王 君，徐 力

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 南京 210023)

肺癌作為全球癌癥的第一大殺手，嚴(yán)重影響患者的健康及生存質(zhì)量，肺癌同樣居我國癌癥發(fā)病率首位，其中肺腺癌占非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的50%左右。肺腺癌作為非小細(xì)胞肺癌中的重要亞型,其分子分型對(duì)指導(dǎo)預(yù)后判斷及個(gè)體化治療具有重要意義，其中較為常見的為表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒基因(Kirsten rat sarcoma,KRAS)、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4(echinoderm microtubule associated protein like4, EML4) 與間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK) 融合基因 EML4-ALK。雖有大量研究文獻(xiàn)對(duì)肺腺癌的中醫(yī)證型進(jìn)行報(bào)道，但肺腺癌的基因變異類型與中醫(yī)證型之間關(guān)聯(lián)性的研究甚少。本文就二者的相關(guān)性進(jìn)行探討，為從分子機(jī)制角度更深層次地認(rèn)識(shí)肺腺癌的中醫(yī)證型本質(zhì)提供參考。

1 臨床資料

1.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的原發(fā)性肺腺癌；已行上述基因檢測(cè)的肺腺癌患者；已確診有上述基因變異之一的肺腺癌患者；年齡大于18歲；未經(jīng)任何治療的原始初診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：非上述3種單基因突變患者；合并其他腫瘤的患者；嚴(yán)重心肝腎疾病和功能障礙患者。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 患者臨床病理類型及分期采用《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015版)》[1]與《NCCN肺癌篩查指南(2016V2)》標(biāo)準(zhǔn)；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及DNA直接測(cè)序法檢測(cè)EGFR外顯子18-21突變類型、KRAS 外顯子2、3突變類型，熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測(cè)EML4-ALK融合基因。

1.3.2 中醫(yī)證型辨證標(biāo)準(zhǔn) 本研究參考《中藥新藥治療原發(fā)性支氣管肺癌臨床指導(dǎo)原則》(試行)[2]，以及收集患者癥狀表現(xiàn)，經(jīng)組內(nèi)探討分析后，決定把肺腺癌患者中醫(yī)證型分為5型，氣虛痰濕證：胸悶氣短，咳嗽，咳白色黏稠痰，納呆便溏，苔白膩，脈弦滑;陰虛內(nèi)熱證：咳嗽少痰，心煩口干，胸痛氣急，潮熱盜汗，舌紅少津，脈細(xì)數(shù)；氣陰兩虛證：咳嗽少痰，痰稀而黏，咳聲低微，氣短喘促，神疲乏力，心煩盜汗，口干少飲，舌紅苔薄白或薄黃，脈細(xì)弱；氣滯血瘀證：咳嗽咯痰不爽,咳嗽帶血,胸悶胸痛如刺,痛有定處,大便秘結(jié),唇甲紫暗,舌質(zhì)暗或瘀斑；熱毒熾盛證：咳嗽、咳黃色黏稠痰，胸痛，口干鼻燥，口渴欲飲，發(fā)熱，脈數(shù)，苔黃。

1.4 資料來源

收集2016年5月至2016年11月在南京止馬營(yíng)等8個(gè)社區(qū)240例肺癌患者病例資料，所有患者的石蠟包埋組織標(biāo)本切片均經(jīng)蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色法)，并經(jīng)江蘇省中醫(yī)院病理科診斷確診為肺腺癌，其中符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者為102例，女性52例，男性50例，平均年齡(58±8.3)歲，年齡范圍為37～78歲。根據(jù)TNM分期Ⅰ期患者23例,Ⅱ期28例,Ⅲ期27例,Ⅳ期24例。

2 研究方法

2.1 基因檢測(cè)方法

2.1.1 試劑及設(shè)備 DNA提取試劑盒DEXPAT、Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司，基因擴(kuò)增PCR儀為美國ABI 9700，DNA測(cè)序儀為美國ABI 3730xl，ALK雙色分離探針試劑盒購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，熒光顯微鏡為日本Olympus BX51產(chǎn)品。

2.1.2 DNA提取及定量 用二甲苯脫蠟及無水乙醇脫水處理患者石蠟包埋組織切片，采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，所有步驟按照試劑說明書操作，將3～5片10 μm的切片置于Eppendorf管中，加10滴DNA抽提液充分混勻，100 ℃下加熱10 min，13000 r/pm離心10 min，DNA提取后使用紫外分光度計(jì)檢測(cè)濃度，然后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA質(zhì)量。

2.1.3 EGFR、KRAS突變檢測(cè) 表1顯示，使用PCR及DNA測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因18～21號(hào)外顯子突變以及KRAS 2、3號(hào)外顯子突變。引物設(shè)計(jì)及合成：EGFR 18-21外顯子與KRAS 外顯子2、3外顯子引物序列均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃，5 min(95 ℃，30 s，60 ℃，45 s， 72 ℃，60 s)×40 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；PCR 反應(yīng)體系：10×buffer，dNTP mix，MgCl2，正向引物25pmol，反向引物25 pmol，Platinum Taq 酶和 DNA 模版50ng。所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳后送至南京世和基因生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用CIROMAS軟件分析結(jié)果，并與基因庫中正常EGFR基因序列和正常KRAS序列進(jìn)行比較。

2.1.4 EML4-ALK融合基因檢測(cè) 使用ALK雙色分離探針試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，探針區(qū)域在2p21～2p23。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體步驟：4～5μm石蠟切片56℃烤片3 min，常規(guī)脫蠟，滴加胃蛋白酶預(yù)處理液消化15 min； 2×SSC漂洗5 min固定，每個(gè)切片滴加ALK探針10 μL，覆蓋雜交蓋片78 ℃變性8 min，保持42℃雜交過夜，雜交后先浸入0.4×SSC/0.3%NP-40洗滌液洗滌1.5 min， 后浸入2×SSC/0.1%NP-40洗滌液洗滌0.5 min，再使用70%乙醇洗滌5 min，干燥后加入適量DAPI復(fù)染劑至雜交區(qū)域，用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果判讀：ALK陽性標(biāo)準(zhǔn)：任何著色細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有強(qiáng)染色顆粒即可判定為陽性。ALK重排為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅色和綠色信號(hào)分離，間距≥2個(gè)信號(hào)直徑或單一紅色信號(hào)。ALK無重排為腫瘤細(xì)胞內(nèi)紅色和綠色信號(hào)黏合或出現(xiàn)黃色信號(hào)。FISH 陽性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn): ALK陽性是計(jì)數(shù)為50個(gè)觀察細(xì)胞中存在>25陽性細(xì)胞，即可直接判定為ALK陽性，若存在5～25個(gè)陽性細(xì)胞需再計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，100個(gè)觀察細(xì)胞總存在≥15個(gè)陽性細(xì)胞，可判定為ALK陽性。

表1 EGFR與KRAS基因擴(kuò)增引物

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，中醫(yī)證型、基因突變類型采用構(gòu)成比，病期與中醫(yī)證型相關(guān)性、基因變異與中醫(yī)證型相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基因檢測(cè)結(jié)果

3.1.1 EGFR、KRAS的PCR法檢測(cè)結(jié)果 圖1、2顯示，在送檢的102例肺腺癌石蠟包埋切片中，EGFR突變共73例，共發(fā)生在外顯子19(38例)、20(23例)、21(12例)，18無外顯子突變。外顯子19突變共包括del-E746-A750缺失突變(32例)和del-L747-P753insS突變(6例)。外顯子20突變是T790 M突變，外顯子21是 L858R突變，KRAS 突變有12例,其中均是2外顯子G12C突變。

3.1.2 EML4-ALK融合基因FISH檢測(cè)結(jié)果 圖3顯示，在送檢的102例肺腺癌石蠟包埋切片中，ALK雙色分離探針試劑共檢出14 例強(qiáng)陽性，3例可疑陽性，85例陰性。

圖1 EGFR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶注：Lane1：外顯子18(394 bp)；Lane2：外顯子19(394 bp)；Lane3：外顯子20(283 bp)；Lane4：外顯子21(297 bp)； M:maker

圖2 KRAS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶注：Lane1：外顯子2(353 bp)；Lane2：外顯子3(294 bp)；M:maker

圖3 雙色分離 FISH 探針檢測(cè) EML4-ALK 融合基因注：ALK陽性肺腺癌患者FISH檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)紅綠信號(hào)分離或者額外的紅色信號(hào)(箭頭示)，提示存在EML4-ALK 融合基因

3.2 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2.1 102例肺腺癌中醫(yī)證型構(gòu)成 表1顯示，肺腺癌下各中醫(yī)證型之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.294,P=0.001<0.01)，其中肺腺癌以氣陰兩虛表現(xiàn)為主。

表1 102例肺腺癌中醫(yī)證型構(gòu)成比較[例(%)]

3.2.2 102例肺腺癌基因突變類型構(gòu)成 表2顯示，肺腺癌下各基因突變類型之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=88.065，P=0.000<0.01)，其中以EGFR突變型為主。

3.2.3 102例肺腺癌中醫(yī)證型與基因變異之間相關(guān)性比較 表3顯示，各組3種基因突變之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,EGFR基因突變下肺腺癌中醫(yī)證型之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.863，P=0.000<0.05)，其中以氣陰兩虛證表達(dá)為主；EML4-ALK突變下與KRAS突變下證型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.471，P=0.346>0.05，χ2=6.333，P=0.176>0.05)；3種基因突變下的證型之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.666，P=0.008<0.05)；兩兩比較，EGFR與EML4-ALK變異下證型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.546，P=0.021<0.05)，EGFR與KRAS基因突變組間中醫(yī)證型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.869，P=0.018<0.05)，EML4-ALK與KRAS基因突變組間中醫(yī)證型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.212，P=0.876>0.05)。

表2 102例肺腺癌基因突變類型構(gòu)成比較[例(%)]

表3 102例肺腺癌中醫(yī)證型與基因變異之間相關(guān)性比較(%)

3.2.4 102例肺腺癌中醫(yī)證型與臨床分期相關(guān)性比較 表4顯示，經(jīng)卡方檢驗(yàn)后各分期之間中醫(yī)證型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=61.101，P=0.000<0.05)，其中氣陰兩虛證以Ⅲ期、Ⅳ期為主。

表4 102例肺腺癌中醫(yī)證型與臨床分期之間相關(guān)性比較[例(%)]

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為肺癌發(fā)病機(jī)制以正虛為本，首先是正氣不足，無力抵御毒邪導(dǎo)致毒瘤內(nèi)生[3]；其次臟腑受損，氣血津液運(yùn)行不暢，外邪侵襲，癌毒內(nèi)生，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究Ⅰ、Ⅱ期患者以氣滯血瘀證和氣虛痰濕證為主，Ⅲ、Ⅳ期患者以氣陰兩虛證為主，肺癌患者早期邪實(shí)正不虛、正邪相爭(zhēng)表現(xiàn)為實(shí)證。又因本研究入組患者多居南方，天氣潮濕，濕邪困脾，久生痰濕，氣虛導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢久致血瘀，故常表現(xiàn)為氣滯血瘀證和氣虛痰濕證，疾病由淺及深，機(jī)體無力抵抗外邪，病證由實(shí)至虛，中晚期多表現(xiàn)為虛證?！吨苁厢t(yī)學(xué)叢書·臟腑標(biāo)本藥式》[4]指出：“肺藏魄，屬金，總攝一身之氣?！狈沃鳉?，肺臟受損呼吸功能定會(huì)受到損失，不僅影響宗氣的生成，也影響一身之氣的盛衰，易導(dǎo)致氣虛，故肺癌患者常常表現(xiàn)為氣短、乏力等癥狀。肺為嬌臟，喜潤(rùn)惡燥，邪熱耗津常表現(xiàn)為肺陰不足。肺癌發(fā)病以正虛為本，其中常見氣陰兩虛，中晚期患者因病情發(fā)展，或因化放療等各種治療手段導(dǎo)致惡心嘔吐等消化道反應(yīng)，更易耗氣傷陰。本研究可知，肺腺癌中EGFR突變型較為常見，EGFR基因突變下肺腺癌中醫(yī)證型之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以氣陰兩虛證表達(dá)為主，中晚期肺腺癌患者也常表現(xiàn)為氣陰兩虛證的虛證。

EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGVF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)受體，能與表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)及 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)有效結(jié)合，從而激活受體酪氨酸激酶,使受體本身及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化, 從而引起細(xì)胞的異常分裂增殖[5]。在EGFR基因調(diào)節(jié)作用失控情況下[6]，通過相應(yīng)的信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、周圍血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。中晚期以虛證為主兼并實(shí)證，氣虛使血行不暢，陰虛使邪熱內(nèi)生、津液損耗，機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變。如血液高黏狀態(tài)、免疫調(diào)節(jié)功能受損，促進(jìn)腫瘤亢進(jìn)的生長(zhǎng)因子，破壞因子間的平衡，促使腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成分的黏附、腫瘤血管的生長(zhǎng)以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路，更加增強(qiáng)了EGFR基因及相關(guān)基因的高表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖，故肺腺癌EGFR基因突變型治療應(yīng)重視補(bǔ)肺養(yǎng)陰和益氣健脾。

既往研究可知，益氣養(yǎng)陰法可以抑制腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。胡小勤[7]認(rèn)為益氣養(yǎng)陰方生脈散能夠降低人工基底膜種植體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)，起到抗肺癌腫瘤細(xì)胞血管生成的作用。李春杰[8]發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰組方(黃芪、白術(shù)、天冬、茯苓、白花蛇舌草等) 能夠明顯降低C57BL/6小鼠 Lewis 肺癌中金屬角蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物(TIMP-1)水平，抑制肺癌的轉(zhuǎn)移。肺積方[9]能促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌，抑制 EGFR表達(dá)，從而抑制Lewis肺癌腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。鄒銀水[10]認(rèn)為，益氣養(yǎng)陰方可以顯著改善氣陰兩虛證患者的生存質(zhì)量及免疫功能。然而本研究由于納入樣本量偏小，此結(jié)論仍需大樣本、多中心研究證實(shí)。

綜上所述，肺腺癌的EGFR突變型患者以氣陰兩虛為主，且益氣養(yǎng)陰法可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，提示基因突變檢測(cè)結(jié)果有望成為未來中醫(yī)藥辨證治療肺癌的參考指標(biāo)之一，對(duì)闡明中醫(yī)藥辨證肺癌的機(jī)制具有重要的科學(xué)價(jià)值。

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