申樹林

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科，南寧市 530021)

·綜 述·

人精子相互作用蛋白的研究進展▲

申樹林

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科，南寧市 530021)

生物體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)不是單獨發(fā)揮作用，而是以復(fù)合體(蛋白質(zhì)相互作用)形式發(fā)揮某種生物學(xué)功能，人精子蛋白質(zhì)也不例外。近年來，一些研究者在人精子發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用、精子運動蛋白質(zhì)相互作用和受精相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用研究方面進行了卓有成效的探索，并取得了令人振奮的成果。這些成果對男性不育的病因、發(fā)病機制和男性避孕等研究有重要意義。

精子；蛋白質(zhì)；相互作用

隨著精子蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)大多數(shù)是以復(fù)合體(蛋白質(zhì)相互作用)形式發(fā)揮某種生物學(xué)功能，只有對復(fù)合體組分進行深入研究，才能清楚各個蛋白質(zhì)的功能。近年來，一些學(xué)者在人精子蛋白相互作用方面進行了卓有成效的探索，并取得了令人振奮的成果，本文將對這些研究綜述如下。

1 精子發(fā)生的相互作用蛋白研究

精子的發(fā)生要經(jīng)過三個階段才能成為成熟的精子細胞，即精原干細胞增殖分化、精母細胞減數(shù)分裂和精子形成。這些階段均是在許多基因和蛋白質(zhì)的調(diào)控下進行的，當(dāng)然，蛋白質(zhì)復(fù)合體(即相互作用蛋白)起到至關(guān)重要的作用。若此過程受到干擾，就會使精子生成障礙而導(dǎo)致無精子癥、少精癥、弱精癥、畸形精子癥等，引起男性不育。

精子形成首先是精原干細胞進行增殖分化和有絲分裂，有學(xué)者在此方面進行了研究。其方法是運用CytoTrap?XR酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人睪丸HSD-4的cDNA文庫和蛋白質(zhì)表達，實驗驗證HSD-4蛋白與MAFB蛋白質(zhì)有相互作用。MAFB主要分布于細胞核，在許多細胞分化和組織形成過程中起著重要作用[1]，表明HSD-4可能在精原細胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)了一個人類睪丸特異性表達新基因-HMGB4，該基因在小鼠粗線期精母細胞開始表達并增加直至圓形精子細胞形成，在成熟的附睪精子中并沒有表達。免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜方法篩選和鑒定出丙酮酸脫氫Ela亞單位(PDHAI)與HMGB4蛋白結(jié)合。PDHAI屬于丙酮酸脫氫酶系中的成員，催化丙酮酸脫羧反應(yīng)。HMGB4可能是一個潛在的轉(zhuǎn)錄抑制子[2]，HMGB4和PDHAI蛋白相互作用可能在精原細胞的分化和分裂中發(fā)揮某種作用。生精細胞的凋亡在保持精子生成數(shù)量方面扮演重要作用。PIAS(protein inhibitor of activated，STAT)蛋白家族有四個成員:PIASI、PIAS2、PIAS3和PIASy，其中PIAS2又有兩個亞型PIASxa和PIAS2，均在人睪丸組織中特異表達。研究發(fā)現(xiàn)RACK1與PIAS2有相互作用，相互作用的關(guān)鍵區(qū)域為RACK1的WD5-WD7結(jié)構(gòu)域，二者共定位于細胞中，說明RACK1蛋白是一個新的相互作用蛋白。敲除PIAS2基因后睪丸生成精子數(shù)量減少，細胞凋亡增加，表明PIAS2與RACK1復(fù)合體可能通過細胞凋亡途徑影響精子的形成[3]。

減數(shù)分裂是精子細胞形成中的特有現(xiàn)象，如果出現(xiàn)異常就會導(dǎo)致睪丸生精功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)MLH1缺失導(dǎo)致精母細胞粗線期停滯，表明MLH1在精子發(fā)生中具有重要作用。殷毅等[4]采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了可能與 MLH1有相互作用的蛋白RHNO1，然后采用免疫共沉淀和GST pull-down技術(shù)驗證二者有相互作用，由此表明MLH1與RHNO1復(fù)合體蛋白參與了精子形成中的減數(shù)分裂和同源重組。GGNl在生殖細胞發(fā)育的減數(shù)分裂前后表達，通過酵母雙雜交實驗和免疫共沉淀技術(shù)證實GGNBP2與GGNl有相互作用。GGNBP2在睪丸、初級精母細胞和減數(shù)分裂時期[5]均有表達，但在圓形精細胞中無表達。GGNl和GGNBP2為相互作用蛋白，并且在減數(shù)分裂階段都有表達，提示他們在減數(shù)分裂中起重要作用。

精子形成是指精子細胞由圓形變成如同蝌蚪樣的成熟精子。RSB66是一個新發(fā)現(xiàn)的基因，該基因編碼含168個氨基酸殘基的多肽鏈。采用酵母雙雜交系統(tǒng)和Western Blot等方法研究發(fā)現(xiàn)RSB66與HSD45有相互作用，體內(nèi)外實驗均得到確證蛋白激酶CK2屬于信使非依賴性絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核細胞中，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和分化等方面發(fā)揮重要作用。敲除實驗小鼠CK2基因，引起精子生成減少和圓頭精子，導(dǎo)致實驗小鼠不育，此現(xiàn)象與人圓頭精子相似。利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選和驗證轉(zhuǎn)換蛋白1(TPI) 與CK2有相互作用，實驗結(jié)果對研究人圓頭精子的發(fā)生有重要意義[7]。

精子形成也是在一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的調(diào)控下實現(xiàn)的，F(xiàn)AM3A(family with sequence similarity)是細胞因子FAM3家族成員之一。研究者運用酵母雙雜交等技術(shù)和方法，篩選并驗證了蘇氨酸激酶(TSSK4)與FAM3有相互作用。TSSK4與FAM3在睪丸圓形精子表達，而TSSK4是一種磷酸化激酶，可能通過蛋白質(zhì)磷酸化在精子形成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[8]。

2 與精子運動有關(guān)的相互作用蛋白研究

精子的運動能力對于自然受精至關(guān)重要，眾多的研究已經(jīng)證明精子的運動能力是在附睪獲得的。Eppin基因特異性在睪丸和附睪表達，Eppin蛋白通過調(diào)控精液的凝固和液化過程，影響精子的獲能和運動。進一步研究發(fā)現(xiàn)，精囊分泌的纖維連接蛋白Fibronectin與Eppin特異性結(jié)合，可能的機制是在射精過程中，附睪精子通過射精管時與精囊分泌液中的Fibronectin發(fā)生相互作用[9]。另有研究將重組Eppin (rEppin)和重組精囊凝固蛋白Semenogelin (rSg)共同孵育，免疫共沉淀和Western驗證rEppin與rSg有相互作用。Eppin與Sg發(fā)生特異性結(jié)合，是通過Sg分子結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸殘基Cys-239結(jié)合位點實現(xiàn)的，如果Cys-239還原及羧甲基化將阻礙rEppin與rSg的結(jié)合[10]。還有研究者運用質(zhì)譜、免疫沉淀和Western blots技術(shù)從人精液Eppin蛋白復(fù)合體中鑒定出了lactotransferrin、clusterin、 semenogelin三個蛋白，三者共定位于精子尾部[11]。有研究鑒定EPPIN復(fù)合體中相互作用蛋白EPPIN′s的氨基酸序列，EPPIN′s序列C102-P133包含與semenogelin結(jié)合的主要位點。在相同區(qū)域序列F117-P133結(jié)合EPPIN復(fù)合體相關(guān)蛋白lactotransferrin (LTF)，表明在EPPIN C-terminus的Cys102、Tyr107、Phe117對于SEMG1結(jié)合是必需的[12]。蛋白質(zhì)相互作用的鑒定對于完全理解生物學(xué)過程和相關(guān)生化通路蛋白的功能是至關(guān)重要的。Tomar等[13]運用免疫共沉淀、SDS-PAGE和質(zhì)譜法對人精漿泌乳素誘導(dǎo)蛋白(PIP)相互作用蛋白進行研究，三個相互作用蛋白被鑒定，分別是人類血清白蛋白，zinc-α-2糖蛋白和semenogelin I，這是第一次報告人類精漿中的PIP和semenogelin之間有相互作用，這對精子的獲得運動能力的研究有幫助。

精子的能量代謝對其運動同樣重要，研究發(fā)現(xiàn)DNAJBl3在人類睪丸組織中高表達，定位于成熟精子尾部鞭毛中段放射軸、外側(cè)微管、外周致密纖維以及線粒體，提示其功能與精子運動相關(guān)。突變篩查研究結(jié)果提示其功能與人類特發(fā)性弱精癥相關(guān)。采用免疫共沉淀方法聯(lián)合質(zhì)譜分析篩查DNAJBl3在人成熟精子中相互作用的蛋白，提示其作用機制可能是通過與HKI和LDHC的相互作用，參與成熟精子的糖代謝過程從而影響精子的運動[14]。

精子膜蛋白既是精子的重要組成成分，又是許多受體與相應(yīng)的配體特異性結(jié)合調(diào)節(jié)精子運動的作用靶點，酵母雙雜交和pull-down實驗驗證YWK-II蛋白與MIS有相互作用。研究表明人精子單跨膜蛋白YWK-II可能是MIS的作用受體，二者的結(jié)合可能對精子的運動及生存力起重要作用[15]。另一方面精子膜通透性和一些鈣調(diào)蛋白通過調(diào)節(jié)鉀、鈣等離子的濃度而調(diào)控精子的運動，如睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP 86-IV和Tecktin 4。申樹林等[16]采用蛋白質(zhì)組技術(shù)在研究特發(fā)性弱精子癥患者精子蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的蛋白質(zhì)，為了研究這兩種蛋白的功能，我們用免疫共沉淀技術(shù)，以Tektin 4抗體為誘餌從人精子總蛋白中釣取Tektin 4復(fù)合體，并對復(fù)合體進行質(zhì)譜鑒定， 發(fā)現(xiàn)了semenogelin I、semenogelin-1 preproprotein和semenogelin II三個蛋白。由此表明Tektin 4和semenogelin蛋白復(fù)合體(也稱為相互作用蛋白)在精子運動中發(fā)揮重要作用。另外用克隆技術(shù)獲得睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP86-IV的編碼基因，構(gòu)建融合基因表達載體并進行重組蛋白表達，采用串聯(lián)親和純化技術(shù)和免疫共沉淀法分離出TS-CBP86-IV蛋白復(fù)合體，再用質(zhì)譜鑒定出可能與其相互作用的蛋白質(zhì)12個，數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)部分蛋白參與精子運動調(diào)控[17]。

3 受精相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用蛋白研究

精卵融合，也稱為受精，整個受精過程包括精子與卵子識別、精子穿透透明帶、卵子激活和精卵核融合。從分子水平上闡明精卵相互作用在有性生殖領(lǐng)域是一個尚未解決的問題。研究者利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)方法揭示精卵融合可能的蛋白質(zhì)相互作用和相關(guān)的分子功能。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)顯示新的相互作用：包括人卵細胞CD151、CD9與人精子CD49相互作用；精子的CD49、ITGA4、CD63分別于卵細胞的CD63和 CD81相互作用，也與卵子CD9發(fā)生相互作用[18]。通過分析網(wǎng)絡(luò)，確定精-卵相互作用的主要分子功能，需要進一步的實驗研究證實。Ezrin作為一種連接蛋白，將細胞膜和膜蛋白以及骨架蛋白等連接起來，從而形成或維持微絨毛和細胞膜突起等特殊結(jié)構(gòu)。相反，如果抑制ezrin功能，將會影響細胞的這些結(jié)構(gòu)。ezrin在細胞內(nèi)的主要作用是調(diào)控細胞形態(tài)或者介導(dǎo)細胞與細胞、或細胞與基質(zhì)之間的粘附等。研究發(fā)現(xiàn)ezrin分別與F-actin、RhoGDll、cd44有相互作用。通過實驗結(jié)果分析及結(jié)合相關(guān)研究，王蕾[19]推測人精子獲能過程中ezrin、RhoGDll、actin、RhoA及膜蛋白相互作用形成一個蛋白網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)獲能過程中精子質(zhì)膜重組和重新分布，從而影響精卵融合的復(fù)雜受精過程。受精過程也需要分子伴侶協(xié)同作用，分子伴侶HSPA2( molecular chaperone Heat Shock Protein A2，HSPA2)是透明帶受體復(fù)合體組裝中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，精子不能與缺乏HSPA2蛋白表達的卵子透明帶發(fā)生相互作用。BAG6(BCL2-associated athanogene 6，BAG6)定位于非獲能精子的赤道區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)BAG6與HSPA2共定位在人睪丸生殖細胞和附睪精子，蛋白質(zhì)相互作用分析顯示BAG6與HSPA2在成熟精子中保持穩(wěn)定的相互作用。研究還發(fā)現(xiàn)不育男性精子透明帶缺乏HSPA2以及BAG6表達。在人類生殖細胞，BAG6可能是HSPA2穩(wěn)定/功能的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，表明BAG6可能是進一步研究男性特發(fā)性不育癥的一個重要的候選蛋白[20]。

綜上所述，研究精子相互作用蛋白不僅對揭示精子的發(fā)生、運動及受精過程的分子機制有重要意義，而且可為男性不育癥的診斷、治療和男性避孕等研究奠定重要基礎(chǔ)。

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2016-12-28

2017-02-26)