實驗動物分組和模型制作：將C57BL/6、HIF-2α +/+和HIF-2α -/-小鼠分別隨機分入DSS模型組和飲水對照組，每組20只，前者予4% DSS溶液自由飲用7 d制作結(jié)腸炎模型[9]，后者予蒸餾水自由飲用7 d。造模過程中每天觀察小鼠體質(zhì)量、活動情況、毛色變化以及糞便顏色、性狀、有無出血等情況。

2. 標本采集和處理：各組小鼠分別于造模開始后第1、3、5、7 d以頸椎脫臼法分批處死(每一時點處死5只)，分離全結(jié)腸，觀察大體腸壁，沿腸系膜剪開腸腔，冰PBS沖洗，取炎癥黏膜組織，部分于-80 ℃ 保存，部分4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，HE染色。

3. 疾病活動指數(shù)(DAI)評估：根據(jù)小鼠體質(zhì)量下降程度、糞便性狀和隱血情況進行評分[10]。

4. 結(jié)腸黏膜炎癥評分：于光學顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織病理學變化，根據(jù)炎癥程度分為0～4級[11]。0級：結(jié)腸黏膜結(jié)構正常，未見炎性細胞浸潤；1級：少量白細胞浸潤；2級：中度白細胞浸潤；3級：大量白細胞浸潤，中度纖維化，腸壁增厚，中度杯狀細胞消失，局部隱窩消失；4級：炎性細胞浸潤至黏膜下，腸黏膜結(jié)構破壞，大量杯狀細胞消失。

5. Real-time PCR：取凍存結(jié)腸組織約50 mg，勻漿后以TRIzol?試劑提取總RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴增，引物由TAKARA BIO INC.設計、合成。HIF-2α引物序列：F 5’-CAG GCA GTA TGC CTG GCT AAT TCC AGT T-3’, R 5’-CTT CTT CCA TCA TCT GGG ATC TGG GAC T-3’；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)引物序列：F 5’-AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT-3’, R 5’-CCA CCA CGC TCT TCT GTC TAC-3’；內(nèi)參β-actin: F 5’-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C-3’, R 5’-ATG GAG CCA CCG ATC CAC A-3’。PCR反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加蒸餾水至25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。實驗重復3次。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸炎癥損傷

C57BL/6、HIF-2α +/+和HIF-2α -/-飲水對照組小鼠造模過程中DAI和結(jié)腸黏膜炎癥評分均趨于0，各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型組小鼠DAI隨飲用DSS溶液時間的延長逐漸升高，結(jié)腸黏膜可見中重度充血水腫和淺潰瘍，第5、第7 d DAI和炎癥評分與C57BL/6飲水對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1A、1B)。與HIF-2α +/+ DSS模型組相比，HIF-2α -/- DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥損傷進一步加重，第3、5、7 d DAI和炎癥評分均高于HIF-2α +/+ DSS模型組，除第7 d炎癥評分外，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1C、1D)，提示HIF-2α在DSS結(jié)腸炎中可能發(fā)揮減輕結(jié)腸炎癥損傷的作用。

二、HIF-2α mRNA表達變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，與相應飲水對照組相比，C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜HIF-2α mRNA相對表達量明顯升高，第5、第7 d 兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)，證實HIF-2α在DSS結(jié)腸炎中表達上調(diào)。

三、HIF-2α對DSS結(jié)腸炎TNF-α mRNA表達的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與HIF-2α +/+ DSS模型組相比，HIF-2α -/- DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA相對表達量明顯升高，第5、第7 d兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)，表明HIF-2α在DSS結(jié)腸炎中可能抑制TNF-α表達。

討 論

IBD在西方國家相當常見，患病率為100～200/10萬，近10年來，我國IBD患病率呈明顯上升趨勢。迄今為止，IBD的病因和發(fā)病機制尚不十分明確，現(xiàn)有治療措施亦有限，因此開展IBD的防治研究具有重要臨床意義。

目前IBD發(fā)病機制相關研究集中在環(huán)境、遺傳、感染、免疫因素等方面，認為IBD是一種由環(huán)境因素作用于遺傳易感個體而引起的腸道黏膜異常免疫反應， 近年來， 缺血缺氧與IBD的關系亦逐漸成為研究方向之一[4]。HIFs是一組由結(jié)構同源的α亞基和共同的β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，在缺血缺氧損傷的調(diào)節(jié)中起關鍵作用[12]，其中HIF-1和HIF-2是細胞缺氧適應性反應中最重要的調(diào)節(jié)因子。HIF-2由HIF-2α和HIF-1β兩個亞基組成，靶基因涉及血管生成、糖酵解、干細胞自我更新、血管收縮和舒張、骨髓造血、能量代謝、兒茶酚胺合成、鐵平衡等多個方面[5，13-14]。HIF-1β亞基又稱ARNT(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator)，為HIF-2的結(jié)構性亞基，在正常細胞和缺氧細胞的胞質(zhì)和胞核中均有表達，表達水平極少發(fā)生波動[15]；HIF-2α亞基則為HIF-2的功能性和活性亞基，是誘導低氧反應基因修復細胞氧內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的核心調(diào)節(jié)因子，對于在急性缺血缺氧損傷狀態(tài)下保護細胞免于凋亡、維持腸上皮的再生和增殖能力至關重要[16-17]。

*與同時間點C57BL/6 飲水對照組(A、B)或HIF-2α +/+ DSS模型組(C、D)比較，P<0.05

*與同時間點相應飲水對照組比較，P<0.05

*與同時間點HIF-2α +/+ DSS模型組比較，P<0.05

目前關于HIFs在IBD中作用的研究報道主要集中于HIF-1α，并發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸炎動物模型中可通過維持黏膜屏障而發(fā)揮保護作用[6-7]，HIF-2α與IBD關系的研究結(jié)論則并不一致。一些研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α在活動性IBD患者的結(jié)腸組織中呈高表達[5，18]，多數(shù)研究支持HIF-2α在炎癥狀態(tài)下激活起保護作用，可維持腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19]，但亦有研究顯示HIF-2α在IBD中起促進而非抑制炎癥反應的作用，可上調(diào)腸上皮細胞促炎細胞因子TNF-α表達，敲除HIF-2α的結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸炎癥減輕，過表達者則對結(jié)腸炎易感[18]。本研究通過飲用4% DSS溶液建立小鼠結(jié)腸炎模型，探討HIF-2α在IBD中的可能作用及其機制。實驗結(jié)果顯示，C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜HIF-2α mRNA表達較相應飲水對照組顯著升高，提示HIF-2α在DSS結(jié)腸炎中起重要作用。進一步以HIF-2α基因敲除小鼠重復DSS結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)HIF-2α -/- DSS模型組小鼠DAI和結(jié)腸黏膜炎癥評分均顯著高于HIF-2α +/+ DSS模型組，兩組間DAI在造模開始后第3～7 d差異均有統(tǒng)計學意義，但炎癥評分的組間差異至第7 d已無統(tǒng)計學意義，可能與此時模型動物的結(jié)腸黏膜炎癥損傷達到最高峰有關。綜合上述結(jié)果，提示HIF-2α在DSS結(jié)腸炎中可能起減輕結(jié)腸炎癥損傷的作用。

促炎細胞因子TNF-α在IBD腸道炎癥反應中居核心地位，其主要以旁分泌和自分泌方式在局部發(fā)揮作用，使內(nèi)皮細胞表達黏附分子，從而使各類免疫炎癥相關細胞，如單核巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等聚集于炎癥局部，分泌TNF-α以及其他炎癥因子，放大炎癥級聯(lián)反應，最終導致黏膜組織損傷甚至壞死[20-21]。既往研究發(fā)現(xiàn)缺氧可誘導多種細胞分泌TNF-α[22]，且HIF-2α基因失活可增加上皮炎癥細胞浸潤[23]，故推測HIF-2α具有抑制上皮細胞分泌TNF-α的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α +/+ DSS模型組小鼠的結(jié)腸黏膜HIF-2α mRNA表達在造模過程中逐漸升高，在相同時間段內(nèi)，HIF-2α -/- DSS模型組小鼠結(jié)腸黏膜TNF-α mRNA表達呈持續(xù)升高趨勢，伴DAI和結(jié)腸黏膜炎癥評分升高，且三者造模全程均明顯高于HIF-2α+/+ DSS模型組，表明HIF-2α與TNF-α之間存在負相關趨勢，HIF-2α可能通過抑制TNF-α表達減輕DSS結(jié)腸炎癥損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠DSS結(jié)腸炎中，結(jié)腸黏膜HIF-2α表達與TNF-α表達以及DAI和結(jié)腸黏膜炎癥評分之間存在負相關趨勢，推測HIF-2α可能通過抑制TNF-α表達發(fā)揮減輕結(jié)腸炎癥損傷的作用。進一步認識HIF-2α參與調(diào)控IBD炎癥損傷的機制將為以之為靶點的IBD干預策略提供理論基礎和實驗依據(jù)。

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(2016-07-02收稿；2016-07-17修回)

Effect of Hypoxia-inducible Factor-2α on Mice DSS Colitis and its Possible Mechanism

ZHANGShun,DUTao,JIANGXiaohua,SONGChun.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,ShanghaiEastHospital(EastHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity),Shanghai(200127)

SONG Chun, Email: chunsong163@163.com

Colitis; Hypoxia-Inducible Factor 2, alpha Subunit; Tumor Necrosis Factor-alpha; Mice, Knockout

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.006

*Email: v2zs@hotmail.com

#本文通信作者，Email: chunsong163@163.com

Background: There is increasing evidence that microcirculation hypoxia plays an important role in pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). Hypoxia-inducible factors (HIFs) are transcriptional factors that serve as master regulators in ischemic and hypoxia injuries. Aims: To investigate the effect of HIF-2α on dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice and its possible mechanism. Methods: Mx-Cre/LoxP recombination system was utilized to establish a conditional HIF-2α gene knockout (HIF-2α -/-) mouse model. C57BL/6, HIF-2α +/+ and HIF-2α -/- mice were randomly allocated into DSS colitis group and water drinking group, respectively. Experimental colitis was induced by treatment with 4% DSS in drinking water for 7 days, and the disease activity index (DAI) was assessed daily. Mice in each group were sacrificed on day 1, 3, 5 and 7 in batch; the histopathological changes of colonic tissue were observed, and mRNA expressions of HIF-2α and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by real-time PCR. Results: During model establishment, expression of HIF-2α mRNA in colonic tissue was elevated in C57BL/6 and HIF-2α +/+ DSS colitis groups, and the DAI and colonic inflammatory score were significantly higher than those in C57BL/6 water drinking group (P<0.05 on day 5 and day 7). Compared with HIF-2α +/+ DSS colitis group, HIF-2α -/- DSS colitis group had more severe colonic inflammatory injury and the DAI and inflammatory score were further increased (Pall <0.05, except the inflammatory score on day 7); expression of TNF-α mRNA in colonic tissue was also increased significantly in HIF-2α -/- DSS colitis group (P<0.05 on day 5 and day 7). Conclusions: HIF-2α may ameliorate colonic inflammatory injury in mice with DSS colitis via inhibition of TNF-α expression.