深圳大學第一附屬醫(yī)院 深圳市第二人民醫(yī)院

賈秀琴 曹美群△ 楊 敏 李利民 倪新強(深圳 518035)

實 驗 研 究

內質網應激相關蛋白GADD153/CHOP在系膜增生性腎炎腎組織中的表達及中藥干預研究*

深圳大學第一附屬醫(yī)院 深圳市第二人民醫(yī)院

賈秀琴 曹美群△楊 敏 李利民 倪新強(深圳 518035)

目的：研究系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)大鼠腎臟組織內質網應激相關蛋白生長停滯及DNA損傷基因153(GADD153)/C-EBP 同源蛋白(CHOP)的表達、中藥保腎顆粒對GADD153/CHOP表達的干預效果，探討保腎顆粒治療系膜增生性腎小球腎炎的作用機制。方法：大鼠隨機分為中藥組、對照組、模型組、空白組，中藥組給予保腎顆粒、對照組給予雷公藤多甙片灌胃、空白組和模型組以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14周。于造模后給藥前1 d及實驗結束后，檢測各組大鼠血清肌酐(SCr)，TUNEL檢測大鼠腎臟細胞凋亡情況，實時熒光定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)及Western blot法檢測腎組織GADD153/CHOP的表達。結果：與模型組比較，對照組和中藥組SCr均顯著下降(P<0.05)?？瞻捉M腎組織細胞凋亡不明顯，模型組有大量的腎組織細胞凋亡，中藥組及對照組凋亡較輕。與模型組比較，中藥組及對照組GADD153/CHOP及GADD153/CHOPmRNA表達水平下降(P<0.05)。 結論：MsPGN大鼠腎組織GADD153/CHOP表達增高，提示內質網應激可能參與了腎臟損害；而保腎顆粒對MsPGN大鼠腎組織GADD153/CHOP過度表達有較好的抑制作用，且作用與雷公藤多甙片相當，是減輕腎臟損害的重要機制之一。

系膜增生性腎小球腎炎；GADD153/CHOP；內質網應激；中藥；保腎顆粒；雷公藤多甙片；正虛標實；腎虛；腎絡

系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)是臨床上最常見的腎小球病變，目前在我國是導致終末期腎臟病的主要原因之一，故越來越多針對MsPGN的研究，而MsPGN的發(fā)病機制目前尚不十分清楚，還沒有安全有效的治療藥物。本研究著眼于中醫(yī)學，觀察中藥保腎顆粒治療實驗性MsPGN的效果并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 2月齡清潔級SD雄性大鼠28只，體質量(200±10)g，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。實驗期間自由飲水進食，室溫20℃～24℃，相對濕度40%～50%，通風良好，空氣清新，符合實驗動物倫理學原則。

1.2 實驗用藥 中藥：由黃芪、黨參、生地黃、茯苓、山藥、澤瀉、白花蛇舌草、丹參、益母草等藥物組成，藥材一次性購自深圳北京同仁堂藥店，常規(guī)水煎，每毫升藥液中含原藥材1.962g,過濾后4℃保存?zhèn)溆?；雷公藤多甙片購至深圳市第二人民醫(yī)院，由遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司生產，國藥準字Z42021212，產品批號:20151202，每片10mg，使用時用蒸餾水配制成每毫升含生藥1.0mg混懸液。

1.3 試劑 磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術研究所產品，PVDF膜為Millipore產品，小鼠抗β-actin多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品，Trizol試劑盒(貨號252250AX)為Aidlab產品，HiScript逆轉錄酶 (貨號R101-01/02)為VAZVME產品，生長停滯及DNA損傷基因153(GADD153)/C-EBP同源蛋白(CHOP)抗體由武漢維諾賽生物技術有限公司提供。TUNEL試劑盒Roche公司產品。

1.4 主要實驗儀器 日立全自動生化分析儀，美國Labnet微型高速離心機，日本ASONE電熱恒溫培養(yǎng)箱，Thermoscientific全自動酶標儀，德國LeicaRM2016輪轉式切片機，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡，杭州奧盛儀器有限公司微量分光光度計，北京君意東方電泳設備有限公司紫外分析儀及水平電泳儀，Illuminaeco實時熒光定量PCR儀(型號7900 /Viia7)，東勝創(chuàng)新PCR儀。

1.5 方法

1.5.1 抗大鼠胸腺細胞抗血清(ATS)的制備：取4～6周齡大鼠胸腺細胞，純化為單胸腺細胞，調整細胞水平至5×107/L，成為單胸腺細胞懸液，與完全福氏佐劑做1︰2 體積混合，按每只5×107/L個細胞量將胸腺細胞多點皮下注射免疫新西蘭兔，后每隔2周按每只家兔1×107/L細胞經耳靜脈直接注射加強免疫，共加強免疫3次，末次免疫1周后，間接免疫熒光測ATS的效價結果為1︰2 000時，表明ATS制備成功。第7周采血，4℃過夜析出血清?？寡褰洿笫笮迈r紅細胞及肝細胞吸附，分裝后于-20℃保存，使用時56℃水浴30min滅活補體。

1.5.2 造模方法 大鼠尾靜脈注射AST抗血清(1mL/100g)，1周1次，共注射4次。于注射結束后1d查尿蛋白，如尿蛋白(+++)判定為模型成功。未達此標準者則剔除。

1.5.3 實驗分組：動物購回后適應性喂養(yǎng)1周，并檢測尿蛋白定性(-)后，隨機分組造模進行實驗。隨機選取7只為正常組(空白組)，其余采用上述方法建立MsPGN模型，整個實驗過程中沒有大鼠死亡及未達成模標準。造模成功的大鼠隨機分為模型組、中藥組、對照組，每組樣本量7只。

1.5.4 治療方法:動物藥物劑量以成人劑量按照等效劑量換算。中藥組給予濃煎中藥保腎顆粒2mL/次，每天1次灌胃；對照組給予雷公藤多甙片每次1mL/100g灌胃，每日1次；空白、模型組等量生理鹽水灌胃。所有治療由同一技術員進行操作，連續(xù)灌胃14周。

1.5.5 血清肌酐檢測:給藥前1d、給藥14周后乙醚麻醉，股動脈取血1.5mL，分離血清，檢測大鼠血清肌酐(日立全自動生化分析儀)。

1.5.6 制備組織芯片: 治療14周末麻醉后處死大鼠，取新鮮腎組織標本，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。用組織芯片制作儀，從蠟塊上穿取直徑 1.5mm的組織蠟塊柱，插入7列×8 行點陣的受體蠟塊中，融蠟、冷卻，制備組織芯片，厚 4μm連續(xù)切片備用。腎組織液氮速凍后存放于-70℃冰箱以提取總RNA和蛋白用。

1.5.7 原位末端標記技術(TUNEL)對原位細胞凋亡進行檢測：按試劑盒說明書操作，切片常規(guī)脫蠟，蛋白酶K37℃消化，TDT酶反應液37℃孵育0.5h，0.3%H2O2 25℃封閉，Streptavidin-HRP室溫反應5min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、干燥。以無酶標記液代替TDT酶反應液作空白對照。400倍光學顯微鏡下觀察計數同時拍照，以細胞核呈棕褐色者為陽性細胞。

1.5.8 實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測GADD153/CHOP蛋白的表達：按照Trizol試劑說明書進行，提取大鼠腎組織總RNA，用微量分光光度計測定樣本的濃度和純度反轉錄體系，逆轉錄成cDNA后，進行PCR反應。引物序列設計如下：CHOP：F-5‘-CCCCAGGAAACGAAGAGGAA-3’，R-5‘-CGCACTGACCACTCTGTTTC-3’,產物長度210bp;β-actin:F-5‘-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’,R-5‘-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，產物長度240bp。反應條件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 30s，60℃ 30s，40個循環(huán)。根據擴增曲線數據，記錄各樣本Ct值，以β-actin作為內參，最終數據以2-△△Ct公式進行計算。

1.5.9Westernblot法檢測GADD153/CHOP蛋白的表達:取等量腎皮質組織剪碎放入冰冷的研磨器，加入冰冷的蛋白裂解 400μL提取蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，-70℃保存，每個樣品取40μg總蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2h，加入一抗 ( 稀釋比例 1∶2 000 ) ，4℃孵育過夜。TBST洗膜，5min×6，加入二抗(1︰5 000)，TBST洗膜，5min×6，ECL化學發(fā)光法顯色。晾干并掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值，以β-actin條帶和目的條帶積分光密度值(IOD)比值作為最后結果。

2 結果

2.1 各組治療前、后血清肌酐檢測結果 治療前，模型組、中藥組、對照組與空白組比較，血清肌酐明顯升高，P<0.05；治療14周后，中藥組、對照組與模型組比較，血清肌酐明顯降低，P<0.05。結果見表1。

表 1各組大鼠治療前后血清肌酐比較

組別例數治療前治療后空白組729.714±3.50228.567±11.174模型組785.786±6.394#81.043±6.111 對照組788.529±5.202#45.557±5.841*中藥組787.386±6.177#38.386±6.700*

注：與空白組比較，#P<0.05； 與模型組比較，*P<0.05

2.2 鼠腎組織細胞凋亡情況 空白組腎組織細胞凋亡不明顯，模型組有大量的腎組織細胞凋亡，中藥組及對照組凋亡較輕。見圖1。

圖1 TUNEL法檢測各組大鼠腎組織細胞凋亡情況 (DAB顯色×400 A空白組 B模型組 C中藥組 D對照組)

2.3 各組大鼠腎組織GADD153/CHOP蛋白表達及GADD153/CHOPmRNA的表達 模型組與空白組相比，腎臟GADD153/CHOP蛋白及GADD153/CHOPmRNA表達明顯增多，差異有顯著性(P<0.05)；中藥組及對照組與模型組比較，GADD153/CHOP及GADD153/CHOPmRNA表達明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠腎組織GADD153/CHOP的表達(A空白組 B模型組 C中藥組 D對照組)

表 2各組大鼠腎組織GADD153/CHOP及GADD153/CHOPmRNA的表達

組別例數GADD153/CHOP GADD153/ CHOPmRNA空白組71.087±0.161 0.407±0.089 模型組72.143±0.215#0.994±0.132#對照組71.637±0.191*0.784±0.134*中藥組71.369±0.149*0.651±0.148*

注：與空白組比較，#P<0.05； 與模型組比較，*P<0.05

3 討論

據統(tǒng)計慢性腎臟病在我國的患病率高達10.8%，治療花費非常大,[1]還容易產生諸多并發(fā)癥，致殘率高，現(xiàn)代醫(yī)學又缺乏理想的治療方法。慢性腎炎作為一種由免疫介導的炎癥性疾病，起病隱蔽、病程遷延、呈緩慢不可逆性進展，是導致慢性腎臟病最常見的原因之一，其病因未明，目前普遍認為是涉及多因素的結果。

一些病理生理反應如低氧、營養(yǎng)缺乏、氧化還原反應平衡被打破、鈣離子內環(huán)境改變、翻譯后修飾失敗和蛋白合成過多等可以導致大量錯誤或未折疊蛋白在內質網堆積及Ca2+平衡狀態(tài)的紊亂，激活共同的應激反應，此現(xiàn)象稱為內質網應激(ERS)。研究證實，ERS是一種信號反應通路系統(tǒng)，屬細胞自我保護機制的一部分。[2]

慢性腎炎狀態(tài)下可能的刺激因素大大增加，包括氧化應激，蛋白尿以及細胞內外電解質紊亂等。有研究顯示，ERS是促進腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素，內質網應激預處理能保護腎臟細胞對抗氧化損傷。[3-5]為了緩解ERS而激活的保護機制有：(1)減少內質網蛋白質的合成，減輕錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白的進一步聚集；(2)誘導內質網多種分子伴侶的表達，從而增強內質網蛋白質折疊的功能；(3)誘導內質網相關降解基因的表達，增強錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白的降解；(4)誘導功能受損細胞凋亡。[6-7]

GADD153/CHOP，是內質網應激凋亡途徑中比較有特異性的途徑。屬C/EBP轉錄因子家族成員，是分布于內質網的重要促凋亡轉錄因子，GADD153/CHOP是肌體促進細胞內蛋白質成熟、維持細胞功能的關鍵性調節(jié)物質，[8]與肌體各種細胞功能活動，如能量代謝、分化、增殖、凋亡有關。正常情況下，GADD153/CHOP主要位于細胞質中，表達量較低；而當胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、錯誤折疊蛋白增多，細胞處于應激狀態(tài)時，GADD153/CHOP可被活化而轉位至胞核內，呈現(xiàn)高表達。[9]GADD153/CHOP作為內質網應激標志性蛋白，目前普遍認為，激活和轉錄GADD153/CHOP基因是內質網應激通路介導細胞凋亡的通路之一。抑制GADD153/CHOP的表達能顯著增強應激細胞的存活能力。

慢性腎炎作為中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢病種，加強對慢性腎炎的研究具有重要的臨床意義。中醫(yī)學認為，慢性腎炎病程長，病情復雜。病機特點為本虛標實，虛實夾雜。本虛常以腎虛為主，涉及肺、脾、膀胱等臟腑；主要表現(xiàn)為腎藏精、主水、主骨生髓、主一身之氣化功能失常及肺失通調、脾失健運、膀胱氣化失常等。標實主要表現(xiàn)為風寒濕熱等外感病邪，水濕、濕熱、瘀血、濁毒郁滯等，痰瘀毒互結是慢性腎小球腎炎的主要病理因素,[10]正虛標實相互影響，互為因果，共同致病，循環(huán)往復，不斷進展，導致本病長期復發(fā)，纏綿難愈。

絡脈作為中醫(yī)理論重要的組成部分，是全身氣血運行灌注的通道，也是感應傳導信息和調節(jié)生理功能的通路，其具有支橫別出、逐層細分、網狀分布的空間結構特點，及氣血流緩、面性彌散、雙向流動、末端連通、功能調節(jié)的氣血運行特點。[11]慢性腎炎的現(xiàn)代病理基礎是腎小球毛細血管逐漸破壞，系膜基質和纖維組織增生，導致整個腎小球纖維化、玻璃樣變。同時，由于腎小球血流受阻，相應腎小球萎縮，間質炎癥細胞浸潤，纖維組織增生，導致腎組織嚴重破壞，形成終末期固縮腎，此病理發(fā)展過程符合中醫(yī)以腎為主的肺、脾、腎三臟虛損及氣血功能失調，“久病及腎” “久病多瘀” “久病入絡”，腎絡空虛瘀血濁毒阻滯之慢性腎炎病機。[12]腎絡功能發(fā)揮和功能受損的現(xiàn)代生物學基礎是什么? 是亟待研究的關鍵命題，也是揭示腎絡功能科學內涵的關鍵環(huán)節(jié)。由于絡脈是溝通表里內外的橋梁，又是氣血運行匯聚之處，在病理上成為外邪入侵的道路和傳變途徑。故經絡網狀結構、生理功能與現(xiàn)代醫(yī)學的內質網系統(tǒng)極其相似。將絡脈與現(xiàn)代醫(yī)學生物學中的內質網相聯(lián)系，成為運用絡病理論研究腎臟病變的切入點，作為腎絡空虛瘀濁阻滯病機假說的科學依據，從更微觀的角度給予更好的闡述。

本研究選用中醫(yī)補益肝腎的代表方——始出于錢乙《小兒藥證直訣》的六味地黃丸基礎上加味而成的保腎顆粒(系筆者多年臨床實踐中總結的治療慢性腎炎的有效方劑)，由生地黃、山藥、茯苓、山茱萸、澤瀉、黨參、黃芪、丹參、白花蛇舌草、黃柏、益母草等組成。“大凡絡虛，通補最宜”，方中黨參配伍黃芪健脾益氣、培元固本，使中州健運、氣血沖和，升降之樞得復，氣機通暢；“腎者主蟄，封藏之本，精之處也” “精化氣” “精氣奪則虛”， 黃芪配山藥補腎固澀，可減少水谷精微外泄，進一步恢復損傷的正氣；生地黃滋補肝腎，肝疏泄正常則所藏之血與腎所藏之精互生，同時有利于藥物的正常代謝、濕熱的清除；山茱萸配山藥平補腎氣。本病病程較長，瘀血與體虛并存，稍有不慎則添傷正之憂，故活血化瘀應遵循和緩行瘀，通中有養(yǎng)的原則，忌峻猛破瘀；丹參既能活血又兼補益，是祛瘀而不傷正的首選，益母草活血化瘀、利水消腫，活血藥聯(lián)合參芪地黃湯可益氣化瘀、養(yǎng)血活血化瘀，補腎活血、利水以消瘀。使用甘淡平和之茯苓淡滲清利而不傷陰，避免了過分苦寒峻猛傷及脾胃，而不利于水濕之邪的消散；同時茯苓助山藥之健運；茯苓與澤瀉共泄腎濁，助真陰得復其位。 牡丹皮清泄虛熱，兼制山茱萸之溫澀。白花蛇舌草、黃柏、土茯苓清熱利濕，解毒瀉濁。筆者以往的研究表明保腎顆粒可以改善MsPGN模型兔T淋巴細胞免疫功能，提高RBC黏附免疫復合物水平，[13]調節(jié)脂代謝、增加腎組織及血清NO水平，[14]調節(jié)紊亂了的血漿內皮素、降鈣素基因相關肽水平；[15]此方含藥血清能拮抗經LPS誘導活化的人腎系膜細胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6，即該藥可能通過抑制IL-1β、IL-6而減少基質的合成，[16]從而保護腎功能。

本實驗研究結果顯示，中藥組、對照組與模型組比較，Scr降低，說明大鼠腎功能有所恢復，且中藥組與對照組作用相當。采用TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)空白組腎組織細胞凋亡不明顯，模型組有大量的腎組織細胞凋亡，中藥組及對照組凋亡較輕。應用Q-PCR和Westernblot技術檢測分析GADD153/CHOP在慢性腎炎腎組織中的表達,結果顯示，模型組、中藥組及對照組腎組織中GADD153/CHOP及GADD153/CHOPmRNA的表達明顯高于空白組，說明模型組、中藥組及對照組大鼠腎組織中均發(fā)生了ERS。這可能與慢性腎炎腎纖維化后的血供減少，局部組織缺氧等，進而激活GADD153/CHOP基因的啟動因子，引起GADD153/CHOP的過度表達。持續(xù)長時間的ERS必將啟動凋亡程序，引發(fā)腎臟細胞凋亡，使病情惡化。中藥組、對照組與模型組比較GADD153/CHOP及GADD153/CHOPmRNA水平均下調，說明保腎顆粒及雷公藤多甙片具有減輕ERS的作用，而中藥組的效果與對照組相當。

正如筆者推測的慢性腎炎“虛損腎絡—內質網應激”具有一定的相關性，[17]腎絡空虛瘀濁阻滯的物質基礎之一是內質網相關蛋白GADD153/CHOP的高表達；保腎顆粒能降低大鼠血清肌酐，減輕腎臟病理損害，其機制可能與下調MsPGN大鼠腎組織GADD153/CHOP表達有關。作為雙刃劍的ERS，筆者已經發(fā)現(xiàn)慢性腎炎虛損腎絡時發(fā)生了ERS，在MsPGN中發(fā)揮其他作用與否仍需要進一步探索，保腎顆粒在減輕ERS的同時是否還可以通過其他作用途徑保護腎組織，延緩腎功能進一步惡化，還需要不斷證實。

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(2017-01-10 收稿)

Expression of Endoplasmic Reticulum Stress Associated Protein GADD153/CHOP in Nephridial Tissue with Mesangial Proliferative Nephritis and Intervention with Chinese Medicine First Affiliated Hospital of Shenzhen University No. 2 People's Hospital of Shenzhen

JIAXiu-qinCAOMei-qunYANGMinLILi-minNIXin-qiang

(Shenzhen 518035)

Objective: to study the expression of GADD153/CHOP (growth arrest and DNA damage inducible gene 153/E-EBP homologous Protein) in MsPGN (mesangial proliferative glomerulonephritis), and the intervention of Chinese medicineBaoshenKeli(Kidney-preservationGranules),andtoexplorethefunctionalmechanismintreatingMsPGN.Methods:theratswererandomlydividedintoChinesemedicinegroupwithBaoshenKeli,controlgroupwithGlucosidorumTripterygllTotorum,modelgroupandblankgroupwithintragastricadministrationofthesamevolumeofphysiologicalsaline,for14weekssuccessively.Onedaybeforetheadministrationandaftertheexperiment,detectSCrofeachgroup,detectthroughTUNELthenephridialapoptosisandFQ-PCR(fluorescentquantitationpolymerasechainreaction),anddetecttheGADD153/CHOPexpressionsthroughWesternblot.Results:comparedwithmodelgroup,SCrincontrolgroupandChinesemedicinegroupweredecreasedsignificantly(P<0.05).Noobviousapoptosisshowedinblankgroupwhileitwasgreatinmodelgroup,andtheapoptosisinChinesemedicinegroupandcontrolgroupwereless.Comparedwithmodelgroup,GADD153/CHOPandGADD153/CHOPmRNAexpressionsdecreased(P<0.05).Conclusion:TheincreaseofGADD153/CHOPexpressionofMsPGNratsindicatesthattheendoplasmicreticulumstressmaybeinvolvedinkidneydamage;BaoshenKelihasagooddepressanteffectonGADD153/CHOPexpressions,equivalenttoGlucosidorumTripterygllTotorum,whichmaybeoneofthemechanismsinlesseningthekidneydamages.

MsPGN; GADD153/CHOP; endoplasmic reticulum stress; Chinese medicine;BaoshenKeli;GlucosidorumTripterygllTotorum;Deficiencyandexcessinsuperficiality;kidneydeficiency;kidneycollaterals

*深圳市科技創(chuàng)新委基礎研究項目：No.JCYJ20140414170821241

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A

1007-5615(2017)01-0001-05

△ 深圳市老年醫(yī)學研究所(深圳 518035)