陳盛虎++徐小云++伍夢(mèng)瑤++黃瑩捷++姚燕妮++黃友誼

摘要：對(duì)分離純化得到的龍井43多酚氧化酶同工酶在30～50 ℃下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶同工酶PPOⅡ、PPOⅢ在30 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性最高，隨溫度的升高其熱穩(wěn)定性下降；多酚氧化酶粗酶的熱穩(wěn)定在40 ℃時(shí)最高，并整體高于多酚氧化酶同工酶的熱穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果給茶葉生產(chǎn)中維持適當(dāng)?shù)臏囟葋?lái)控制多酚氧化酶的活性提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶葉；多酚氧化酶；同工酶；酶活力；熱穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0095-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.024

Thermal Stability Analysis on Polyphenol Oxidase Isozymes from Camellia sinensis

CHEN Sheng-hu， XU Xiao-yun， WU Meng-yao， HUANG Ying-jie， YAO Yan-ni， HUANG You-yi

（Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Horticulture and Forestry Science College， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：The thermal stabilities of the polyphenol oxidase isozymes purified from Camellia sinensis cv. Longjing No. 43 were analyzed at 30～50 ℃，the results showed that the activities of two polyphenol oxidase isozymes PPOII and PPOIII were the highest under 30 ℃，and decreased with the increasing of temperature. The thermal stability of crude polyphenol oxidase was the highest under 40 ℃， and the overall thermal stability was higher than those of polyphenol oxidase isozymes. The experiment results provide a basis for maintaining appropriate temperature to control the activity of polyphenol oxidase in tea production.

Key words：Camellia sinensis； polyphenol oxidase； isozyme； enzyme activity； thermal stability

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO， EC 1.10.3.1）在茶葉生理代謝及產(chǎn)品加工中具有重要作用。目前對(duì)茶葉PPO粗酶[1-3]研究較多，對(duì)其同工酶[4-6]也有一些報(bào)道，但整體而言對(duì)茶葉PPO同工酶的研究相對(duì)匱乏[7，8]。除在綠茶[9]中需要快速鈍化PPO外，紅茶加工[10，11]以及固定化酶體外制備茶黃素[12-14]等過(guò)程中都需要PPO具有很好的催化活性和熱穩(wěn)定性。已證實(shí)茶葉PPO單一同工酶較粗酶有更高的催化效率[5，7]，并且茶葉PPO基因克隆和外源表達(dá)等方面的研究進(jìn)展[15，16]也使得催化活性高、熱穩(wěn)定性佳的單一同工酶的工業(yè)化利用成為可能。本研究在成功分離純化得到PPO同工酶的基礎(chǔ)上，分析了PPO同工酶的熱穩(wěn)定性，豐富了對(duì)茶葉PPO同工酶的研究，可為生產(chǎn)中控制茶葉PPO的活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

龍井43號(hào)（Camellia sinensis var. Longjing 43）一芽二葉鮮葉于2015年春采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)專業(yè)教學(xué)基地。

試驗(yàn)儀器：DEAE Sepharose CL-6B（GE Health Bio-Sciences AB公司）； Sephadex G-150（美國(guó)PHARMACIA公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（江蘇金壇中大儀器廠）；Synergy HT酶標(biāo)儀（基因有限公司）。所用試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PPO同工酶分離純化 按許雷等[7，17，18]PPO同工酶分離純化方法進(jìn)行分離純化。取適量茶鮮葉，加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮，5%，W/V）和0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（料液比1∶2），冰浴研磨，4 ℃下浸提12 h，離心、過(guò)濾制得粗酶液。對(duì)粗酶液進(jìn)行30%～80%的硫酸銨沉淀，將所得沉淀用適量0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液溶解后，再用4倍體積同樣的緩沖液脫鹽，制得上樣液。將上樣液用DEAE-Sepharose CL-6B材料進(jìn)行陰離子交換層析，選用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液各2倍柱體積進(jìn)行梯度洗脫，280 nm下檢測(cè)吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。再將收集峰用Sephadex G-150材料進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，選用含有0.10 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液等梯度洗脫，280 nm下檢測(cè)吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。重復(fù)上述過(guò)程，收集足量樣品，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.2 PPO同工酶的電泳檢測(cè) PPO同工酶條帶數(shù)量采用非變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳法進(jìn)行檢測(cè)。制備7.5%的分離膠和4%的濃縮膠。分別取PPOⅡ、PPOⅢ、粗酶液40 μL，加10 μL電泳上樣緩沖液混合后于12 000 r/min離心10 min，取20 μL上樣。冰浴條件下電泳，在樣品中溴酚藍(lán)遷移至靠近分離膠底部時(shí)停止。進(jìn)行酶特異性反應(yīng)染色30 min后，脫色至條帶清晰。

1.2.3 PPO同工酶熱穩(wěn)定性分析 將PPOⅡ、PPOⅢ、粗酶液分別置于恒溫水浴鍋中于30、40、50 ℃下溫浴60 min，每10 min取樣1次，快速冰浴降溫，測(cè)定酶活性。以未經(jīng)過(guò)熱處理的酶樣品單位酶活力值記為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3 PPO酶活力測(cè)定

取酶液10 μL于96孔板中，加入0.1 mol/L、pH 5.6的檸檬酸磷酸鹽緩沖液50 μL和75 μL反應(yīng)混合液（0.1 mol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液∶0.1%脯氨酸∶1%鄰苯二酚=10∶2∶3，現(xiàn)配現(xiàn)用），置于酶標(biāo)儀中37 ℃控溫反應(yīng)30 min，410 nm下每間隔1 min測(cè)定1次吸光值，根據(jù)30 min連續(xù)測(cè)定得來(lái)的吸光值曲線計(jì)算酶活力。將活性測(cè)定反應(yīng)液的吸光值每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 PPO半衰期計(jì)算

按袁新躍[19]的方法計(jì)算茶葉PPO的半衰期，計(jì)算公式：T1/2=0.693/kd，kd=2.303log（E0/E1）/t，其中E0為初始酶活力，E1為保存一段時(shí)間后的酶活力，t為PPO在不同溫度下的溫浴時(shí)間，本試驗(yàn)中t=1 h。

1.5 PPO蛋白含量測(cè)定

依據(jù)Bradford法，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)PPO同工酶分離純度鑒定

龍井43號(hào)茶樹(shù)鮮葉經(jīng)過(guò)勻漿浸提、硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析之后，非變性凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，從主要含有4條明顯PPO同工酶的粗酶中成功分離得到了第2、3條同工酶，分別記為PPOⅡ、PPOⅢ。從表1可知，PPOⅡ的比活力為1 293.97 U/mg，純化倍數(shù)為3.39；PPOⅢ的比活力為684.81 U/mg，純化倍數(shù)為1.79。在單位酶活力相近的情況下，粗酶蛋白質(zhì)含量為1.301 mg/mL，含雜蛋白最多，PPOⅡ蛋白質(zhì)含量為0.387 mg/mL，純度更高。許雷等[7]同樣利用龍井43號(hào)茶樹(shù)鮮葉分離得到變性電泳純的PPO同工酶，比活力為648.22 U/mg，純化倍數(shù)為1.30，同工酶純度較高，但酶活力下降，且得率很低，不便于后續(xù)試驗(yàn)分析。

2.2 不同溫度熱處理時(shí)PPO粗酶相對(duì)酶活性的變化

從圖2可以看出，龍井43號(hào)PPO粗酶活力在30 ℃熱處理時(shí)喪失最少，在第20分鐘時(shí)酶活力有明顯回升，此后酶活力持續(xù)下降，在第40分鐘時(shí)酶活力又有所回升，到60 min時(shí)相對(duì)酶活仍保留有62.41%，表明PPO粗酶在30 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性好。40 ℃處理60 min后，PPO粗酶相對(duì)酶活保留有65.71%，在第50分鐘時(shí)相對(duì)酶活也有明顯回升，表明PPO粗酶在30～40 ℃下較為穩(wěn)定。在50 ℃下時(shí)，PPO粗酶相對(duì)酶活快速喪失，10 min后相對(duì)酶活僅剩余43.22%，但在第30分鐘時(shí)又回升至68.64%，之后又快速下降，至60 min時(shí)僅剩19.03%。

2.3 不同溫度熱處理時(shí)PPO同工酶PPOⅡ相對(duì)酶活性的變化

如圖3所示，龍井43號(hào)PPO同工酶PPOⅡ在30 ℃熱處理10 min后，相對(duì)酶活為76.05%，在第20分鐘時(shí)有明顯回升，此后酶活力持續(xù)下降，在第60分鐘時(shí)又有少量回升，相對(duì)酶活剩余67.64%。在40 ℃和50 ℃處理時(shí)，PPOⅡ相對(duì)酶活隨熱處理時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降，但40 ℃第50分鐘時(shí)相對(duì)酶活有少量回升，至60 min時(shí)僅剩余28.29%；在50 ℃下處理時(shí)相對(duì)酶活喪失最為快速，10 min后僅剩余26.49%，此后下降速度變緩，第50分鐘時(shí)有極少量回升，在60 min后仍剩余21.57%，表明PPOⅡ在50 ℃熱處理10～60 min之間剩余的酶活保持穩(wěn)定。

2.4 不同溫度熱處理時(shí)同工酶PPOⅢ相對(duì)酶活性的變化

如圖4所示，龍井43號(hào)PPO同工酶PPOⅢ在30 ℃熱處理時(shí)相對(duì)酶活喪失最少。在40 ℃和50 ℃處理時(shí)，PPOⅢ相對(duì)酶活隨熱處理時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降，在40 ℃熱處理60 min后相對(duì)酶活為46.94%；50 ℃處理時(shí)相對(duì)酶活快速喪失，10 min后僅剩余44.46%，此后下降速度變緩，至60 min時(shí)保留有33.34%。

2.5 不同溫度熱處理對(duì)龍井43號(hào)PPO酶活力的影響

如圖2、圖3、圖4所示，龍井43號(hào)PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ等3個(gè)酶分別在30～50 ℃溫度下溫浴60 min后，酶活力相比初始酶活力均明顯下降。根據(jù)不同溫度下溫浴60 min后酶活力的變化值，計(jì)算出龍井43號(hào)PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ等3個(gè)酶分別在30～50 ℃溫度下的半衰期，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，30 ℃下PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ的半衰期分別為1.48、1.78、1.38 h，PPOⅡ的熱穩(wěn)定性顯著高于PPO粗酶和PPOⅢ（P<0.05），PPO粗酶和PPOⅢ之間無(wú)顯著差異。40 ℃下PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ的半衰期分別為1.65、0.55、0.92 h，PPO粗酶的半衰期最長(zhǎng)，PPOⅡ的半衰期最短，三者間表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。50 ℃下PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ的半衰期分別為0.42、0.45、0.63 h，PPO粗酶和PPOⅡ的酶活力保持時(shí)間相近，PPOⅢ酶活力保留時(shí)間較長(zhǎng)，與前兩者間有極顯著差異（P<0.01），但PPO粗酶與PPOⅡ之間無(wú)顯著差異。由以上可知，PPO粗酶在40 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性高于其他溫度；而PPOⅡ和PPOⅢ在30 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性最好。

3 小結(jié)與討論

3.1 茶葉PPO酶活力的熱穩(wěn)定性

整體可見(jiàn)，茶葉PPO酶活力隨熱處理溫度升高和時(shí)間延長(zhǎng)依次下降，30 ℃下PPO酶活力保留量較多，50 ℃時(shí)PPO酶活力即快速喪失。劉琨[20]發(fā)現(xiàn)碧螺春鮮葉PPO在30 ℃熱處理時(shí)酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)先升后降，40 ℃時(shí)酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，在50 ℃熱處理時(shí)酶活力下降趨勢(shì)明顯強(qiáng)烈，與本研究結(jié)果一致。酶活力的喪失與酶蛋白空間構(gòu)型的改變有直接關(guān)系，熱處理是改變酶蛋白活性中心結(jié)構(gòu)的常見(jiàn)方法[9]。高溫能破壞H鍵或疏水鍵，從而使酶空間構(gòu)型變化，活力喪失，溫度越高破壞作用越強(qiáng)，酶活力喪失越快。茶葉PPO在30～50 ℃范圍內(nèi)仍保留酶活力，說(shuō)明在此溫度范圍內(nèi)，只有部分PPO構(gòu)型發(fā)生改變。在30 ℃下茶葉PPO酶活力較50 ℃時(shí)高，且半衰期較50 ℃時(shí)長(zhǎng)，說(shuō)明處理溫度越低，PPO活性中心的構(gòu)型越穩(wěn)定。另外茶葉PPO在30～50 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)多次酶活力回升的現(xiàn)象，可能是PPO酶蛋白空間構(gòu)型的改變是可逆的，或是形成活性更高的PPO蛋白質(zhì)構(gòu)型。

3.2 茶葉PPO同工酶與粗酶的熱穩(wěn)定性差異

對(duì)PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ等3個(gè)酶樣進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析后可知，單一條帶的PPOⅡ、PPOⅢ在30～50 ℃熱處理過(guò)程中，酶活力值回升次數(shù)明顯少于粗酶，且在相同溫度下酶活力的保留量也低于粗酶液，說(shuō)明單一條帶的PPOⅡ、PPOⅢ熱穩(wěn)定性較PPO粗酶差，可能是因?yàn)槲唇?jīng)純化的PPO粗酶中含有較多的雜蛋白或多肽，能對(duì)PPO蛋白起保護(hù)作用，增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性；而同工酶蛋白較粗酶純，受溫度作用更為直接，活性喪失快。榮紹豐等[21]也發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)和多肽對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶有保護(hù)作用，能增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，該發(fā)現(xiàn)支持了這一推論。但在30 ℃時(shí)PPOⅡ、PPOⅢ的活性增幅較粗酶明顯，且PPOⅢ在60 min內(nèi)平均酶活力值較粗酶高，說(shuō)明在30 ℃時(shí)PPO蛋白結(jié)構(gòu)受熱破壞作用不明顯，此溫度下單一條帶同工酶較粗酶催化效率更高。

3.3 茶葉PPO同工酶的熱穩(wěn)定性在生產(chǎn)上的應(yīng)用

酶蛋白在反應(yīng)溫度條件下分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是其發(fā)揮催化作用的關(guān)鍵，探明茶葉PPO及其同工酶在不同溫度條件下的熱穩(wěn)定性，可為其實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。內(nèi)源PPO在植物生理代謝及茶葉加工中的重要作用已無(wú)需贅言，外源PPO在紅茶發(fā)酵及茶黃素制備等方面應(yīng)用前景亦十分廣闊[10，19]。在實(shí)際生產(chǎn)中，紅茶發(fā)酵和體外酶促制備茶黃素等過(guò)程反應(yīng)溫度均在30 ℃左右，這與PPO粗酶、PPOⅡ和PPOⅢ在30 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性高是相一致的。由此可見(jiàn)，在紅茶生產(chǎn)中進(jìn)行鮮葉萎凋和渥紅發(fā)酵以及體外樣化制備茶黃素等，均需注意控制溫度，維持PPO酶活性，促進(jìn)氧化過(guò)程的進(jìn)行。

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