王 靜 徐 萍# 楊志文 徐 凱 賴躍興

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院松江分院消化內(nèi)科1(201600) 藥劑科2

PI3K/AKT激動劑和抑制劑對巨噬細胞炎癥反應的影響*

王 靜1徐 萍1#楊志文2徐 凱1賴躍興1

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院松江分院消化內(nèi)科1(201600) 藥劑科2

背景：近年發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)在重度急性胰腺炎(SAP)的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但機制尚未明確。目的：探討PI3K/AKT激動劑胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和抑制劑wortmannin對巨噬細胞株RAW264.7 Toll樣受體4(TLR4)信號通路的影響，闡明PI3K/AKT參與調(diào)節(jié)SAP炎癥反應的作用機制。方法：分別以不同濃度脂多糖(LPS)、IGF-Ⅰ、wortmannin處理RAW264.7細胞，采用CCK-8實驗檢測細胞活性。RAW264.7細胞分為空白對照組(不予處理)、LPS組(LPS 1 μg/mL)、IGF-Ⅰ組(IGF-Ⅰ 100 ng/mL+LPS 1 μg/mL)、wortmannin組(wortmannin 100 nmol/L+LPS 1 μg/mL)和IGF-Ⅰ+wortmannin組(wortmannin 100 nmol/L+IGF-Ⅰ 100 ng/mL+LPS 1 μg/mL)，采用ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)蛋白表達，采用real-time PCR檢測TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、AKT、PI3K、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、核因子-κB(NF-κB)mRNA表達。結(jié)果：RAW264.7細胞經(jīng)不同濃度LPS、IGF-Ⅰ、wortmannin處理后，各濃度組間細胞活性無明顯差異(P>0.05)。LPS組、IGF-Ⅰ組、wortmannin組、IGF-Ⅰ+wortmannin組TNF-α、IL-6表達水平均較空白對照組顯著升高(P<0.05)；wortmannin組TNF-α、IL-6表達水平較LPS組和IGF-Ⅰ組顯著降低(P<0.05)；IGF-Ⅰ+wortmannin組 TNF-α、IL-6表達水平較IGF-Ⅰ組顯著降低(P<0.05)。LPS組AKT、PI3K、TLR4及其下游分子MyD88、p38MAPK、NF-κB mRNA表達均顯著高于空白對照組(P<0.05)；IGF-Ⅰ組上述指標較LPS組進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；wortmannin組上述指標較LPS組和IGF-Ⅰ組顯著降低(P<0.05)；IGF-Ⅰ+wortmannin組上述指標顯著高于wortmannin組(P<0.05)，但較IGF-Ⅰ組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：PI3K/AKT可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞中的TLR4及其下游分子影響促炎細胞因子表達，從而參與SAP炎癥反應的發(fā)生。

胰腺炎； 磷酸肌醇3-激酶類； 蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶； Toll樣受體4； 胰島素樣生長因子 Ⅰ； Wortmannin； 腫瘤壞死因子α； 白細胞介素6

重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是病死率較高的消化系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明。本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)參與調(diào)控SAP 大鼠胰腺組織促炎細胞因子的釋放，可加重胰腺組織損傷；而PI3K/AKT抑制劑wortmannin可減輕胰腺組織損傷，提高SAP大鼠生存率。然而，PI3K/AKT參與SAP發(fā)病的具體機制尚未明確。已有研究[2]證實Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)信號通路是促炎細胞因子釋放的主要通路，刺激TLR4可激活核因子-κB(NF-κB)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路，導致炎性因子釋放。故本研究通過探討PI3K/AKT激動劑胰島素樣生長因子-Ⅰ (insulin-like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)和抑制劑wortmannin對小鼠巨噬細胞TLR4信號通路的影響，旨在闡明PI3K/AKT參與調(diào)節(jié)SAP炎癥反應的作用機制。

材料與方法

一、細胞株、主要試劑和儀器

小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院上海細胞庫。CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；脂多糖(LPS)、wortmannin(美國Sigma公司)；IGF-Ⅰ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(美國Abcam公司)；白細胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Promega公司)； PCR擴增試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；SYBR?PrimeScriptTMreal-time RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：RAW264.7細胞在37 ℃、5% CO2條件下，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2. CCK-8實驗檢測LPS、IGF-Ⅰ和wortmannin對RAW264.7細胞活性的影響：取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，以1×103～5×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)過夜，分別以LPS、IGF-Ⅰ、wortmannin處理細胞，每組設6個濃度組，LPS、IGF-Ⅰ、wortmannin濃度分別為0、0.1、0.3、1、3、10 μg/mL；0、1、10、30、100、300 ng/mL；0、3、10、20、100、300 nmol/L。加入100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)1 h，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。

3. RAW264.7細胞分組處理：取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，以5×103/mL接種于6孔板，設置空白對照組、LPS組、IGF-Ⅰ組、wortmannin組和IGF-Ⅰ+wortmannin組?？瞻讓φ战M不予處理；LPS組以LPS(1 μg/mL)處理細胞；IGF-Ⅰ組以IGF-Ⅰ(100 ng/mL)預處理1 h后加入LPS(1 μg/mL)處理細胞；wortmannin組以wortmannin(100 nmol/L)預處理30 min后加入LPS(1 μg/mL)處理細胞；IGF-Ⅰ+wortmannin組以wortmannin(100 nmol/L)預處理30 min，以IGF-Ⅰ(100 ng/mL)預處理1 h，再以LPS(1 μg/mL)處理細胞。每孔細胞懸液終體積為1 mL，培養(yǎng)6 h后收集細胞。

4. ELISA法檢測促炎細胞因子TNF-α、IL-6表達：取空白對照組、LPS組、IGF-Ⅰ組、wortmannin組和IGF-Ⅰ+wortmannin組細胞，檢測TNF-α、IL-6表達，具體步驟參照相應ELISA試劑盒說明書進行。

5. Real-time PCR檢測TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、AKT、PI3K、p38MAPK、NF-κB mRNA表達：取空白對照組、LPS組、IGF-Ⅰ組、wortmannin組和IGF-Ⅰ+wortmannin組細胞，棄上清液，PBS漂洗，加入1 mL TRIzol試劑抽提細胞總RNA。采用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以之為模板，采用ABI 7300型定量PCR儀行real-time PCR擴增，檢測TLR4、MyD88、AKT、PI3K、p38MAPK、NF-κB mRNA表達。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參照。TLR4引物上游：5’-CTA TGA ACA AAG GGT CTA TCA G-3’，下游：5’-AAG AAC AGC AAC CAC TAA AG-3’；MyD88引物上游：5’-CAC TCG CAG TTT GTT GGA TG-3’，下游：5’-TGT AAA GGC TTC TCG GAC TC-3’；AKT引物上游：5’-GGG CAC ATC AAG ATA ACG-3’，下游：5’-TGG TCC TGG TTG TAG AAG-3’；PI3K引物上游：5’-ATG CCA GAA AGG AGA ATG-3’，下游：5’-TGT TGG ACT CAG CAA TAC-3’；p38MAPK引物上游：5’-GTG TTC ACA CCC GCA AGG TC-3’，下游：5’-CGG TCA GCT TCT GGC ACT TC-3’；NF-κB引物上游：5’-CCC GAA ACT CAA CTT CTG-3’，下游：5’-ATC TGC CCT GAT GGT AAC-3’；GAPDH引物上游：5’-ATC ACT GCC ACC CAG AAG-3’，下游：5’-TCC ACG ACG GAC ACA TTG-3’。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環(huán)。以2-△△Ct法分析目的基因相對表達量。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、不同濃度LPS、IGF-Ⅰ、wortmannin對細胞活性的影響

LPS、IGF-Ⅰ、wortmannin各濃度組間RAW264.7細胞活性無明顯差異(P>0.05)(圖1)。最終選擇以 1 μg/mL LPS、100 ng/mL IGF-Ⅰ和100 nmol/L wortmannin進行后續(xù)實驗。

A-F：LPS濃度分別為0、0.1、0.3、1、3、10 μg/mL；IGF-Ⅰ濃度分別為0、1、10、30、100、300 ng/mL；wortmannin濃度分別為0、3、10、20、100、300 nmol/L

圖1 不同濃度LPS、IGF-Ⅰ 和wortmannin對RAW264.7細胞 活性的影響

二、促炎細胞因子TNF-α、IL-6表達變化

LPS組RAW264.7細胞TNF-α、IL-6表達水平較空白對照組顯著升高(P<0.05)；IGF-Ⅰ組TNF-α、IL-6表達水平與空白對照組和LPS組相比均升高，與空白對照組間差異顯著(P<0.05)，與LPS組間差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Wortmannin組TNF-α、IL-6表達水平與空白對照組相比顯著升高(P<0.05)，與LPS組和IGF-Ⅰ組相比顯著降低(P<0.05)；IGF-Ⅰ+wortmannin組 TNF-α、IL-6表達水平與空白對照組相比顯著升高(P<0.05)，與LPS組相比有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與IGF-Ⅰ組相比顯著降低(P<0.05)，與wortmannin組相比有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1、圖2)。

三、TLR4、MyD88、AKT、PI3K、p38MAPK、NF-κB mRNA表達

LPS組TLR4、MyD88、AKT、PI3K、p38MAPK、NF-κB mRNA表達水平均顯著高于空白對照組(P<0.05)。IGF-Ⅰ 組上述指標均顯著高于空白對照組和LPS組(P<0.05)。Wortmannin組上述指標顯著高于空白對照組(P<0.05)，與LPS組、IGF-Ⅰ組相比則顯著降低(P<0.05)。IGF-Ⅰ+wortmannin組上述指標顯著高于wortmannin組(P<0.05)，但較IGF-Ⅰ組顯著降低(P<0.05)(表2)。

組 別TNF?αIL?6空白對照組325．45±15．4653．64±3．06LPS組545．53±59．35137．80±12．30IGF?Ⅰ組570．29±51．24148．72±16．11wortmannin組490．20±25．97120．47±6．34IGF?Ⅰ+wortmannin組519．51±32．30131．92±9．58

討 論

PI3K是生長因子超家族信號轉(zhuǎn)導過程中的重要分子，可被多種細胞因子和理化因素激活。AKT主要負責由PI3K始動的生物信息傳遞。PI3K/AKT作為細胞內(nèi)主要信號通路，在細胞代謝、細胞周期調(diào)控、細胞增殖、凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究[4]表明PI3K/AKT通路可引起促炎細胞因子釋放，參與SAP發(fā)病。本課題組前期研究[1]結(jié)果顯示，SAP大鼠胰腺組織中磷酸化AKT表達增高，促炎細胞因子表達增加，予PI3K抑制劑wortmannin預處理后，AKT活性受抑，促炎細胞因子表達降低，胰腺組織病理學改變明顯緩解，SAP大鼠生存率升高。本研究結(jié)果顯示PI3K/AKT激動劑IGF-Ⅰ可促進LPS誘導巨噬細胞釋放促炎細胞因子TNF-α、IL-6，而wortmannin作用于巨噬細胞后可抑制LPS引起的促炎細胞因子分泌，并可拮抗IGF-Ⅰ對促炎細胞因子的上調(diào)作用，與前期動物實驗研究結(jié)果一致。

PI3K/AKT活化可導致細胞產(chǎn)生大量促炎細胞因子，此過程在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[5]。目前尚不明確PI3K/AKT促進促炎細胞因子產(chǎn)生的具體機制。TLR4信號通路是促炎細胞因子釋放的主要通路， 活化的TLR4可通過MyD88等接頭蛋白激活其下游NF-κB、 p38MAPK，產(chǎn)生大量炎性因子。研究[6-8]證實，SAP動物模型的胰腺、腸道以及肺炎癥損傷均涉及TLR4信號通路激活。TLR4信號通路激活是SAP引發(fā)全身性炎癥反應和臟器功能衰竭的重要病理生理學機制。本研究應用LPS刺激巨噬細胞激活TLR4信號通路，并分別以PI3K/AKT激動劑、抑制劑以及兩者同時應用干預LPS引起的炎癥反應，結(jié)果顯示TLR4、 MyD88、p38MAPK、NF-κB表達隨PI3K/AKT激動劑和抑制劑的干預而發(fā)生變化，提示PI3K/AKT與TLR4信號通路存在關(guān)聯(lián)。國外一項研究[9]發(fā)現(xiàn)，尼古丁可減輕膿毒血癥小鼠的炎癥反應，此作用可能是通過影響PI3K/AKT信號通路、進而調(diào)節(jié)TLR4表達實現(xiàn)的，進一步提示PI3K/AKT與TLR4炎癥信號通路密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示IGF-Ⅰ可進一步激活LPS引起的炎癥反應，活化TLR4信號通路，使TLR4、MyD88、p38MAPK、NF-κB表達上調(diào)，促炎細胞因子TNF-α、IL-6表達升高，而wortmannin可拮抗IGF-Ⅰ的作用；單獨應用wortmannin作用于LPS刺激的巨噬細胞則可抑制LPS引起的TLR4信號通路活化，下調(diào)TLR4、MyD88、p38MAPK、NF-κB表達，并使促炎細胞因子表達降低。上述研究結(jié)果提示PI3K/AKT可能通過調(diào)節(jié)TLR4及其下游分子影響促炎細胞因子表達，從而參與SAP炎癥反應的發(fā)生。

圖2 各組RAW264.7細胞TNF-α、IL-6表達變化

組 別TLR4MyD88AKTPI3Kp38MAPKNF?κB空白對照組1．00±0．071．00±0．031．00±0．081．00±0．060．06±0．011．01±0．18LPS組7．06±0．793．26±0．084．05±0．314．89±0．150．25±0．033．92±0．27IGF?Ⅰ組9．11±0．365．97±0．565．13±0．346．04±0．590．35±0．015．28±0．31wortmannin組1．77±0．161．74±0．411．27±0．231．32±0．200．08±0．011．52±0．09IGF?Ⅰ+wortmannin組7．91±0．663．80±0．344．71±0．344．94±0．210．25±0．083．98±0．62

綜上所述，本研究從細胞水平證實PI3K/AKT可通過影響TLR4信號通路調(diào)控p38MAPK、NF-κB活性，從而調(diào)節(jié)促炎細胞因子表達，參與SAP炎癥反應。后期研究還需完善相關(guān)體內(nèi)實驗，進一步驗證SAP中PI3K/AKT與TLR4信號通路的關(guān)系，為控制SAP炎癥反應提供理論依據(jù)。

1 Xu P, Wang J, Yang ZW, et al. Regulatory roles of the PI3K/AKT signaling pathway in rats with severe acute pancreatitis[J]. PLoS One, 2013, 8 (11): e81767.

2 Zhao W, Ma G, Chen X. Lipopolysaccharide induced LOX-1 expression via TLR4/MyD88/ROS activated p38MAPK-NF-κB pathway[J]. Vascul Pharmacol, 2014, 63 (3): 162-172.

3 Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway[J]. Science, 2002, 296 (5573): 1655-1657.

4 康新，王立志，王屹剛，等. 重癥急性胰腺炎肺損傷時磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導通路的表達[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2010, 90 (11): 732-737.

5 Zhao M, Zhou A, Xu L, et al. The role of TLR4-mediated PTEN/PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in neuroin-flammation in hippocampal neurons[J]. Neuroscience, 2014, 269: 93-101.

6 Li Y, Zhou ZG, Zhang J, et al. Microcirculatory detection of Toll-like receptor 4 in rat pancreas and intestine[J]. Clin Hemorheol Microcirc, 2006, 34 (1-2): 213-219.

7 Sharif R, Dawra R, Wasiluk K, et al. Impact of toll-like receptor 4 on the severity of acute pancreatitis and pancreatitis-associated lung injury in mice[J]. Gut, 2009, 58 (6): 813-819.

8 Sawa H, Ueda T, Takeyama Y, et al. Role of toll-like receptor 4 in the pathophysiology of severe acute pancreatitis in mice[J]. Surg Today, 2007, 37 (10): 867-873.

9 Kim TH, Kim SJ, Lee SM. Stimulation of the α7 nicotinic acetylcholine receptor protects against sepsis by inhibiting Toll-like receptor via phosphoinositide 3-kinase activation[J]. J Infect Dis, 2014, 209 (10): 1668-1677.

(2016-07-01收稿；2016-07-20修回)

Effect of Agonist and Inhibitor of PI3K/AKT on Inflammatory Response in Macrophages

WANGJing1,XUPing1,YANGZhiwen2,XUKai1,LAIYuexing1.1

DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPharmacy,SongjiangHospitalAffiliatedtotheFirstPeople’sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai(201600)

XU Ping, Email: sjzxxp@yeah.net

Pancreatitis; Phosphatidylinositol 3-Kinases; Protein-Serine-Threonine Kinases; Toll-Like Receptor 4; Insulin-Like Growth Factor Ⅰ; Wortmannin; Tumor Necrosis Factor-alpha; Interleukin-6

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.004

上海市松江區(qū)衛(wèi)計委醫(yī)學領(lǐng)先專業(yè)項目(201358)

#本文通信作者，Email: sjzxxp@yeah.net

Background: Phosphoinositide 3-kinase/serine-threonine kinase (PI3K/AKT) has been found playing an important role in the pathogenesis of severe acute pancreatitis (SAP) in recent years, but the underlying mechanism has not been clarified. Aims: To investigate the role of PI3K/AKT in regulating the inflammatory response in SAP by evaluating the effect of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) and wortmannin, the agonist and inhibitor of PI3K/AKT on Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway in macrophage cell line RAW264.7. Methods: RAW264.7 cells were treated with different concentrations of lipopolysaccharide (LPS), IGF-Ⅰ and wortmannin, respectively, and cell viability was determined by CCK-8 assay. RAW264.7 cells were divided into blank control group (no treatment), LPS group (LPS 1 μg/mL), IGF-Ⅰ group (IGF-Ⅰ 100 ng/mL+LPS 1 μg/mL), wortmannin group (wortmannin 100 nmol/L+LPS 1 μg/mL) and IGF-Ⅰ+wortmannin group (wortmannin 100 nmol/L+IGF-Ⅰ 100 ng/mL+LPS 1 μg/mL). Protein expressions of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were detected by ELISA; mRNA expressions of TLR4, myeloid differentiation factor 88 (MyD88), AKT, PI3K, p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) and nuclear factor-κB (NF-κB) were determined by real-time PCR. Results: After treated with LPS, IGF-Ⅰ and wortmannin, respectively, no differences in cell viability of RAW264.7 cells were found between different concentrations groups (P>0.05). Protein expressions of TNF-α and IL-6 in LPS, IGF-Ⅰ, wortmannin and IGF-Ⅰ+wortmannin groups were significantly higher than those in blank control group (P<0.05). Protein expressions of TNF-α and IL-6 in wortmannin group were significantly lower than those in LPS and IGF-Ⅰ groups (P<0.05), and those in IGF-Ⅰ+wortmannin group were significantly lower than those in IGF-Ⅰ group (P<0.05). In LPS group, mRNA expressions of AKT and PI3K as well as TLR4 and its downstream molecules MyD88, p38MAPK and NF-κB were significantly higher than those in blank control group (P<0.05). Expressions of all above-mentioned mRNAs in IGF-Ⅰ group were further increased and significantly higher than those in LPS group (P<0.05). Expressions of all above-mentioned mRNAs in wortmannin group were significantly lower than those in LPS and IGF-Ⅰ groups (P<0.05), and those in IGF-Ⅰ+wortmannin group were significantly higher than those in wortmannin group (P<0.05), but significantly lower than those in IGF-Ⅰ group (P<0.05). Conclusions: PI3K/AKT might regulate TLR4 signaling pathway and its downstream molecules in macrophages, thereby affects the expressions of inflammatory cytokines and being involved in the pathogenesis of inflammatory response in SAP.