牛廣旭 吳士茜 劉志權(quán) 劉小慧 田云霄

MCM7、Rb、c-MYC在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其在基因通路中的作用

牛廣旭 吳士茜 劉志權(quán) 劉小慧 田云霄

目的 探討MCM7、Rb、c-MYC等基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其在基因通路中的意義。方法 選取2013年1月至2015年8月邯鄲市中心醫(yī)院手術(shù)切除的60例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織進(jìn)行免疫組化染色，分析MCM7、Rb、c-MYC等基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況。結(jié)果 MCM7蛋白僅在肝細(xì)胞癌組織(73.3%)中表達(dá)，顯著高于正常肝組織和肝硬化組織(P<0.05)；Rb蛋白在肝硬化組織(53.3%)和肝細(xì)胞癌組織(58.3%)中表達(dá)，兩者陽性率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；肝細(xì)胞癌組織(70.0%)中c-MYC蛋白陽性率顯著高于肝硬化組織(35.0%)(P<0.05)。MCM7蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑、AFP、組織分化程度和臨床分期有關(guān)(P<0.05)，而與病灶數(shù)、是否轉(zhuǎn)移及HBsAg是否陽性無關(guān)(P>0.05)；Rb蛋白的表達(dá)僅與腫瘤組織分化程度有關(guān)(P<0.05)；c-MYC蛋白表達(dá)與腫瘤組織分化程度和是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。MCM7蛋白和Rb陽性率呈顯著負(fù)相關(guān)(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018)。結(jié)論 肝細(xì)胞癌的發(fā)生是多基因多通路相互作用的結(jié)果，多種調(diào)控蛋白的異常共同導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

肝細(xì)胞癌；MCM7蛋白；Rb蛋白；c-MYC蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:210～213)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的1種類型，分子水平的研究被認(rèn)為是揭示其發(fā)生機(jī)制及尋找治療靶點(diǎn)的突破口[1]。近年來，許多與HCC相關(guān)的基因和蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)[2]，如微小染色體維持蛋白7(MCM7)可調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制和延伸，與腫瘤形成密切相關(guān)；核蛋白癌基因(c-MYC)的產(chǎn)物磷酸化蛋白P62c-mgc具有使肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的能力；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因(Rb)促進(jìn)G0期靜止細(xì)胞提前進(jìn)入分裂周期而過度增殖[3]。然而，由于HCC發(fā)生的基因通路錯(cuò)綜復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制仍未被完全揭示，因此只有了解各癌癥相關(guān)基因和蛋白間的關(guān)系，才能揭示其在HCC發(fā)生中的意義。本文通過檢測(cè)MCM7、c-MYC和Rb在HCC細(xì)胞中的表達(dá),分析其相關(guān)性，探討其在基因通路中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2015年8月邯鄲市中心醫(yī)院手術(shù)切除的60例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織為肝細(xì)胞癌組，將此60例患者癌旁(超過腫瘤邊界2 cm以上)硬化的肝組織作為肝硬化組，再選取同期入院的25例肝血管瘤組織周邊的正常肝組織為對(duì)照組。所有肝癌患者術(shù)前均未行放療或化療及其他治療。肝細(xì)胞癌組和肝硬化組患者中男性47例，女性13例，年齡45～69歲，平均(55.6±2.4)歲；正常組患者中男性15例，女性10例，年齡38～64歲，平均(54.1±2.2)歲。3組患者間性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。肝細(xì)胞癌臨床分期參照《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[4]分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)。本文符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)范，醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并通過了此次研究。

1.2 主要試劑

鼠抗人單克隆抗體MCM7購(gòu)于武漢艾美捷公司，鼠抗人單克隆抗體Rb購(gòu)于北京中杉金橋公司，鼠抗人單克隆抗體C-myc購(gòu)于武漢博士德公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

切除的組織經(jīng)10%甲醛固定后用石蠟包埋。將包埋好的標(biāo)本切4 μm厚后脫蠟至水，室溫下將切片浸沒于0.3%過氧化氫溶液中15～20 min，然后把切片浸入枸椽酸鹽抗原修復(fù)液中，再放入100 ℃恒溫水槽中，20 min后取出恒溫水槽，于室溫下繼續(xù)在修復(fù)液中冷卻，后用PBS液洗3次，每次5 min。分別加入按1∶100稀釋的濃縮型鼠抗人單克隆抗體MCM7、鼠抗人單克隆抗體Rb和鼠抗人單克隆抗體c-MYC，置于4 ℃冰箱過夜。取出后室溫靜置30 min，滴加二抗37 ℃溫浴20 min，PBS水洗3次后滴加辣根過氧化物酶和二氨基聯(lián)苯胺顯色。最后蘇木精復(fù)染3 min，流水沖洗10 min，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。陰性對(duì)照以PBS代替Ⅰ抗作為陰性片，陽性對(duì)照為已知的陽性片。

1.4 結(jié)果判斷

在高倍鏡(×400)下觀察腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒判為陽性細(xì)胞。每份標(biāo)本隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)500個(gè)，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比。陽性細(xì)胞率≥10%判斷為陽性，陽性細(xì)胞率<10%判斷為陰性。

1.5 記錄指標(biāo)

記錄每份腫瘤標(biāo)本的大小，單發(fā)多發(fā)、分化程度、有無轉(zhuǎn)移等，其中分化程度按照Edmondson-Steiner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)。所有標(biāo)本觀察記錄和閱片由2名病理科醫(yī)師完成和確診。同時(shí)調(diào)取每份標(biāo)本來源的患者術(shù)前血清甲胎蛋白(AFP)水平和乙肝表面抗原(HBsAg)記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MCM7、c-MYC和Rb在不同肝組織中表達(dá)情況

3種蛋白在正常組織中均為陰性；MCM7蛋白僅在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)，與正常組織和肝硬化組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Rb蛋白在肝硬化組織(53.3%)和肝細(xì)胞癌組織(58.3%)中表達(dá)，兩者陽性率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；肝細(xì)胞癌組織中c-MYC蛋白陽性率(70.0%)顯著高于肝硬化組織(35.0%)(P<0.05)。見表1。

表1 MCM7、c-MYC和Rb在不同肝組織中表達(dá)情況(例，%)

注：*為與正常組織相比，P<0.05；#為與肝硬化組織相比，P<0.05。

2.2 臨床病理特征與MCM7、c-MYC和Rb表達(dá)的相關(guān)性

MCM7蛋白的表達(dá)在不同腫瘤直徑、AFP、組織分化程度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在不同的病灶數(shù)、是否轉(zhuǎn)移及HBsAg是否陽性方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；Rb蛋白的表達(dá)僅在不同腫瘤組織分化程度方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；c-MYC蛋白表達(dá)在不同腫瘤組織分化程度和是否轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 MCM7與Rb的相關(guān)性

MCM7 蛋白陽性率隨臨床分期升高而升高，而隨腫瘤組織分化程度降低而升高；而Rb蛋白的陽性率表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。2種蛋白陽性率呈顯著負(fù)相關(guān)(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018)。見表3。

表2 與MCM7、c-MYC和Rb表達(dá)的相關(guān)因素(例，%)

表3 MCM7與Rb的相關(guān)性(例，%)

3 討論

肝癌是人類最常見的腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展過程受多種分子及其組成的機(jī)制調(diào)控[5]。

Rb基因家族是真核細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在細(xì)胞周期和分化的調(diào)控中起到重要作用，其突變或缺失與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺小細(xì)胞癌及肝癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)可抑制Cyclin-CDK激酶活性，使Rb維持去磷酸化的狀態(tài)與E2F形成復(fù)合物，阻斷了E2F的轉(zhuǎn)錄活性。PDGF、EGF、IL2等生長(zhǎng)因子與其相應(yīng)受體結(jié)合，通過信號(hào)傳遞促進(jìn)Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放并解除對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F蛋白的抑制[7]，游離的E2F進(jìn)入核內(nèi)可與c-MYC、二氫葉酸還原酶、TK及E2F1等基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，這些基因產(chǎn)物進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S調(diào)控點(diǎn)[8]，使細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)行。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織分化越好Rb蛋白陽性率越高，而臨床分期越晚Rb蛋白陽性率越低。可能是由于當(dāng)Rb基因突變或缺失，細(xì)胞中游離的E2F數(shù)量增加，激活c-MYC等基因，促進(jìn)G0期靜止細(xì)胞提前進(jìn)入分裂周期而過度增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

以往研究發(fā)現(xiàn)[9]，在海拉癌細(xì)胞株細(xì)胞周期中MCM7及細(xì)胞分裂周期蛋白6(Cdc6)位于c-MYC基因上游的DNA復(fù)制起始區(qū)域。Cdc6參與構(gòu)成復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物(ORC)，是確保細(xì)胞在一個(gè)細(xì)胞周期中只復(fù)制一次的重要因子，也是DNA復(fù)制起始和延伸最重要的因子[10]。本研究中MCM7蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑、組織分化程度和臨床分期有關(guān)(P<0.05)，而與病灶數(shù)、是否轉(zhuǎn)移及HBsAg是否陽性無關(guān)(P>0.05)。MCM7和Cdc6在S期早期和G1中晚期共集聚在同一個(gè)基因c-MYC198bp區(qū)段，之后整個(gè)S期和G2期分布在序列350 bp區(qū)段。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)MCM7和ORC1在G1晚期也共集聚在c-MYC198bp區(qū)域[11]。因此MCM7在DNA復(fù)制、合成中也起到關(guān)鍵作用，MCM7失調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，Rb蛋白的表達(dá)僅與腫瘤組織分化程度有關(guān)(P<0.05)；c-MYC蛋白表達(dá)與腫瘤組織分化程度和是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

文獻(xiàn)報(bào)道[12]，MCM7與Rb相互作用可抑制DNA復(fù)制，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程。MCM7羧基末端137個(gè)氨基酸與Rb相連因子(p107、p130)相互作用形成Rb-MCM7復(fù)合物[13]。只有具有催化活性的CyclinD1/CDK4可促使其解離，釋放出MCM7，促進(jìn)復(fù)制前復(fù)合物(pre-RC)形成[14]。因此Rb缺失將導(dǎo)致DNA異常復(fù)制，復(fù)制調(diào)控機(jī)制失去作用。本研究結(jié)果顯示，MCM7 蛋白陽性率隨臨床分期升高而升高，而隨腫瘤組織分化程度降低而升高；而Rb蛋白的陽性率表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，即MCM7蛋白與Rb蛋白陽性率呈顯著負(fù)相關(guān)(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018)。這可能是由于Rb缺失使MCM7表達(dá)異常增高，從而啟動(dòng)異常的DNA復(fù)制。

綜上所述，肝細(xì)胞癌的發(fā)生是多基因多通路相互作用的結(jié)果，多種調(diào)控蛋白的異常共同導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

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(編輯：甘 艷)

Expression of MCM7,Rb,c-MYC Protein in Hepatocellular Carcinoma Tissues and Its Effect on Gene Passageway

NIUGuangxu,WUShiqian,LIUZhiquan,etal.

HandanCentralHospital,Handan,056001

Objective To investigate the expression of MCM7,Rb,c-MYC protein in hepatocellular carcinoma tissues and its effect on gene passageway.Methods Tumor tissues of 60 cases of hepatocellular carcinoma were performed immunohistochemistry stain,the expression of MCM7,Rb and c-MYC genes in hepatocellular carcinoma were analyzed.Results MCM7 protein expressed only in HCC tissue(73.3%),which was significantly higher than normal liver tissues and liver cirrhosis tissues(P<0.05).Rb protein expressed in liver cirrhosis(53.3%) and HCC tissues(58.3%),the positive rates between the 2 tissues had no statistical difference(P>0.05).Positive rate of c-MYC protein in HCC tissue(70.0%) was significantly higher than that in liver cirrhosis tissues(35.0%)(P<0.05).The expression of MCM7 was related to tumor size,AFP,differentiation degree and clinical stage(P<0.05),and not related to tumor foci,metastasis and HBsAg(P>0.05).The expression of Rb was related to differentiation degree only(P<0.05).The expression of c-MYC was related to differentiation degree and metastasis(P<0.05).The positive rate of MCM7 was negatively correlated to that of Rb protein(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018).Conclusion The occurrence of hepatocellular carcinoma is the consequence of polygene and multichannel.Anomaly of multiple protein co-induce the occurrence of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma;MCM7 protein;Rb protein;c-MYC protein

056001 河北省邯鄲市中心醫(yī)院(牛廣旭，吳士茜，劉小慧，田云霄)；050021 河北省石家莊市第五醫(yī)院(劉志權(quán))

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.011

R735.7

A

1001-5930(2017)02-0210-04

2016-03-24

2016-07-18)