孫 寧,胡 飛

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

表面復(fù)合修飾納米超順磁性材料固定化α-淀粉酶性能研究

孫 寧,胡 飛*

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

以復(fù)合修飾的納米超順磁性Fe3O4顆粒聚集體為載體固定化α-淀粉酶,比較分析固定化α-淀粉酶及游離α-淀粉酶的酶學(xué)性能。研究固定化及游離α-淀粉酶的最適溫度、最適pH、操作穩(wěn)定性及基本動(dòng)力學(xué)等。結(jié)果表明,固定化α-淀粉酶最適pH為7,最適溫度為60 ℃。固定化α-淀粉酶與游離α-淀粉酶相比,具有更好的溫度和酸堿的耐受性。固定化α-淀粉酶重復(fù)催化反應(yīng)10次,相對(duì)酶活力仍剩余72.09%,重復(fù)操作的半衰期為18.97次,具有良好的操作穩(wěn)定性。固定化α-淀粉酶的米氏常數(shù)Km值為45.31 mg/mL,親和性弱于游離α-淀粉酶。

α-淀粉酶,超順磁性,固定化,酶學(xué)性能

固定化酶因可回收利用,方便分離,且比游離酶具有更廣泛的環(huán)境適應(yīng)性等優(yōu)勢(shì),故在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛應(yīng)用[1]。固定化酶的性能取決于固定化酶所使用的載體材料的性質(zhì)和固定化方法。近幾十年,各種有關(guān)固定化酶技術(shù)和載體材料的研究都取得了重大發(fā)展,固定化酶的載體材料包括高分子材料[2]、無(wú)機(jī)材料[3]以及復(fù)合材料[4]等。磁性納米載體作為一種新型的復(fù)合材料,可以在外加磁場(chǎng)的作用下方便快捷的實(shí)現(xiàn)酶的分離回收,因此引起了人們的極大關(guān)注。此類(lèi)載體的核心由磁性納米顆粒組成,外面包被有一層有機(jī)或無(wú)機(jī)分子的殼,同時(shí)通過(guò)表面修飾的方法可以在載體表面引入多種反應(yīng)性功能基團(tuán)(如羥基、氨基、巰基等),從而連接酶,實(shí)現(xiàn)酶的固定化[5]。

α-淀粉酶(α-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶,E.C.3.2.1.1),普遍分布在動(dòng)物、植物和微生物中[6]。它以隨機(jī)作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1,4葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等[7],是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一[8-9]。

低共熔試劑是由兩種或多種成分按一定化學(xué)計(jì)量比混合,通過(guò)氫鍵能夠自組裝形成的一類(lèi)常溫下為液態(tài)的低共熔混合物,因其無(wú)毒、低成本、原子利用率高,所以,被認(rèn)為是一種新型的綠色溶劑[9]。利用符合綠色化學(xué)理念的低共熔試劑和二氧化硅對(duì)Fe3O4納米顆粒進(jìn)行復(fù)合修飾,Fe3O4顆粒聚集體形成核-殼穩(wěn)定性結(jié)構(gòu),同時(shí)又具有表面活性基團(tuán),能有效與酶結(jié)合[10]。

本文以復(fù)合修飾的納米超順磁性Fe3O4顆粒聚集體為載體,制備出具有磁響應(yīng)性的固定化α-淀粉酶,比較分析固定化α-淀粉酶及游離α-淀粉酶的酶學(xué)性能,為α-淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硝酸鐵、硫酸亞鐵、氨水(NH3·H2O,v/v,25%～28%)、無(wú)水乙醇、甲醇、尿素、乙二醇、甘油、正硅酸乙酯(TEOS)、檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉 廣東光華科技股份有限公司;氯化膽堿、戊二醛(v/v,25%)、可溶性淀粉 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;碘、碘化鉀 由上海銀碘化工有限公司,均為分析純;α-淀粉酶 上海阿拉丁有限公司。

pHS-25型酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司;JJ-2增力電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠;752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 廣州市化興科學(xué)儀器有限公司;BAS124S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(德國(guó))有限公司;PTFE水熱合成反應(yīng)釜 上海耀冠儀器有限公司;DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;kQ-250DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SiO2包覆Fe3O4超順磁性納米顆粒(Fe3O4@ SiO2) 采用水熱法制備[11]Fe3O4超順磁性納米顆粒,再用溶膠凝膠法[12]將SiO2包覆Fe3O4超順磁性納米顆粒即得。

1.2.2 低共熔試劑對(duì)SiO2包覆Fe3O4超順磁性納米顆粒表面修飾(Fe3O4@SiO2-DES) 按表1稱(chēng)取氯化膽堿和氫供體試劑,在100 ℃水浴下加熱,不斷攪拌,至溶劑澄清透明為止(約20 min),即得低共熔點(diǎn)試劑DES1、DES2、DES3。

取1 mL DES和3 mL甲醇混合均勻,將0.1 g SiO2包覆Fe3O4超順磁性納米顆粒(Fe3O4@ SiO2)加入到上述DES混合液中,超聲波10 min后,攪拌2 h,磁鐵吸引分離,用水、無(wú)水乙醇交替洗滌至中性,45 ℃烘箱中烘干[13]。

表1 低共熔試劑原料配比Table 1 List of raw materials ratio for deep eutectic solvents

注:DES1、DES2和DES3為制備的3種低共熔試劑縮寫(xiě)。

1.2.3 復(fù)合修飾顆粒交聯(lián)法固定化α-淀粉酶 采用戊二醛交聯(lián)法固定化α-淀粉酶,稱(chēng)取10 mg復(fù)合修飾的磁性納米顆粒,洗滌,用磁鐵分離,將洗滌后的顆粒分散在2 mL 5%的戊二醛溶液中超聲波處理10 min,室溫下振蕩交聯(lián)反應(yīng)1 h,棄去上清液,用磷酸緩沖液洗滌至無(wú)游離戊二醛,加入4 mL濃度為146.2 μg/mL酶液,室溫下攪拌固定化3 h,磁鐵吸引分離,取上清液檢測(cè)酶活力,用10～20 mL磷酸緩沖液洗滌至無(wú)酶洗出。

1.2.4 酶活力及固載量測(cè)定 淀粉酶活力測(cè)定方法參照GB/T24401-2009[14]的方法。相對(duì)酶活力(%)指在同組實(shí)驗(yàn)中以固定化酶的活力最高值為100%,其它值與最高值的活力之比。

10 mg的復(fù)合修飾載體顆粒在不同酶濃度(2.92、5.85、29.24、54.48、146.2、584.8 μg/mL)下固定,通過(guò)初始酶濃度(C初始酶)與固定化后的酶濃度(C初始酶)的測(cè)定,得復(fù)合修飾顆粒固載量。在酶濃度為146.2 μg/mL固定化酶,測(cè)固定化酶相對(duì)酶活力。其中,酶濃度參照考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[15],可以用下面公式進(jìn)行計(jì)算:

固載量(μg/10 mg載體)=(C初始酶-C剩余酶)×V

其中,式中V為酶液體積。

1.2.5 復(fù)合修飾顆粒聚集體固定化α-淀粉酶的酶學(xué)特性 酶學(xué)特性均以固載能力較佳的復(fù)合修飾顆粒為載體固定化α-淀粉酶為研究對(duì)象。

1.2.5.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 10 mg載體固定化α-淀粉酶在pH4、5、6、7、8、9磷酸緩沖液下,以1 mg/mL淀粉液為底物,溫度60 ℃的條件下,測(cè)定酶活力,考察最適pH。固定化酶在以上不同pH緩沖液中的30 ℃水浴條件下保溫2 h后降溫至室溫,測(cè)定酶活力,考察酶在不同pH下的穩(wěn)定性。同時(shí)使用游離α-淀粉酶作為對(duì)比。

1.2.5.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 10 mg載體固定化α-淀粉酶分別在溫度50、55、60、65、70 ℃,1 mg/mL淀粉液為底物,pH為6的條件下,測(cè)定酶活力,考察最適作用溫度。固定化酶在pH6.0緩沖液的30、45、60、75、90 ℃水浴中保溫2 h后,降溫至室溫,測(cè)定酶活力,考察酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。同時(shí)使用游離α-淀粉酶作為對(duì)比。

1.2.5.3 固定化α-淀粉酶催化水解的基本動(dòng)力學(xué) 以可溶性淀粉溶液為底物,分別配制濃度為0.2、0.25、0.5、1、2、4、5、6、8、10 mg/mL的底物溶液,測(cè)定底物濃度變化,計(jì)算酶解速率,分析酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化趨勢(shì)與規(guī)律,同時(shí)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,獲取游離酶和固定化酶的特征Km參數(shù)。

1.2.5.4固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性 在連續(xù)測(cè)定條件下,固定化酶的活性下降為最初活性的一半時(shí)所經(jīng)歷的次數(shù)稱(chēng)為固定化酶的操作半衰期[16]。

固定化α-淀粉酶在60 ℃下,pH6.0磷酸緩沖液,1 mg/mL淀粉液催化反應(yīng)5 min,反應(yīng)結(jié)束后,磁性分離,測(cè)定酶活力。磁性分離后的固定化酶再用于重復(fù)相同條件下的催化反應(yīng),依次類(lèi)推,共催化10個(gè)批次,分別測(cè)定每次結(jié)束后酶活力。以首次酶活力為100%,計(jì)算每次反應(yīng)結(jié)束后酶活力的相對(duì)百分比,評(píng)價(jià)固定化酶的重復(fù)使用性。

酶在使用過(guò)程中,有熱失活和自水解失活現(xiàn)象,兩種失活狀況可用以下的公式表示:

式(1)

α=e-kdt

式(2)

其中,殘余酶活α,原酶E,部分失活的酶E1,無(wú)活性的酶Ed,產(chǎn)物P,k1和k2分別是熱失活和自水解速率常數(shù),CE0為酶的初始濃度,kd和kb分別是熱失活和自水解的表觀速率常數(shù)。

在較低的酶濃度下,自水解對(duì)酶失活的影響可以忽略,式(1)可簡(jiǎn)化為式(2)。以殘余酶活的負(fù)對(duì)數(shù)與重復(fù)使用次數(shù)作圖,圖中直線(xiàn)的斜率即為操作條件下酶失活速率常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行,采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合修飾顆粒固定化α-淀粉酶比較分析

由圖1可知,三種復(fù)合修飾顆粒在不同酶濃度下固載的酶量,隨酶蛋白濃度的增加,固載量均先快速增加,在146.2 μg/mL處后趨于平穩(wěn),增加速率緩慢,在酶蛋白濃度為584.8 μg/mL時(shí),DES1、DES2和DES3三種復(fù)合修飾顆粒固載酶量分別為145.2、79.78、183.2 μg/10 mg。DES1,DES2和DES3在146.2 μg/mL酶蛋白濃度處固定化淀粉酶的相對(duì)酶活力分別74.89%、38.19%、100%,可以看出DES3表面修飾的復(fù)合顆粒具有更大固載酶量和相對(duì)酶活力。所以,以此類(lèi)低共熔試劑對(duì)納米超順磁性Fe3O4顆粒進(jìn)行表面化學(xué)修飾,可使表面引入充分的-NH2、-OH等功能性基團(tuán),既能發(fā)揮其極性和低揮發(fā)性,又能提高載體與酶結(jié)合效率。

圖1 三種DES修飾的固載酶量及相對(duì)酶活力Fig.1 Adsorption capacity and relativeactivity of immobilized amylase注:a.10 mg載體固載酶量;b.146.2 μg/mL酶濃度固定化酶相對(duì)酶活力。

2.2 最適pH和pH穩(wěn)定性

由圖2可知,游離酶和固定化酶分別在pH6、7時(shí)相對(duì)酶活力最大,即游離酶和固定化酶的最適pH分別為6和7。兩種酶在pH低于5或高于8環(huán)境下活力均急劇下降,在pH5～8范圍內(nèi)變化較平緩,固定化酶在此范圍內(nèi)相對(duì)活力基本保持不變,維持在97.5%以上,低于游離酶活力下降幅度,說(shuō)明游離酶比固定化酶對(duì)pH更為敏感,適用范圍較窄,即偏離最適pH,酶活力下降較大。

圖2 pH對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on relative activity of free and immobilized enzyme

由圖3可知,固定化酶在pH4保溫2 h后,酶活力下降明顯低于游離酶,在pH9處的活力下降也較游離酶略低,說(shuō)明固定化酶有較強(qiáng)的酸堿耐受性。結(jié)合圖2～圖3,固定化酶具有更寬的pH適用性和較強(qiáng)的酸堿耐受性。這是因?yàn)閺?fù)合修飾的顆粒載體固定化酶,使酶的結(jié)構(gòu)改變,部分反應(yīng)活性中心和酸堿敏感性中心被掩藏而對(duì)酸堿較為遲鈍,進(jìn)而保持較大的活性。

圖3 游離酶和固定化酶活力的pH穩(wěn)定性Fig.3 The pH stability of free and immobilized enzyme

2.3 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

由圖4可知,游離酶與固定化酶在溫度60 ℃時(shí)相對(duì)酶活力最大,偏離此溫度都有顯著的下降,表明游離酶與固定化酶的最適溫度均為60 ℃。在50～60 ℃范圍內(nèi),固定化酶相對(duì)酶活力變化較平緩,可保持86.2%以上,遠(yuǎn)高于游離酶的58.0%。在60～70 ℃范圍內(nèi),固定化酶下降幅度仍小于相應(yīng)的游離酶。

由圖5可知,在30～90 ℃各溫度下保溫處理后,固定化酶的相對(duì)酶活均高于游離酶,固定化酶隨溫度升高酶活力下降較游離酶緩慢,且均保持在47.8%以上,游離酶的相對(duì)酶活力下降較大。

表2 固定化酶和游離酶的V-[S]及Lineweaver-Burk曲線(xiàn)方程Table 2 Equations of V-[S]and Lineweaver-Burk curves

圖4 溫度對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on relative activity of free and immobilized enzyme

說(shuō)明酶經(jīng)固定化后對(duì)溫度的耐受性增加,熱穩(wěn)定性提高,這是由于固定化可以提高酶分子的剛性,從而提高其耐熱性。Chen等[17]也得到了類(lèi)似的結(jié)果。

圖5 游離酶和固定化酶活力的溫度穩(wěn)定性Fig.5 The temperature stability of free and immobilized enzyme

2.4 固定化α-淀粉酶的基本動(dòng)力學(xué)

圖6和表2兩種固定化酶和游離酶的V-[S]圖可知,固定化酶與游離酶的酶解速度均隨淀粉濃度的增加而增加。游離酶的酶解速度與底物濃度高度線(xiàn)性相關(guān),而固定化酶則體現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。在底物濃度0～5 mg/mL范圍內(nèi),變化趨勢(shì)擬合為二次函數(shù)模型。在5～10 mg/mL范圍內(nèi),與底物濃度線(xiàn)性相關(guān),為一次函數(shù)關(guān)系,且固定化酶酶解速度均較游離酶大,表明在較高的底物濃度時(shí)固定化酶具有更好的催化速度。

圖6 固定化酶和游離酶的V-[S](a)及Lineweaver-Burk(b)曲線(xiàn)Fig.6 The V-[S](a)and Lineweaver-Burk(b)curves of free and immobilized enzyme

利用雙倒數(shù)作圖法以1/V對(duì)1/[S]繪制Lineweaver-Burk曲線(xiàn),結(jié)果如圖6和表2,Km曲線(xiàn)所示。通過(guò)公式:1/V=(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax可獲取特征參數(shù)Km。游離酶和固定化酶的Km值分別為38.38、45.31 mg/mL。固定化酶Km值增大說(shuō)明固定化酶的親和力降低,酶固定化后較普遍存在的現(xiàn)象[18]。這是由于固定化后,酶分子不能自由運(yùn)動(dòng),載體的存在增大了酶周?chē)目臻g位阻,酶與載體結(jié)合使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致。

2.5 固定化酶的操作穩(wěn)定性

由圖7可知,重復(fù)催化反應(yīng)10次,固定化酶活力下降較平穩(wěn),操作4次后可維持90%以上的相對(duì)酶活力,10次后仍有72.09%的相對(duì)酶活力。根據(jù)擬合方程計(jì)算,酶失活速率常數(shù)為0.039,操作半衰期為18.97次,誤差在2.1%內(nèi)。因此,經(jīng)復(fù)合修飾后交聯(lián)法固定化酶,酶與載體的結(jié)合效果較好,酶不易從載體上脫落導(dǎo)致酶活降低,復(fù)合修飾的納米超順磁性Fe3O4顆粒為載體固定化α-淀粉酶重復(fù)使用較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

以復(fù)合修飾的納米超順磁性Fe3O4顆粒為載體固定化α-淀粉酶,DES3修飾的載體具有較強(qiáng)的固載酶能力。通過(guò)對(duì)酶的溫度、pH、操作穩(wěn)定性及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究,結(jié)果表明,固定化α-淀粉酶最適pH為7,最適溫度為60 ℃;固定化α-淀粉酶與游離酶相較,具有更強(qiáng)的溫度和酸堿的耐受性。

固定化α-淀粉酶的催化水解速度在較低的底物濃度下可通過(guò)指數(shù)函數(shù)回歸方程表征相互間變化規(guī)律,在5～10 mg/mL底物濃度下,符合一次函數(shù)關(guān)系,具有更大的酶解速度。固定化酶Km值為45.31 mg/mL,親和性比游離酶弱,經(jīng)重復(fù)催化反應(yīng)10次,酶活力仍剩余72.09%,重復(fù)操作的半衰期為18.97次,具有良好的操作穩(wěn)定性。

[1]朱啟忠,丁姝婷,李玉婷. 不同載體對(duì)淀粉酶固定化的比

圖7 固定化酶的循環(huán)操作穩(wěn)定性Fig.7 The recycle stability of immobilized enzyme注:a：連續(xù)操作10循環(huán)固定化酶的相對(duì)酶活力變化曲線(xiàn);b：-ln(Et/E)與循環(huán)次數(shù)曲線(xiàn)。

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Magnetic nanoparticles composite-modified by deep eutectic solvents and silica for immobilization ofα-amylase

SUN Ning,HU Fei*

(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

The composite-modified nano-superparamagnetic Fe3O4particle aggregates as the carrier,α-amylase was immobilized by method of covalent linkage. The application performance of immobilizedα-amylase and freeα-amylase were studied. The temperature,pH value,the operation stability and the basic kinetics of them were compared,respectively. The results showed that optimal pH value and temperature of immobilizedα-amylase were 7 and 60 ℃,general similar with that of freeα-amylase. Compared with the freeα-amylase,immobilizedα-amylase had better resistance of acid,alkali and temperature. After 10 recycles,relative activity of immobilized enzyme was still remaining 72.09%,half-life period deduced 18.97 times. Immobilizedα-amylase had better operation stability. Kmof immobilizedα-amylase was 45.31 mg/mL,and the affinity was weaker than freeα-amylase.

α-amylase;superparamagnetic;immobilization;enzymatic property

2016-06-17

孫寧(1989-)，女，碩士，主要從事谷物科學(xué)與工程方面的研究，E-mail：1214031666@qq.com。

*通訊作者:胡飛(1972-)，男，博士，副教授，主要從事谷物科學(xué)與工程方面的研究，E-mail：g95216@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271824)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.036