文 旻 王曉川

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院（上海 201102）

·繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育·

重癥聯(lián)合免疫缺陷病新生兒T淋巴細(xì)胞受體切割環(huán)篩查概況

文 旻 王曉川

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院（上海 201102）

重癥聯(lián)合免疫缺陷?。╯evere combined immunodeficiency, SCID）是一組細(xì)胞免疫缺陷、同時累及體液免疫的原發(fā)性免疫缺陷?。╬rimary immunodeficiency, PID），根據(jù)有無B淋巴細(xì)胞，可將SCID分為T-B+及T-B-兩大類[1]。隨著近期對SCID研究的逐步深入，根據(jù)患者外周血T淋巴細(xì)胞的絕對計數(shù)、T淋巴細(xì)胞增殖分化功能及致病基因的類型，將SCID劃分為3大類：經(jīng)典的SCID、泄漏型SCID（leaky SCID）及變異型SCID，后兩者統(tǒng)稱為不典型SCID，其中泄漏型SCID包括Omenn綜合征[2]。大部分SCID患者出生時無明顯異常，但隨著母傳抗體的消耗，患者極易在嬰兒早期（3～6月齡）發(fā)生嚴(yán)重的反復(fù)感染，包括遷延性腹瀉，口腔念珠菌感染，嚴(yán)重中耳炎，間質(zhì)性肺炎及條件致病微生物如肺孢子蟲、巨細(xì)胞病毒等感染，絕大部分患者伴有生長發(fā)育遲緩[3]。若不及時糾正免疫缺陷，大部分患者在2歲以內(nèi)因重癥感染而死亡[4]。目前SCID的治療手段主要是通過同種異體造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）、基因治療（gene therapy, GT）或酶替代治療（enzyme replacement therapy, ERT）進行免疫重建。Pai等[5]通過隨訪240例移植后的SCID患者，認(rèn)為＜3.5月齡的SCID患者移植的存活率顯著高于＞3.5月齡或繼發(fā)感染的患兒，且移植后的存活率主要與患兒有無感染相關(guān)，與移植物的來源無明顯關(guān)聯(lián)。因此，對SCID患者進行早期診斷及早期治療，可顯著改善患兒的預(yù)后。

SCID符合Wilson等提出的新生兒疾病篩查（newborn screening, NBS）的所有標(biāo)準(zhǔn)[6]：體格檢查缺乏特異性；嬰兒早期可無臨床癥狀；如不及時治療，可造成嚴(yán)重后果；有治愈手段；通過早期篩查、明確診斷，在患者發(fā)生嚴(yán)重感染前及時進行免疫重建，可顯著改善該類疾病的預(yù)后；有低成本的、可大范圍實行的篩查手段。

1 T淋巴細(xì)胞受體切割環(huán)的概況

T淋巴細(xì)胞受體切割環(huán) (T-cell receptor excision circles，TREC)是αβTCR(T-cell receptor)生成過程中同時產(chǎn)生的無功能的DNA片段[7,8]，約70%的αβTCR在生成過程中可同時生成TREC，這些DNA片段不隨T細(xì)胞的分裂而復(fù)制，穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)[9]，因此TREC定量可以間接反應(yīng)胸腺輸出的初始T淋巴細(xì)胞的數(shù)量[10]。

2000年，Douek等[11]首次建立了用RT-PCR方法檢測外周血單核細(xì)胞TREC含量的方法；2005年，Chan等[12]建立了使用新生兒篩查卡片（即干血斑）檢測TREC的方法；2009年，Baker等[13]用RT-qPCR的方法檢測直徑3.2 mm的新生兒干血斑的TREC含量，完善了TREC篩查技術(shù)，通過檢測5 766例NBS卡片，初步得出TREC的平均值及中位值，并建立了TRECs的正常范圍。

隨著以上DNA及TREC檢測技術(shù)的逐步發(fā)展，大范圍實施新生兒SCID出生篩查成為一種可能。Sean等[14]通過對SCID出生篩查進行成本效用分析證明，盡管SCID發(fā)病率較低，但SCID篩查可顯著延長患者生命，節(jié)省醫(yī)療支出，進行SCID出生篩查是有成本效益的。Jennifer等[15]通過分析多種篩查SCID的方法，包括外周血血常規(guī)淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)（ALC）、IL-7、SCID相關(guān)蛋白檢測（如CD3，CD45等）、基因檢測及TREC檢測，證明相對于其他篩查方法，檢測TREC進行SCID出生篩查，性價比高、具有可行性，且漏診率極低，符合大范圍篩查項目的標(biāo)準(zhǔn)。

2 篩查方法及價值

目前國際上對TREC檢測雖已形成相對統(tǒng)一的流程，但不同地區(qū)的篩查方法仍存在區(qū)別，包括受檢干血斑的大小、是否同時檢測參照基因、界值的劃定等。大多數(shù)地區(qū)均使用3.2 mm的干血斑提取DNA，而英國使用1.5 mm的血片[16]；馬塞諸塞州及紐約州在檢測TREC的同時檢測核糖核酸酶P（RNAseP）的擴增情況作為參照序列[17]；威斯康星州及加利福尼亞州等地僅在首次篩查TREC結(jié)果異?；蚪Y(jié)果不明確時，再次同時完善TREC及β-actin的檢測，以此來減少篩查項目的整體花費[18]。威斯康星州的篩查界值為40 TREC/μL，在此界值下，所有的T細(xì)胞減少患者及SCID患者均未漏診[18]。

Spek等[19]總結(jié)了美國各地區(qū)的13項篩查結(jié)果，一共統(tǒng)計了315萬例新生兒，篩查出53例SCID患者，并對89例既往已明確診斷的SCID患者進行TREC檢測，所有患者的結(jié)果均為陽性， 提示SCID在美國地區(qū)的發(fā)病率約為1.7：100 000 ,并得出TREC對SCID的篩查靈敏度為100%，復(fù)檢率為0.20%～3.26%。該研究分析了其中5項篩查研究中TREC對SCID的篩查價值，顯示其對SCID的陽性預(yù)測值為0.8%～11.2%，對T淋巴細(xì)胞減少（T cell lymphopenia, TCL）的陽性預(yù)測值為18.3%～81.0%[19]，而所有SCID患者的TREC值均＜25/μL，是否同時檢測參照基因以及各地區(qū)界值范圍的不同，并不影響SCID患者的檢出[19]。

然而，并不是所有類型的SCID患者均能通過檢測TREC進行早期識別[20]，T細(xì)胞產(chǎn)生及成熟過程中、在TREC形成及形成之前相關(guān)基因突變所導(dǎo)致的SCID可通過TREC檢測進行篩查；V-D-J重排相關(guān)基因突變的SCID，其TREC含量亦較低[15]。部分聯(lián)合免疫缺陷病是由于TCR重排之后的相關(guān)基因突變導(dǎo)致，如：CD40L突變，F(xiàn)OXP3缺陷，IL-10Rα鏈缺陷，IL-2Rγ基因的p.R222C突變[21]，ZAP70[22]，MHC-Ⅱ類分子缺陷[20]等，以上類型的SCID篩查可出現(xiàn)假陰性。

TREC檢測不僅可用于SCID篩查，還可篩查除SCID之外的T淋巴細(xì)胞減少癥，包括多系統(tǒng)綜合征，如DiGeorge、唐氏綜合征、共濟失調(diào)性毛細(xì)血管擴張綜合征、18-三體綜合征、CHARGE綜合征等，及繼發(fā)性TCL，如淋巴管擴張等，此外，先天性白血病患者的TREC值也是減少的[18,23,24]。

除了在篩查疾病方面有重要價值外，TREC檢測還可評估HSCT患者移植后的胸腺輸出功能及T細(xì)胞重建情況，部分學(xué)者認(rèn)為它可作為HIV患者進行抗病毒治療后免疫重建的評估指標(biāo)[25]。

3 隨訪及治療

新生兒篩查是否能充分發(fā)揮其價值，主要取決于后期隨訪及治療。Sahai等[26]研究表明，部分篩查陽性的患者，成年后逐漸失訪，導(dǎo)致新生兒疾病篩查的結(jié)果不能得到充分利用，因此各個地區(qū)應(yīng)根據(jù)本地的情況，為陽性患者建立完善的隨訪系統(tǒng)及流程。

對T細(xì)胞有缺陷的患者，應(yīng)立即進行干預(yù)措施，包括床旁隔離、避免活疫苗接種[27,28]，避免使用未經(jīng)γ照射的血制品，同時予免疫球蛋白支持治療，予抗生素預(yù)防肺孢子蟲及其他感染等[29]。

并不是所有篩查結(jié)果陽性的患兒都需要進行移植治療。首次篩查結(jié)果陽性的患兒應(yīng)進行復(fù)檢，排除假陽性結(jié)果后，進一步進行流式細(xì)胞術(shù)檢測、精細(xì)分型及基因檢測進行確診，部分變異型SCID患者找不到明確的致病基因，需有經(jīng)驗的免疫?？漆t(yī)師進行診斷，同時考慮到相關(guān)的綜合征，部分繼發(fā)性TCL的患兒經(jīng)過治療，T細(xì)胞數(shù)量及功能均可改善，對T細(xì)胞持續(xù)偏低的患者，可能需要進行免疫重建[30]。

早產(chǎn)兒及極低出生體質(zhì)量兒的TREC值存在較高的假陽性率，可能有以下幾點原因：①目前沒有明確的與胎齡及出生體質(zhì)量相匹配的TREC正常值范圍；②大部分早產(chǎn)兒和低出生體質(zhì)量兒可能使用了不同類型的藥物，影響胸腺的輸出功能[31]。隨著后續(xù)篩查項目的普及，應(yīng)進行進一步深入研究，得出與胎齡匹配的TREC正常值范圍及TREC變化規(guī)律，降低篩查成本[32]。

4 篩查成果

2007年，新生兒篩查及兒童免疫學(xué)組、兒童移植中心等專家在舊金山舉行會議，探討新生兒SCID篩查事宜，積極推行篩查項目[33]。自2008年起，繼美國威斯康星州首次開展篩查項目以來，目前至少27個地區(qū)相繼推行了該項目，除此之外，巴西、西班牙、以色列等國也進行了該項研究[35-37]。我國臺灣地區(qū)于2010年5月至2011年12月也進行了SCID篩查的試點研究[38]?，F(xiàn)將部分地區(qū)的篩查結(jié)果總結(jié)如下。

4.1 美國威斯康星州地區(qū)

2008年起，美國威斯康星州開始實施新生兒SCID篩查，截至2011年，總共對207 696例新生兒進行了篩查，發(fā)現(xiàn)72例新生兒結(jié)果異常，包括9例經(jīng)復(fù)檢最終歸為結(jié)果陽性的足月兒及早產(chǎn)兒。其中，38例新生兒T細(xì)胞數(shù)量正常，33例T細(xì)胞數(shù)量異常，另外1例未接受檢測[18]。該項研究的TREC特異度為99.98%，假陽性率為0.018%，對TCL的陽性預(yù)測值為45.83%[18]。33例TCL的新生兒中，58%（n=19）存在繼發(fā)性TCL，如淋巴管發(fā)育異常、染色體畸形、多發(fā)先天畸形或代謝異常等；另外14例新生兒存在原發(fā)性TCL，包括5例暫時性TCL，4例DiGeorge綜合征及5例SCID患兒[18]。5例SCID患兒中包括1例Rac2突變、1例腺苷脫氨酶（ADA）缺陷、1例IL-7信號通路缺陷，另外2例未發(fā)現(xiàn)致病基因[18]。

4.2 美國馬薩諸塞州地區(qū)

自2009年2月起，美國馬薩諸塞州進行了為期1年的新生兒SCID篩查項目[39]。共篩查了來自68 811例嬰兒的77 491例標(biāo)本，其中272例嬰兒的首次篩查結(jié)果陽性，對其中二次檢測仍陽性的51例嬰兒進行了SCID診斷評估[39]。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，51例嬰兒中有19例嬰兒確診為TCL，其中，4例診斷為DiGeorge綜合征，1例Jacobsen綜合征，1例存在先天畸形，2例因心臟病手術(shù)切除胸腺，9例為特發(fā)性TCL，1例有待完善進一步檢查，1例死于心血管并發(fā)癥[39]。本次篩查項目中，未篩檢出SCID患者，該項目結(jié)束后，該地區(qū)又繼續(xù)篩檢了100 597例新生兒，并篩查出1例SCID患者，為Jak3突變[40]。

4.3 美國紐約州地區(qū)

美國2010年9月29日至2012年9月28日為期2年的篩查，共篩查485 912例嬰兒，篩查出97例TCL患兒，其中10例確診為SCID，包括9例經(jīng)典SCID及1例泄漏型SCID[41]。明確了7例SCID患兒的致病基因，包括2例ADA缺陷，4例IL2RG缺陷（其中1例為泄漏型IL2RG-SCID），1例IL7Rα缺陷[41]。另外3例SCID患兒的免疫表型為T-B+NK+，未發(fā)現(xiàn)致病基因，其中1例患者為3p13～p14.2片段缺失，該缺失片段既往未報道與SCID相關(guān)[41]。7例患兒進行了HSCT治療，2例ADA缺陷患兒均予酶替代治療，另外1例片段缺失患者在進行治療前死亡[41]。其余87例TCL患者中，30例診斷為特發(fā)性TCL（其中11例逐漸恢復(fù)正常）；27例存在T細(xì)胞發(fā)育相關(guān)缺陷，包括18-例DiGeorge綜合征，4例唐氏綜合征及18三體綜合征、17q12重復(fù)綜合征、CHARGE綜合征、6p染色體缺失綜合征等[41]；17例患兒由于先天性畸形、代謝異常、先天性心臟病胸腺切除術(shù)后、胃腸畸形（如腹裂、臍疝、胎兒水腫等）等原因?qū)е吕^發(fā)性TCL[41]；另外13例嬰兒合并其他不明原因的檢驗異常，如：粒細(xì)胞減少、B細(xì)胞減少、低丙種球蛋白血癥及CD8+T細(xì)胞減少等[41]。

4.4 美國加利福尼亞地區(qū)

美國加利福尼亞州于2010年8月起開始實施新生兒TREC篩查。兩年間，該地區(qū)共篩查993 724例嬰兒，161例嬰兒進行了流式細(xì)胞術(shù)檢測，50例患兒存在TCL（1/19 900; 0.005%）[23]。其中15例患者進行了HSCT、胸腺移植或基因治療，包括11例經(jīng)典的SCID患者，3例泄漏型SCID或Omenn綜合征，1例完全性DiGeorge綜合征[23]。經(jīng)典SCID患者中，4例嬰兒為IL2RG突變，3例為IL7R基因突變，2例為RAG1突變，1例Jak3突變，其余患者均為T-B+NK+表型，未發(fā)現(xiàn)致病基因[23]。3例泄漏型SCID中，2例為RAG1突變，1例為RMPP突變。其余TCL患兒中，6例為變異型SCID或聯(lián)合免疫缺陷，12例為T細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因缺陷綜合征，9例為繼發(fā)性TCL，8例為早產(chǎn)兒[23]。

4.5 美國11個地區(qū)的SCID篩查總結(jié)

Kwan等總結(jié)了美國11個SCID篩查項目組為期6年的篩查結(jié)果，除外上文中提到的地區(qū)，還包括科羅拉多州、康乃狄克州、特拉華州、密歇根等地?？偣埠Y查了3 030 083例新生兒，篩查出52例SCID患者，包括42例經(jīng)典SCID，9例泄漏型SCID及1例Omenn綜合征，本項研究得出美國地區(qū)的SCID發(fā)病率約為1∶58 000[42]，最常見的基因突變類型為IL2RG(19%)、RAG1(15%)、IL7R(12%)及ADA(11%)[42]。52例SCID患者中，死亡7例，其中3例在移植前死亡，余4例患者在HSCT治療后，2例因白消安不良反應(yīng)、1例因CMV感染、另外1例因嚴(yán)重呼吸道感染而死亡。其余45例患者中，40例進行了HSCT，4例為基因治療，2例進行了酶替代治療[42]。

通過對美國各地區(qū)新生兒篩查成果進行總結(jié)，可得出以下結(jié)論：①所有地區(qū)均篩查出了經(jīng)典SCID及泄漏型SCID患者；②所有的SCID患者的TREC結(jié)果均為陽性，無漏診；③絕大多數(shù)SCID患者通過及時的免疫重建，有較高的存活率，新生兒篩查項目可明顯改善SCID患者的預(yù)后。

4.6 英國地區(qū)

英國地區(qū)對5 000例新生兒干血斑樣本進行檢測，包括早產(chǎn)兒及來自NICU的新生兒，并用相同的方法檢測了18例既往已確診為SCID的患者的TREC含量[16]，該18例SCID患者的檢測結(jié)果均為陽性。該研究通過分析5個不同界值下（20、25、30、35及40 TREC copies/μL），TREC檢測對SCID陽性預(yù)測值的變化（波動在0.04%至1.00%）表明， TREC正常界值的劃定可影響實驗的陽性預(yù)測值。因此在進行大規(guī)模新生兒篩查時，合適的界值劃定很重要[16]。此研究中早產(chǎn)兒及NICU的新生兒的假陽性率并不高[16]。

4.7 中國臺灣地區(qū)

2010年5月至2011年底，中國臺灣地區(qū)率先進行了SCID試點篩查項目，篩查了該時間段內(nèi)，臺灣地區(qū)35%～37%的新生兒，共106 391例[38]。共篩檢出5例陽性患者，其中2例診斷為SCID（IL2RG,RAG1）,2例為基因不明的變異型SCID，1例為乳糜胸[38]。IL2RG及RAG1基因突變的患者分別于2.8月齡及5.3月齡進行了造血干細(xì)胞移植，另外2例變異型SCID患者，其中1例于15月齡時仍持續(xù)存在TCL，另1例于13月齡時T細(xì)胞數(shù)量明顯升高[38]。432例新生兒的首次TREC檢測結(jié)果不明確，重復(fù)檢測后，19例新生兒檢測結(jié)果仍異常，并且均進行了進一步的診斷評估。該19例陽性新生兒中，6例患兒T細(xì)胞數(shù)量正常，5例患兒為DiGeorge綜合征，8例為繼發(fā)性TCL，如心臟手術(shù)切除胸腺、先天性CMV感染、極低出生體質(zhì)量兒等[38]。此研究將大約200 000例未接受TREC篩查的新生兒作為對照組，2例未篩查的新生兒分別于3月齡及4月齡時死亡，其中1例為IL2RG突變，另外1例未發(fā)現(xiàn)致病基因[38]。此次研究項目同時得出了臺灣地區(qū)SCID的發(fā)病率，約為1：53 196[38]

5 結(jié)語

近年來新生兒SCID出生篩查取得了顯著的成果，但該項目仍存在各個方面的諸多挑戰(zhàn)，如診斷標(biāo)準(zhǔn)及陽性患者的治療隨訪等。部分TREC陽性患者的T細(xì)胞數(shù)量未達到SCID診斷標(biāo)準(zhǔn)，波動在200～1 500個/ μL，需要免疫科專業(yè)醫(yī)師明確判斷患者T細(xì)胞減少的原因，是否為暫時性或繼發(fā)性的，并及時制定下一步的隨訪及治療方案。威斯康星州對T細(xì)胞絕對計數(shù)波動在200～1 500個/μL，且T細(xì)胞增殖功能正常、未發(fā)現(xiàn)基因突變的患者予定期隨訪及觀察，同時根據(jù)免疫功能評估情況，必要時予以免疫球蛋白支持、抗生素預(yù)防感染治療[18]。

SCID是一類威脅生命的原發(fā)性免疫缺陷病，通過新生兒疾病篩查，可早期識別大部分SCID患兒，以期在患者3.5月齡前及時進行免疫重建。TREC檢測具有較高的靈敏度及特異度，有理由相信，在未來的5年里，新生兒SCID篩查會越來越普及。同時，需要學(xué)者們結(jié)合TREC檢測，更好地理解SCID的致病機制，發(fā)現(xiàn)新的突變類型，擴展SCID致病基因譜，以期提高我國SCID患兒的確診率及治愈率，改善患者預(yù)后。

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（本文編輯：鄒 強）

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.01.019

2016-07-17）