楊 婧 段 德 吳華美 楊黎宏 李 艷 楊晉輝#

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科二病區(qū)1(650101) 大理白族自治州人民醫(yī)院消化內(nèi)科2

原發(fā)性膽汁性膽管炎血清代謝物組的氫譜核磁共振初步研究*

楊 婧1△段 德2△吳華美1楊黎宏1李 艷1楊晉輝1#

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科二病區(qū)1(650101) 大理白族自治州人民醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：氫譜核磁共振(1H-NMR)技術(shù)為代謝組學(xué)常用方法，用于肝炎肝硬化、肝癌等疾病的研究，但關(guān)于原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)患者血清代謝物組的研究較為少見。目的：探討1H-NMR篩選PBC血清代謝物的能力。方法：采用1H-NMR對20例PBC、20例乙型肝炎肝硬化和20例對照組進(jìn)行檢測并獲得1H-NMR圖譜，結(jié)合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)法創(chuàng)建診斷模型。根據(jù)OPLS-DA模型的相關(guān)系數(shù)P(corr)、VIP值和非配對t檢驗，篩選出對照組與兩組肝硬化組的血清差異性代謝物。結(jié)果：OPLS-DA模型能有效區(qū)分對照組與PBC患者，模型解釋率和預(yù)測率分別為81.9%和44.8%(P=0.029 3)，谷氨酰胺、葉酸、尿刊酸和4-乙基苯甲酸為兩組的差異性代謝物。OPLS-DA模型能有效區(qū)分對照組與乙型肝炎肝硬化患者，尿刊酸、1-甲基組胺、1-甲基腺嘌呤、葡萄糖、L-乙酰肉毒堿為兩組的差異性代謝物。OPLS-DA模型不能區(qū)分PBC和乙型肝炎肝硬化患者。結(jié)論：血清谷氨酰胺、葉酸可能為PBC潛在的特異性生物標(biāo)記物，可能與PBC的免疫損傷機制和預(yù)后有關(guān)。1H-NMR技術(shù)結(jié)合OPLS-DA診斷模型有望成為一種研究肝硬化的新方法。

氫譜核磁共振； 肝硬化，膽汁性； 診斷； 谷氨酰胺； 尿刊酸

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholan-gitis, PBC)，即原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一種起病隱匿、發(fā)病機制不明、自身免疫介導(dǎo)的慢性炎性膽汁淤積性肝病，病理學(xué)上分為Ⅰ期(膽管炎期)、Ⅱ期(膽管增生期)、Ⅲ期(纖維化期)和Ⅳ期(肝硬化期)，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)中小膽管非化膿性炎癥、門靜脈炎伴門管區(qū)及其周圍炎癥和纖維化。近年P(guān)BC患病率和發(fā)病率均呈上升的趨勢[1]。血清抗線粒體抗體(AMA)為診斷PBC的特異性指標(biāo)，尤其AMA-M2亞型的陽性率高達(dá)90%～95%，但5%～10%的AMA陰性PBC患者極易漏診[2]，確診需行肝穿刺活檢，但該方法具有高風(fēng)險性、創(chuàng)傷性的缺點。因此，尋找更便捷、安全可靠的PBC診斷手段成為目前迫切的研究目標(biāo)和挑戰(zhàn)。

核磁共振光譜(NMR)作為代謝組學(xué)的常用方法，通過比較健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下小分子代謝物表達(dá)的差異，從而尋找疾病的生物標(biāo)記物[3]。該方法具有特異性強、無損傷、無輻射，樣品需要量少、幾乎無需前期處理[4]，幾乎對所有含氫化合物有響應(yīng)，錯誤率低于1%[5]等優(yōu)勢。目前國內(nèi)外對代謝組學(xué)的研究多集中于肝炎肝硬化、肝癌等疾病，深入探討PBC患者血清代謝物組的研究較為少見。本研究通過采用氫譜核磁共振(1H-NMR)技術(shù)檢測并比較PBC、乙型肝炎(HBV)肝硬化和對照組的血清代謝物，旨在探索能早期診斷PBC的特異性血清代謝物，從而為PBC發(fā)病機制的研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、資料來源

選取2015年4月—2016年1月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科的20例PBC、20例HBV肝硬化患者，均由臨床、影像學(xué)、實驗室檢查確診(部分患者經(jīng)肝活檢確診)，PBC患者依據(jù)美國肝臟病協(xié)會2010年制定關(guān)于PBC實驗研究若干問題準(zhǔn)則的標(biāo)準(zhǔn)納入[4,6]，HBV肝硬化患者符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]納入標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①HBV肝硬化合并酒精性肝硬化的患者；②合并丙型病毒等其他病毒性肝炎的患者；③合并藥物性肝炎、非酒精性脂肪肝、Budd-Chiari綜合征、Wilson病、血色病的患者；④合并肝癌等惡性腫瘤的患者；⑤妊娠和哺乳期婦女；⑥合并HIV抗體陽性的患者；⑦合并甲狀腺功能亢進(jìn)、痛風(fēng)等代謝性疾病的患者。選取同期20名健康志愿者作為對照組。所有受試者均簽署知情同意書，本研究方案通過昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、主要材料與試劑

Bruker Ascend 800M核磁共振譜儀(18.8T)購自德國Bruker公司；ST500-7 5 mm核磁管購自美國Norell公司；ST16R臺式低溫高速離心機購自美國Thermal Scientific公司；氘代甲醇(99.8 atom % D)購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；甲醇購自四川西隴化工有限公司。

三、方法

1. 血樣收集和血清制備：晨起6:00～8:00空腹?fàn)顟B(tài)下采集受試者外周血8 mL，4 ℃保存靜置，1 600×g離心15 min。取2 mL上層血清，加入5 μL 4%疊氮化鈉溶液，混勻，取400 μL分裝于離心小管中，-80 ℃冰箱儲存。

2. NMR樣品制備條件比較(預(yù)實驗)：采用隨機數(shù)字表法選擇1名受試者的血清樣品2 mL，分別與0.9% NaCl溶液、血清緩沖液、260 μL氘代甲醇、520 μL氘代甲醇混合，比較上述4種處理方式的一維1H-NMR圖譜變化，以確定最佳的NMR樣品制備方式。

3. NMR樣品制備和圖譜采集：根據(jù)NMR樣品制備條件的比較結(jié)果，為進(jìn)一步獲得較高濃度的代謝物和質(zhì)量更好的譜圖，對樣品制備方式進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每份血清樣品經(jīng)液氮速凍、甲醇提純、氘代甲醇溶解、離心等處理，轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)5 mm NMR核磁樣品管中，4 ℃保存待測。上核磁共振譜儀行1H-NMR檢測，獲取一維圖譜，每個譜圖采集64 k數(shù)據(jù)點，掃描累加64次，譜寬為20.02 ppm。

4. 數(shù)據(jù)處理分析：采用TopSpin 3.2軟件，通過自動相位校正、基線校正后導(dǎo)出為txt數(shù)據(jù)文件，并導(dǎo)入加載mvapack[8]的Octave軟件中，完成定標(biāo)、對齊、去除溶劑信號和無信號區(qū)域、智能劃框[9]和歸一化操作。智能劃框后獲得含281個變量的簡化數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Excel表格中，然后導(dǎo)入模式識別分析(SIMCA-P)軟件包進(jìn)行多變量分析。無監(jiān)督模式識別采用主成分分析(PCA)法，首先用于分析NMR數(shù)據(jù)以觀察樣品的分布和分離趨勢。有監(jiān)督模式識別采用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，模型算術(shù)式為X=TpPpT+ToPoT+E；Y=TpCpT+F(T：X的得分矩陣；P：X的荷載系數(shù)矩陣；上標(biāo)T：矩陣轉(zhuǎn)置；下標(biāo)p：預(yù)測；下標(biāo)o：正交；C：Y的荷載系數(shù)矩陣；E和F分別表示X、Y的殘差矩陣)。隨后用于改善分離和提高數(shù)據(jù)的解釋能力。

5. 模型驗證：采用7-fold交叉驗證(CV)-單因素方差分析(ANOVA)法對OPLS-DA模型的可靠性進(jìn)行驗證，CV的Q2>0.4表示模型成立，ANOVA的P<0.05表示模型成立。

6. 生物標(biāo)記物的初步鑒定：差異性代謝產(chǎn)物需同時滿足下述三個條件：①相關(guān)系數(shù)P(corr)大于臨界值時，表示代謝物含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義；②變量重要性投影(VIP)值>1的代謝物被認(rèn)為與各組間判定有關(guān)[10]；③非配對t檢驗的P<0.05時，該代謝物含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(采用Octave軟件statistics包完成非配對t檢驗)。在人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)中根據(jù)代謝物的化學(xué)位移值搜索可能的生物標(biāo)記物。

結(jié) 果

一、NMR樣品制備方式比較

預(yù)實驗結(jié)果顯示，血清經(jīng)凍干后加520 μL氘代甲醇的樣品制備方式最佳，其譜圖基線平穩(wěn)、除大分子效果好、信號丟失少(圖1)，故選擇該方式處理其他受試者血清樣品。

二、NMR譜圖和總體數(shù)據(jù)概覽

1H-NMR圖譜中存在4個異常觀測值，分別為H7、P3、P4、P7(圖2A)，與正常觀察值(圖2B)相比，其殘留的甲醇峰(3.471 ppm)異常升高，強度高于氘代甲醇(3.434 ppm, 五重峰)溶劑峰。為不影響

后續(xù)建模分析，去除這4個異常觀測值。

三、對照組與PBC組多變量分析

1. PCA：對照組與PBC組(去除異常觀測值P3、P4、P7)無明顯的分離趨勢(圖3A)，PCA累積解釋率為60.8%。

圖1 第四種樣品制備方式的1H-NMR圖譜(520 μL氘代甲醇方式)

2. OPLS-DA：對照組與PBC組沿著t1軸具有明顯的分離趨勢(圖3B)，CV-ANOVA雙驗證結(jié)果顯示OPLS-DA模型解釋率81.9%，預(yù)測率44.8%(P=0.029 3)，表明OPLS-DA模型有統(tǒng)計學(xué)意義，能顯著區(qū)分PBC組與對照組受試者。根據(jù)OPLS-DA模型的相關(guān)系數(shù)、VIP值(圖4)和非配對t檢驗，谷氨酰胺(Gln)、葉酸、尿刊酸(UCA)和4-乙基苯甲酸為兩組的差異性代謝物(表1)，與對照組相比，PBC組Gln濃度顯著降低，葉酸、UCA和4-乙基苯甲酸濃度顯著升高。

四、對照組與HBV肝硬化組多變量分析

1. PCA：對照組與HBV肝硬化組沿著t2軸有一定的分離趨勢(圖5A)，另有一個顯著的逸出觀測值(H20)，該異常值主要在t1軸表現(xiàn)與其他觀測值有顯著區(qū)別。PCA累積解釋率為60.0%。

C：對照組；B：HBV肝硬化組；P：PBC組；MeOD：氘代甲醇；MeOH：甲醇

A：PCA；B：OPLS-DA

圖4 對照組與PBC組的P(corr)和VIP散點圖

2. OPLS-DA：對照組與HBV肝硬化組有明顯的分離趨勢(圖5B)，模型解釋率59.3%，預(yù)測率為49.3%(P=1.69×10-4)，表明OPLS-DA模型有統(tǒng)計學(xué)意義，能顯著區(qū)分兩組受試者。根據(jù)OPLS-DA模型的相關(guān)系數(shù)、VIP值(圖6)和非配對t檢驗，UCA、1-甲基組胺、 1-甲基腺嘌呤、葡萄糖、L-乙酰肉毒堿為兩組的差異性代謝物(表2)，與對照組相比，HBV肝硬化組1-甲基腺嘌呤濃度顯著降低，UCA、1-甲基組胺、葡萄糖、L-乙酰肉毒堿濃度顯著升高。

表1 對照組與PBC組的差異性代謝物

A：PCA；B：OPLS-DA

序號VarIDP(corr)VIPP值(非配對t檢驗)差異性代謝物177．379530．750731．935626．57×10-10UCA202．88221-0．701601．891895．33×10-121?甲基組胺213．957730．596821．888445．33×10-121?甲基腺嘌呤225．215130．617611．854835．33×10-12葡萄糖235．56406-0．762711．853365．33×10-12L?乙酰肉毒堿

圖6 對照組與HBV肝硬化組的P(corr)和VIP散點圖

五、HBV肝硬化組與PBC組的多變量分析

PCA法顯示HBV肝硬化組與PBC組之間無分離趨勢(圖7)。OPLS-DA模型分析顯示兩組未能計算出正交組分，CV-ANOVA結(jié)果表明OPLS-DA模型無效，不能顯著區(qū)分兩組受試者。

圖7 PBC組與HBV肝硬化組的PCA分析(去掉異常值H7、P3、P4、P7)

討 論

肝臟發(fā)生免疫應(yīng)答和損傷時，會導(dǎo)致肝臟病理生理改變而相應(yīng)出現(xiàn)各類血清代謝物的顯性表達(dá)，代謝組學(xué)技術(shù)為臨床疾病的診斷、發(fā)病機制的研究提供了新的途徑和思路。本研究采用1H-NMR技術(shù)結(jié)合模式識別方法發(fā)現(xiàn)，OPLS-DA模型可篩選出PBC和對照組的差異性代謝物，其中PBC組血清Gln濃度較對照組明顯下降，葉酸、UCA、4-乙基苯甲酸濃度明顯升高。OPLS-DA模型亦能篩選出對照組與HBV肝硬化患者的5個差異性代謝物，其中HBV肝硬化組血清1-甲基腺嘌呤濃度較對照組明顯降低，而1-甲基組胺、葡萄糖、L-乙酰基肉堿、UCA濃度明顯升高。

Gln是一種非必需氨基酸，可參與多種肝臟生化代謝途徑[11]。大量研究表明，Gln對急慢性肝損傷有一定的保護(hù)作用。王偉強等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，Gln能降低大鼠血清ALT、AST水平，抑制肝組織NF-κB和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)，對急性肝損傷有明確的保護(hù)作用。閆靜[13]的研究表明Gln可通過抑制活性氧自由基的產(chǎn)生而提高抗氧化能力，能抑制炎癥反應(yīng)并減少肝細(xì)胞凋亡等。同時，Gln還具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成，促進(jìn)淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的增生和分化，是免疫反應(yīng)的重要物質(zhì)[14]。體外實驗[15]發(fā)現(xiàn)，Gln含量降低，單核巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能降低并直接影響巨噬細(xì)胞的特異性免疫功能，導(dǎo)致機體特異性免疫監(jiān)視和應(yīng)答能力下降，提示單核巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能依賴于Gln含量。亦有研究[16]發(fā)現(xiàn)Gln缺乏使肝臟Kupffer細(xì)胞的吞噬功能受阻，導(dǎo)致內(nèi)毒素不能及時被清除；補充Gln可增強肝臟Kupffer細(xì)胞的吞噬功能，加速肝臟對細(xì)菌和內(nèi)毒素的清除。鄭毅等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，添加Gln的全胃腸外營養(yǎng)患者的血清CD3、CD4/CD8比例明顯升高，NK細(xì)胞明顯下降，提示Gln可調(diào)節(jié)機體免疫，具有免疫增強的功能。

目前PBC的發(fā)病機制尚不明確，可能是機體對自身抗原的耐受性被打破，一系列始動因素誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，致使肝內(nèi)中小膽管上皮細(xì)胞不斷受到免疫系統(tǒng)的攻擊而引起炎性膽汁淤積最終發(fā)病。樹突細(xì)胞(DC)有免疫監(jiān)視、誘導(dǎo)免疫耐受的作用，PBC患者CD83+DC細(xì)胞數(shù)量減少[18]，提示DC對維持自身免疫耐受具有重要作用。血清Gln含量顯著減少，可導(dǎo)致DC增生分化減少，誘導(dǎo)免疫耐受機制削弱，導(dǎo)致PBC的發(fā)生。本研究中，PBC患者血清Gln濃度較對照組降低，提示Gln可能參與了PBC的發(fā)病并影響患者預(yù)后，可能為PBC潛在的特異性生物標(biāo)記物。

血清葉酸具有免疫調(diào)節(jié)的作用。Courtemanche等[19]發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏可導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞增殖明顯降低。有研究[20]發(fā)現(xiàn)PBC患者門管區(qū)和膽管周圍區(qū)域混合性炎癥反應(yīng)多以CD8+T細(xì)胞浸潤為主，表明CD8+T細(xì)胞的超反應(yīng)性可能參與肝臟損害，而且CD4+和CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答靶向抗原為自身PDC-E2，與PBC患者的免疫靶向抗原相同。動物實驗亦表明膽管損害程度與T細(xì)胞對自身PDC抗原被攻擊的程度一致[21]。上述研究提示CD8+T細(xì)胞的致病性在PBC發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。血清葉酸主要儲存于肝臟中，PBC患者存在肝細(xì)胞受損，尤其PBC失代償期廣泛的肝細(xì)胞壞死、纖維化時，葉酸貯存水平降低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化為活動性儲備型的四氫葉酸減少，葉酸有效利用率減少使血清葉酸含量升高[22]。本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者血清葉酸濃度較對照組增高，可能促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的增殖，使PBC患者膽管損傷進(jìn)行性加重，這可能與PBC的免疫損傷機制有關(guān)，但具體作用機制仍需進(jìn)一步研究。由此可見，血清葉酸有可能成為PBC潛在的重要生物標(biāo)記物。

4-乙基苯甲酸對人體具有低毒性，在肝臟中與甘氨酸結(jié)合生成馬尿酸并隨尿液排出體外，少量可與葡萄糖醛酸化合通過尿液排出[23]。4-乙基苯甲酸的解毒代謝主要在肝臟中進(jìn)行，肝硬化患者的解毒代謝過程需較長時間完成，或不能使其變?yōu)轳R尿酸隨尿液排泄，血清苯甲酸升高，加重肝臟負(fù)擔(dān)[24]。本研究中，PBC患者血清4-乙基苯甲酸較對照組明顯升高，考慮該代謝物與肝硬化可能有一定聯(lián)系，但尚需進(jìn)一步研究證實。

目前認(rèn)為UCA作為一種類細(xì)胞因子，具有免疫抑制的作用。Beissert等[25]認(rèn)為順式UCA通過破壞Langerhans細(xì)胞的細(xì)胞骨架而降低抗原呈遞功能，Langerhans細(xì)胞屬于DC群體，具有啟動初次免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受的功能。Wille等[26]認(rèn)為順式UCA可誘導(dǎo)釋放肥大細(xì)胞脫顆粒因子，進(jìn)而刺激IL-10等抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)免疫耐受。本研究中PBC患者血清UCA濃度明顯增高，使抗原遞呈功能減弱，破壞免疫監(jiān)視和免疫耐受機制，可能與PBC的發(fā)病有一定相關(guān)性。此外，UCA可導(dǎo)致內(nèi)毒素不能及時被清除，導(dǎo)致慢性內(nèi)毒素血癥，增加感染風(fēng)險。本研究顯示，UCA為PBC和HBV肝硬化組患者血清中的共同代謝物，均較對照組明顯升高，表明UCA并非PBC的特異性生物標(biāo)記物，但可能參與肝臟免疫反應(yīng)，在肝損傷、肝硬化的進(jìn)展中可能有密切聯(lián)系。

總之，1H-NMR技術(shù)結(jié)合模式識別方法可有效區(qū)分對照組與PBC或HBV肝硬化患者，但由于暫未收集其他原因，如酒精、血吸蟲、非酒精性、藥物性肝損傷等造成的肝硬化患者的相關(guān)數(shù)據(jù)，其與正常受試者構(gòu)建的OPLS-DA模型是否會出現(xiàn)類似情況尚未可知。本研究鑒定出Gln、葉酸可能是PBC的特異性生物標(biāo)記物，兩者與PBC的發(fā)病機制和預(yù)后可能有關(guān)，但具體作用機制仍需進(jìn)一步深入研究。后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格篩選病例，進(jìn)而增加研究的可靠性和可信度。

致謝 感謝中國科學(xué)院昆明植物研究所的胡凱峰博士、李興在讀博士在本研究中給予的大力幫助。

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(2016-07-20收稿；2016-09-03修回)

Preliminary Study on Serum Metabolites of Primary Biliary Cholangitis by Hydrogen Spectrum Nuclear Magnetic Resonance

YANGJing1,DUANDe2,WUHuamei1,YANGLihong1,LIYan1,YANGJinhui1.

1DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming(650101);2DepartmentofGastroenterology,DaliBaiAutonomousPrefecturePeople’sHospital,Dali,YunnanProvince

YANG Jinhui, Email: yangjing_dl@163.com

Hydrogen Spectrum Nuclear Magnetic Resonance; Liver Cirrhosis, Biliary; Diagnosis; Glutamine; Urocanic Acid

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.003

云南省醫(yī)療衛(wèi)生單位內(nèi)設(shè)研究機構(gòu)科研項目(No. 2014NS110)

△本文共同第一作者，楊婧，Email: yangjing_dl@163.com； 段德，Email: 782056206@qq.com

#本文通信作者，Email: yangjing_dl@163.com

Background: Hydrogen spectrum nuclear magnetic resonance (1H-NMR) is a commonly used method for metabolomics and has been applied in the study of liver cirrhosis and liver cancer, however, study on serum metabolites in patients with primary biliary cholangitis (PBC) is rare. Aims: To investigate the capability of1H-NMR for screening serum metabolites of PBC. Methods: Twenty PBC patients, 20 HBV-related cirrhosis patients and 20 healthy controls were detected by1H-NMR. The1H-NMR spectra data were processed by principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) so as to create the diagnostic model. Based on the correlation coefficientP(corr), VIP value and non-pairedttest of OPLS-DA model, the differential metabolites between normal group and the two cirrhosis groups were screened. Results: OPLS-DA model could effectively distinguish healthy controls and PBC patients, model interpretation ability and prediction ability were 81.9% and 44.8%, respectively (P=0.029 3), glutamine, folic acid, urocanic acid, 4-ethylbenzoic acid were differential metabolites. OPLS-DA model could also effectively distinguish healthy controls and HBV-related cirrhosis patients, urocanic acid, 1-methylhistamine, 1- methyladenine, glucose, L-acetylcarnitine were differential metabolites. OPLS-DA model could not effectively distinguish PBC patients and HBV-related cirrhosis patients. Conclusions: Serum glutamine and folic acid may be the potential biomarkers of PBC, which may be closely related to the immune damage mechanism and prognosis of PBC;1H-NMR combined with OPLS-DA diagnostic model are expected to become a new method for studying liver cirrhosis.