趙建華

(江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,江蘇省臨床檢驗(yàn)中心，南京 210009)

·述評(píng)·

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的挑戰(zhàn)*

趙建華

(江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所/南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,江蘇省臨床檢驗(yàn)中心，南京 210009)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的臨床應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，尤其作為“液體活檢”的主要資源用于腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療備受關(guān)注。然而，CTCs在患者血液中的含量極為稀少，靈敏度一直是CTCs檢測(cè)及應(yīng)用的主要瓶頸。目前，CTCs分離、富集、體外原代培養(yǎng)技術(shù)，獲得細(xì)胞的生物學(xué)特性研究及其臨床應(yīng)用價(jià)值都還在不斷探索和發(fā)展中，對(duì)它們的深層次和全方位的分析將有助于指導(dǎo)并推動(dòng)CTCs的臨床應(yīng)用。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；精準(zhǔn)醫(yī)療；生物學(xué)特征

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因。由于大部分遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移都是通過血液循環(huán)完成的，因此血液中存在的腫瘤細(xì)胞，即循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)，被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[1]。然而，CTCs在患者血液中的含量非常稀少，一般每106個(gè)白細(xì)胞中僅夾雜1個(gè)至幾個(gè)CTCs，靈敏度一直是CTCs檢測(cè)及其應(yīng)用的主要障礙。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)一項(xiàng)CTCs分離與檢測(cè)技術(shù)能全面滿足臨床需求，CTCs分離、富集、體外原代培養(yǎng)、分子表觀遺傳特征的研究及其臨床應(yīng)用價(jià)值都還在不斷探索和發(fā)展中，對(duì)它們的深層次和全方位的分析將有助于指導(dǎo)并推動(dòng)CTCs的臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用。

1 CTCs分離技術(shù)仍在不斷完善

目前臨床上主要是通過CTCs的計(jì)數(shù)來預(yù)測(cè)腫瘤患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存?，F(xiàn)階段普遍使用的CTCs分離技術(shù)大致分為兩類：基于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)表達(dá)的生物分離技術(shù)和基于腫瘤細(xì)胞物理學(xué)特點(diǎn)的物理分離技術(shù)。第一類技術(shù)中，以CellSearch平臺(tái)為代表的陽性磁分離法使用最早且較廣泛。其原理為上皮來源的腫瘤細(xì)胞表面廣泛表達(dá)上皮細(xì)胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，該類技術(shù)能基于EpCAM免疫磁性捕獲上皮性CTCs；但CTCs中存在著發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)而丟失EpCAM的亞群，這類CTCs已被證明在乳腺癌發(fā)病過程中具有更高的轉(zhuǎn)移效率和預(yù)后警示作用[2]。為了克服該缺陷，陰性磁分離法應(yīng)運(yùn)而生，它不依賴于CTCs的表型，可通過去除血液中白細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)所有類型CTCs的檢測(cè)。但該技術(shù)的CTCs回收純度低且會(huì)出現(xiàn)假信號(hào)。第二類CTCs分離技術(shù)主要基于腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞在大小和/或形變能力上的差異，采用過濾或離心法富集CTCs。然而，尚無證據(jù)表明CTCs一定就是直徑較大的或剛性強(qiáng)的細(xì)胞，磁性分離法獲得的CTCs大小各異也證明了這一點(diǎn)，因此，該類方法雖簡(jiǎn)便易行但可信度和臨床應(yīng)用價(jià)值還有待驗(yàn)證。無論采用何種技術(shù)，CTCs的計(jì)數(shù)在判斷各類癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和早期診斷上還需建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，并且發(fā)展新的CTCs分離技術(shù)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)比較，以提高其敏感性、特異性和有效性。

2 腫瘤精準(zhǔn)治療給CTCs的分離技術(shù)提出了更高的要求

精準(zhǔn)治療的焦點(diǎn)是根據(jù)腫瘤細(xì)胞所呈現(xiàn)的分子特點(diǎn)(如基因突變和特定基因或蛋白質(zhì)表達(dá)等)選擇相應(yīng)的分子靶向治療藥物以獲得最佳療效。但腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，治療前需要對(duì)患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行異質(zhì)性鑒定。然而，組織樣本獲取困難、瘤內(nèi)癌細(xì)胞高度異質(zhì)性及無法跟蹤檢測(cè)限制了其臨床應(yīng)用?！耙后w活檢”成為理想的選擇，且與其他液體活檢材料(例如ctDNA和外泌體等)相比，CTCs具有更為突出的優(yōu)勢(shì)[3]。正如哈佛醫(yī)學(xué)院Toner教授在《Science》雜志中指出：“完整的細(xì)胞具有巨大的價(jià)值；可以研究DNA、RNA、信號(hào)分子、磷酸化模式、表觀遺傳學(xué)，還可以通過培養(yǎng)這些細(xì)胞，測(cè)試藥物敏感性，真正走向個(gè)性化醫(yī)學(xué)”。目前主要有2個(gè)技術(shù)障礙使得CTCs的應(yīng)用還難以真正在臨床上展開：一是使用當(dāng)前技術(shù)純化CTCs后，樣品中依然含有大量白細(xì)胞，CTCs的含量?jī)H在0.1%～1%之間，難以通過測(cè)序技術(shù)(因基因測(cè)序要求樣品中腫瘤細(xì)胞比例不低于10%～20%)準(zhǔn)確鑒定其中的相關(guān)基因突變靶點(diǎn)；二是分離具有完整活性的CTCs還存在技術(shù)瓶頸。目前的CTCs分離技術(shù)包括多步的化學(xué)和物理操作過程，導(dǎo)致純化后的CTCs無法繼續(xù)培養(yǎng)而獲得足夠的數(shù)量用于高通量基因突變檢測(cè)和藥物篩查。盡管微流控芯片分離技術(shù)(CTC Chip)可獲得CTCs的含量高達(dá)50%[4]，但其過程對(duì)CTCs的活性及生物學(xué)功能有影響；隨后報(bào)道的CTC iChip技術(shù)盡管解決了CTCs活性不足的問題[5]，但CTCs純化后的含量依然很低，難以直接用于靶基因突變檢測(cè)。盡管如此，從CTCs的回收率和細(xì)胞活性上看，微流控芯片技術(shù)比其他分離技術(shù)具有突出的優(yōu)勢(shì)。有理由相信，基于微流控芯片的多技術(shù)組合將可能成為新一代高效能CTCs分離技術(shù)的發(fā)展方向；在此基礎(chǔ)之上的大規(guī)模臨床驗(yàn)證將全面推動(dòng)CTCs在腫瘤精準(zhǔn)治療中的臨床應(yīng)用。

3 CTCs的臨床應(yīng)用離不開其本身的生物學(xué)功能與分子特性研究

目前主要集中在2個(gè)方向：一是發(fā)生EMT的CTCs；二是具有腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)特性的CTCs。在轉(zhuǎn)移過程中，絕大部分CTCs會(huì)在機(jī)體免疫作用下發(fā)生凋亡,僅少數(shù)可存活下來形成轉(zhuǎn)移灶。因而對(duì)CTCs進(jìn)行簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)而沒有進(jìn)一步的分子特性鑒定完全可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的臨床判斷和診治[6]；同時(shí)由于目前CTCs分離技術(shù)在建立過程中都是通過不同病例組來進(jìn)行臨床應(yīng)用驗(yàn)證，亦無標(biāo)準(zhǔn)化方案，導(dǎo)致CTCs的分選計(jì)數(shù)難以進(jìn)行方法學(xué)比較，也無法在各種類別的腫瘤中形成統(tǒng)一的定量判定標(biāo)準(zhǔn)。近來的研究結(jié)果顯示，基于分子特性鑒定以檢測(cè)少數(shù)更具存活力和侵襲性的CTCs比單獨(dú)CTCs計(jì)數(shù)更有價(jià)值[7-8]，這可能也為CTCs在臨床應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)化提供了一條可行之路。

4 與CTCs相關(guān)的一些基本臨床應(yīng)用問題

與CTCs相關(guān)的某些臨床應(yīng)用問題尚有待闡明，才能全面發(fā)揮CTCs的“液體活檢”功能。目前的焦點(diǎn)主要包括以下4個(gè)方面：

4.1 CTCs檢測(cè)是否能用于腫瘤的早期診斷？ 目前CTCs的存在與腫瘤發(fā)生與發(fā)展之間的關(guān)系還處于研究探索階段。已有文獻(xiàn)證實(shí)，腫瘤原發(fā)灶形成前CTCs就已經(jīng)存在[9]，提示CTCs具有用于腫瘤早期診斷的潛力。但腫瘤早期階段的CTCs檢出率極低，這給臨床常規(guī)應(yīng)用帶來了巨大挑戰(zhàn)。綜合文獻(xiàn)，這一問題可能通過采取一些不同的策略逐步解決：首先，血液中的CTCs在時(shí)間和空間分布上是變化的，嚴(yán)格把控血液樣品的采集部位及采樣時(shí)間非常關(guān)鍵；其次，CTCs在血液中的數(shù)量極少，發(fā)展更敏感更特異的CTCs分離與檢測(cè)技術(shù)也至關(guān)重要。

4.2 發(fā)生EMT的CTCs與臨床的相關(guān)性如何？ EMT的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的CSCs特性有關(guān)[10]。由于CSCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源，發(fā)生EMT的CTCs可能成為腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的起源。然而，發(fā)生EMT的CTCs處于“冬眠”狀態(tài)，無法增殖形成轉(zhuǎn)移灶[10]。因此，這類CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性還需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗(yàn)證，尋找新的特異性標(biāo)志物以鑒別最終能形成轉(zhuǎn)移灶的CTCs，已成為最迫切的需求。此外，CTCs的EMT特性鑒定目前還主要集中在晚期患者，如果能在早期患者中找到證據(jù)表明這類CTCs的存在且與患者后續(xù)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，則能拓展CTCs的另一個(gè)重要功能，即在術(shù)前判斷患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性以優(yōu)化手術(shù)方案。

4.3 CTCs的特性鑒定是否有助于預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的部位？ 腫瘤細(xì)胞能從原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織的不同部位脫落入血形成CTCs，這些細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，向遠(yuǎn)端部位轉(zhuǎn)移的潛能和組織/器官選擇性也不相同[11]。因此，理論上來說，CTCs中存在具有組織特異性的CTCs亞群。目前這方面的研究尚未見報(bào)道。相信，隨著CTCs分子特性研究的深入，這些具有選擇轉(zhuǎn)移性的CTCs亞群將可能為我們提供各種腫瘤的轉(zhuǎn)移路線圖譜。如果能夠?qū)崿F(xiàn)該目標(biāo)，將進(jìn)一步拓展CTCs的新功能，即有助于定位新的微小轉(zhuǎn)移灶，提高臨床監(jiān)測(cè)患者復(fù)發(fā)的效率。

4.4 CTCs的基因分型與表型鑒定能否用于指導(dǎo)腫瘤的精準(zhǔn)治療？ 液態(tài)活檢由于具備無創(chuàng)檢測(cè)腫瘤狀況的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，正逐漸成為“精準(zhǔn)醫(yī)療”代表性檢測(cè)手段，同時(shí)也極大推動(dòng)了產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的進(jìn)程。其中，通過CTCs檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變和乳腺癌表皮生長(zhǎng)因子-2(HER2)表達(dá)已成功用于相應(yīng)的靶向治療[12-13]。因此，CTCs的基因分型與表型鑒定用于指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療是發(fā)展趨勢(shì)。然而，與化療藥物一樣，患者對(duì)靶向藥物的響應(yīng)也并非是持久性的；隨著治療的進(jìn)行，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變譜將會(huì)發(fā)生變化，耐藥的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及其治療方案的持續(xù)調(diào)整優(yōu)化對(duì)患者的療效及預(yù)后至關(guān)重要，但組織活檢無法承擔(dān)這一責(zé)任。CTCs檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)在于不僅能通過總體和分類計(jì)數(shù)對(duì)腫瘤進(jìn)展進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；而且還能對(duì)完整腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)鑒定并展開細(xì)胞功能研究，在單細(xì)胞水平研究分析腫瘤細(xì)胞群體異質(zhì)性及其與治療進(jìn)展的相關(guān)性。當(dāng)然這些都需要高靈敏度的CTCs分離、富集與檢測(cè)技術(shù)、體外原代培養(yǎng)技術(shù)、以及單細(xì)胞研究技術(shù)的發(fā)展和支撐。

5 小結(jié)及展望

CTCs的臨床應(yīng)用不僅面臨技術(shù)上的問題，還存在大量的實(shí)際應(yīng)用問題有待解決。一個(gè)好的CTCs分離技術(shù)應(yīng)當(dāng)同時(shí)具有以下4個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：其一，能夠獲得足量的CTCs，這是其臨床應(yīng)用可靠性的重要前提；其二，分離出的CTCs具有足夠的純度，這是準(zhǔn)確鑒定其基因型和表型用于腫瘤精準(zhǔn)治療的技術(shù)前提；其三，獲得的CTCs具有完整的活性，能夠繼續(xù)培養(yǎng)獲得足夠的數(shù)量，以用于大規(guī)模的藥物篩查和基因鑒定；其四，能夠分離出全部類型的CTCs，這為其臨床應(yīng)用的有效性提供保障。為此，需要通過大規(guī)模的臨床試驗(yàn)解決CTCs在應(yīng)用過程中存在的問題，并對(duì)其定量和鑒定依據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，才能為臨床診療提供全面而有價(jià)值的指導(dǎo)。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.01

江蘇省重點(diǎn)研發(fā)(社會(huì)發(fā)展)計(jì)劃基金(BE2015078)。

趙建華，1964年生，女，研究員，碩士，E-mail:Jhzhao2838@sina.com。

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2017-06-28)