蘭慶芝 馬靜靜 董衛(wèi)國

武漢大學人民醫(yī)院消化內科(430060)

蛋白質組學在胃癌生物學標記物研究中的應用

蘭慶芝*馬靜靜 董衛(wèi)國#

武漢大學人民醫(yī)院消化內科(430060)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，早期診斷和早期治療是改善患者預后的關鍵。近年來，應用蛋白質組學技術，通過分析、比較胃癌中異常表達的蛋白質，已發(fā)現一系列與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關的蛋白，這些蛋白有潛力成為胃癌早期診斷和患者預后預測的生物學標記物。本文對近年來胃癌相關蛋白質組學生物學標記物的研究進展作一綜述。

胃腫瘤； 蛋白質組學； 生物學標記； 診斷； 預后

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，由于早期胃癌缺乏典型癥狀，多數患者確診時已處于中晚期，這也是盡管近幾十年來胃癌的治療手段有了革命性的進展，但患者預后仍不理想的主要原因。早期診斷和早期治療是改善胃癌患者預后的關鍵。內鏡活檢病理檢查是目前胃癌早期診斷的主要方法，但內鏡檢查具有侵入性，對診斷技術的要求亦較高。因此，尋找可應用于臨床的血清生物學標記物對于提高胃癌早期診斷率，進而改善患者預后具有重要意義。

蛋白質組(proteome)的概念最早由Marc Wilkins提出，是指由一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質[1]。近20年來，作為一種高通量、高靈敏度的技術，蛋白質組學(proteomics)已被廣泛應用于各種惡性腫瘤的臨床研究。應用蛋白質組學技術，通過分析、比較胃癌中異常表達的蛋白質，已發(fā)現一系列與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關的蛋白，這些蛋白有望經進一步研究成為胃癌早期診斷和患者預后預測的生物學標記物。本文對常用蛋白質組學技術以及近年來胃癌相關蛋白質組學生物學標記物的研究進展作一綜述。

一、蛋白質組學主要研究技術

1. 雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)：2-DE技術問世至今已有30余年，其原理是將蛋白質按不同等電點和相對分子質量進行分離，電泳后根據蛋白質上樣量對膠進行考馬斯亮藍染色、銀染色或熒光染色，然后使用相關軟件對電泳圖像進行分析。較之問世之初，目前2-DE的分辨率、靈敏度和可重復性都有了很大的改善。然而該技術仍存在下述問題亟待解決：①微量蛋白的鑒定；②極酸或極堿蛋白的分離；③極大蛋白(>200 kDa, 1 Da=0.992 1 u)或極小蛋白(< 10 kDa)的分離；④難溶蛋白的檢測。此外，2-DE尚有不能完全自動化、操作耗時長等缺點。

2. 雙向差異凝膠電泳(two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)：2D-DIGE是一項在2-DE基礎上發(fā)展而來的新技術，與經典2-DE相比具有更高的動力學范圍和靈敏度。該技術可將3種以不同熒光染料標記的蛋白樣品在同一塊凝膠上進行雙向電泳，通過測定激發(fā)不同熒光染料所得到的熒光強度，比較蛋白表達水平的差異。由于是同時在同一塊膠上進行3種蛋白樣品分析，減少了跑膠次數以及不同膠上蛋白點陣的變異，使檢測結果更為準確，既節(jié)省時間，又提高了可重復性，有取代傳統(tǒng)2-DE的趨勢。2D-DIGE的缺點主要在于分析通量低。

3. 表面增強激光解析電離飛行時間質譜(surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spec-trometry, SELDI-TOF-MS)：SELDI-TOF-MS是新近興起的一項全新的蛋白質組學技術，包括蛋白質芯片、飛行時間質譜和智能分析軟件三部分。該技術的工作原理是基于蛋白質芯片的特異性吸附作用，利用激光脈沖輻射使被結合的蛋白質解析形成帶電離子，離子在真空場中飛行的時間因質荷比不同而異，以此為基礎繪制質譜圖，最后經軟件分析即可得到蛋白質相關信息。SELDI-TOF-MS具有簡單、快速、高通量、高靈敏度等優(yōu)點，可對樣品中的蛋白質進行全景式分析，已被廣泛應用于腫瘤標記物的篩查等研究。

二、胃癌相關蛋白質組學生物學標記物

1. 電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC1)：Schein等[2]于 1976年率先將源自草履蟲線粒體的具有電壓依賴性和陰離子選擇性的蛋白嵌入脂質雙層膜，并將該蛋白命名為VDAC。VDAC是相對分子質量為31 kDa的孔道蛋白， 存在于所有真核生物的線粒體外膜上，是線粒體與胞質間分子交換的通道，并參與調控線粒體途徑的細胞凋亡[3]。VDAC有3種亞型，分別為VDAC1、VDAC2和VDAC3，三者氨基酸序列高度相似。VDAC各亞型在大部分組織中均能檢測到，只是數量上存在差異。

Gao等[4]于2015年首次報導了VDAC1與胃癌的關系。該研究聯合應用串聯質譜標簽(tandem mass tag)和質譜分析定量比較非癌與胃癌組織線粒體蛋白的豐度差異，結果顯示VDAC1在胃癌組織線粒體中的表達量是毗鄰非癌組織的1.77倍，同時證實臨床胃癌組織中亦存在VDAC1表達異常，指出VDAC1是一個有應用前景的胃癌生物學標記物。

2. 血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)：SAA是一種主要由肝臟合成、分泌的急性時相蛋白，正常情況下在機體內表達水平不高，在創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤狀態(tài)下則可明顯升高[5]。蛋白質組學研究發(fā)現SAA可能作為腎癌[6]、神經母細胞瘤[7]等惡性腫瘤的血清生物學標記物。

Chan等[8]采用2-DE和質譜分析比較了96例胃癌患者根治性胃切除術前后以及32例胃潰瘍患者和52例健康體檢者的SAA水平，發(fā)現胃癌患者SAA水平顯著高于健康體檢者和胃潰瘍患者，并與腫瘤分期和部位相關。多變量分析顯示SAA水平與腫瘤部位和有無淋巴結轉移相關。術后隨訪中，胃癌復發(fā)者的SAA水平顯著升高，未復發(fā)者則無明顯變化。生存分析顯示，SAA>97 mg/L的患者死亡風險增加4倍。上述發(fā)現提示SAA可用于胃癌患者的預后預測和術后隨訪中腫瘤復發(fā)的監(jiān)測。我國學者采用免疫分析方法對SAA在胃癌患者中的臨床意義進行了探討，亦發(fā)現胃癌患者SAA水平顯著升高，并與腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理特征和術后復發(fā)相關，可作為胃癌侵襲、轉移、復發(fā)和預后評估的生物學標記物[9-10]。

Wang等[11]對中國216例胃腺癌患者和333例健康志愿者的血清標本行液相蛋白芯片多重檢測，結果顯示胃癌患者SAA水平較健康志愿者高3.7倍，進一步的分析發(fā)現有遠處轉移的胃癌患者SAA水平顯著高于未發(fā)生遠處轉移者，未轉移者與健康志愿者之間則無明顯差異。ROC曲線分析顯示，SAA水平診斷轉移性胃腺癌具有較高的準確性(AUC=0.834)。

3. 葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)：GRP78是由內質網合成的一種內質網分子伴侶，參與蛋白質的折疊和組裝，同時也是一種應激蛋白，在低氧、低鈣等應激狀態(tài)下大量表達以維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定。已有大量研究表明，GRP78在某些腫瘤細胞中過表達，并與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及化療敏感性有關。

Wu等[12]的研究納入胃癌患者的手術標本，采用2D-DIGE分析胃癌組織及其配對正常組織間的差異表達蛋白，并以蛋白質印跡法和免疫組化法進行驗證。實驗結果顯示，包括GRP78在內的5個蛋白有望成為胃癌相關生物學標記物。蛋白質印跡法檢測證實GRP78在胃癌組織中表達顯著上調，并與腫瘤分期有相關趨勢。免疫組化法檢測則顯示GRP78僅表達于胃腺癌細胞，正常組織中未見其表達。楊磊等[13]關于GRP78在胃癌中表達及其臨床意義的免疫組化研究亦表明，GRP78在胃癌組織中的陽性表達率與腫瘤浸潤深度、組織學分級、TNM分期和淋巴結轉移顯著相關，其高表達與胃癌細胞化療耐藥有關，多因素分析顯示GRP78表達是胃癌患者無病生存期的獨立影響因素，由此認為GRP78可作為評估胃癌惡性程度和化療敏感性的分子標記物，用于指導化療和判斷預后。蛋白質間相互作用分析顯示，KIAA1324可與GRP78結合，通過抑制GRP78與caspase-7的相互作用以及GRP78介導的AKT活化而誘導細胞凋亡，從而阻斷GRP78的致癌活性[14]。

4. α-烯醇化酶(α-enolase, ENO1)：ENO1屬于烯醇化酶家族成員，其功能為在糖酵解中催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸轉化，是糖酵解過程中的限速酶。ENO1在某些惡性腫瘤中高表達可加速糖酵解過程，為腫瘤細胞提供快速增殖所需的能量，從而參與促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

蛋白質組學研究發(fā)現，ENO1在cagA陽性幽門螺桿菌(Hp)感染的胃上皮細胞中的表達較cagA基因敲除Hp感染細胞明顯上調；進一步的分析顯示CagA蛋白系通過激活Src和MEK/ERK信號通路上調ENO1表達[15]。上述發(fā)現為Hp相關胃癌發(fā)病機制的研究提供了新線索，亦表明ENO1可能作為cagA陽性Hp相關胃癌的分子標記物。關于胃癌患者ENO1表達及其臨床意義的免疫組化研究[16]顯示，胃癌組織中的ENO1陽性表達率顯著高于胃潰瘍組織(67.3%對30.4%)，并與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期相關，是胃癌患者預后判斷和治療監(jiān)測的潛在生物學標記物。胃癌細胞轉染攜帶ENO1基因的真核表達載體后，增殖活力、克隆形成能力和遷移能力均顯著增強，亦表明ENO1可作為胃癌發(fā)生、發(fā)展的生物學標記物[17]。

5. 絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(Serpin peptidase inhibitor clade A member 1, SERPINA1)：SERPINA1又名α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin)，該蛋白分布廣泛，在人體組織和血液中有較高的含量和較強的穩(wěn)定性，眾多研究顯示其可能與多種腫瘤的發(fā)病有關。

Yang等[18]的研究選取70例胃癌患者和72例健康志愿者，采用磁珠純化聯合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技術篩選可能的胃癌血清學標記物，發(fā)現SERPINA1和ENOSF1在胃癌患者中呈特異性高表達。Kwon等[19]的研究發(fā)現，SERPINA1過表達可促進胃癌細胞侵襲和遷移，其在胃癌組織中表達增強與腫瘤大小、浸潤深度、神經和淋巴血管侵襲、淋巴結轉移以及預后不良呈顯著正相關，可能作為預測胃癌患者預后的生物學標記物。

三、結語與展望

蛋白質組學在發(fā)現和檢測腫瘤生物學標記物方面具有不可替代的優(yōu)勢，有望成為胃鏡活檢之外早期發(fā)現胃癌的輔助手段，然而目前臨床實踐中仍缺乏敏感性和特異性均較理想的胃癌生物學標記物。盡管已有一些研究表明某些蛋白與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預后顯著相關，但仍需開展多中心大樣本臨床試驗加以驗證，方可廣泛應用于臨床。

1 Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, et al. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J]. Biotechnol Genet Eng Rev, 1996, 13: 19-50.

2 Schein SJ, Colombini M, Finkelstein A. Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from paramecium mitochondria[J]. J Membr Biol, 1976, 30 (2): 99-120.

3 Shoshan-Barmatz V, Ben-Hail D. VDAC, a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J]. Mitochondrion, 2012, 12 (1): 24-34.

4 Gao W, Xua J, Wang F, et al. Mitochondrial Proteomics Approach Reveals Voltage-Dependent Anion Channel 1 (VDAC1) as a Potential Biomarker of Gastric Cancer[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 37 (6): 2339-2354.

5 Uhlar CM, Whitehead AS. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant[J]. Eur J Biochem, 1999, 265 (2): 501-523.

6 Tolson J, Bogumil R, Brunst E, et al. Serum protein profiling by SELDI mass spectrometry: detection of multiple variants of serum amyloid alpha in renal cancer patients[J]. Lab Invest, 2004, 84 (7): 845-856.

7 Combaret V, Bergeron C, Bréjon S, et al. Protein chip array profiling analysis of sera from neuroblastoma patients[J]. Cancer Lett, 2005, 228 (1-2): 91-96.

8 Chan DC, Chen CJ, Chu HC, et al. Evaluation of serum amyloid A as a biomarker for gastric cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2007, 14 (1): 84-93.

9 蔡利勵，譚立明，沈威，等. 血清淀粉樣蛋白A對胃癌的臨床診斷價值[J]. 中國實驗診斷學, 2011, 15 (7): 1073-1076.

10 劉東紅，張云，唐小萬，等. 血清淀粉樣蛋白A對早期胃癌診斷的研究[J]. 醫(yī)學研究雜志, 2014, 43 (6): 107-110.

11 Wang J, Ma R, Sharma A, et al. Inflammatory serum proteins are severely altered in metastatic gastric adenocarcinoma patients from the Chinese population[J]. LoS One, 2015, 10 (4): e0123985.

12 Wu JY, Cheng CC, Wang JY, et al. Discovery of tumor markers for gastric cancer by proteomics[J]. PLoS One, 2014, 9 (1): e84158.

13 楊磊，楊書云，季建美，等. 葡萄糖調節(jié)蛋白78在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 中華腫瘤雜志, 2013, 35 (11): 837-842.

14 Kang JM, Park S, Kim SJ, et al. KIAA1324 Suppresses Gastric Cancer Progression by Inhibiting the Oncoprotein GRP78[J]. Cancer Res, 2015, 75 (15): 3087-3097.

15 Chen S, Duan G, Zhang R, et al.Helicobacterpyloricytotoxin-associated gene A protein upregulates α-enolase expression via Src/MEK/ERK pathway: implication for progression of gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2014, 45 (2): 764-770.

16 倪田根，高晨，周欣，等. 胃癌組織中烯醇化酶-α和腫瘤型丙酮酸激酶蛋白的表達及其臨床意義[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2011, 18 (5): 524-527.

17 Liu YQ, Huang ZG, Li GN, et al. Effects of α-enolase (ENO1) over-expression on malignant biological behaviors of AGS cells[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8 (1): 231-239.

18 Yang J, Xiong X, Wang X, et al. Identification of peptide regions of SERPINA1 and ENOSF1 and their protein expression as potential serum biomarkers for gastric cancer[J]. Tumour Biol, 2015, 36 (7): 5109-5118.

19 Kwon CH, Park HJ, Lee JR, et al. Serpin peptidase inhibitor clade A member 1 is a biomarker of poor prognosis in gastric cancer[J]. Br J Cancer, 2014, 111 (10): 1993-2002.

(2016-06-02收稿；2016-08-25修回)

Application of Proteomics in Research of Biomarkers for Gastric Cancer

LANQingzhi,MAJingjing,DONGWeiguo.

DepartmentofGastroenterology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan(430060)

DONG Weiguo, Email: dwg@whu.edu.cn

Gastric cancer is one of the most commonly seen malignant tumors in digestive tract. Early diagnosis and treatment is crucial for the improvement of patients’ survival. By analyzing the proteins aberrantly expressed in gastric cancer using proteomics technologies, a series of proteins that are strongly related to the occurrence and development of gastric cancer have been identified, which are promising to be applied for the early diagnosis and prediction of patients’ prognosis. This article reviewed the recent advances in research on proteomic biomarkers for gastric cancer.

Stomach Neoplasms; Proteomics; Biological Markers; Diagnosis; Prognosis

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.015

*Email: 2011302180143@whu.edu.cn

#本文通信作者，Email: dwg@whu.edu.cn