孫立明, 魏芳晶

·臨床論著·

強直性脊柱炎活動期患者血瘀狀態(tài)相關細胞因子/NF-κB信號通路情況及新風膠囊干預機制

孫立明1, 魏芳晶2

目的 探討新風膠囊對強直性脊柱炎(AS)患者由免疫炎癥介導的血瘀證的影響及干預機制。方法 將42例AS患者作為觀察組，選取同期40名健康志愿者作為對照組。觀察組服用新風膠囊，每次1.5 g，每日3次，連續(xù)服藥3個月。采用ELISA法檢測兩組外周血免疫和血瘀狀態(tài)相關細胞因子含量，并采用RT-PCR及Western blot法檢測NF-κB信號通路相關指標基因、蛋白表達變化。結(jié)果 與對照組比較，觀察組治療前外周血PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6等細胞因子含量均顯著升高(P<0.05)，而IL-4和IL-10含量均顯著降低(P<0.05)。觀察組采用新風膠囊治療3個月后，PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6均較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10含量均顯著提高(P<0.05)。觀察組治療前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達和p65、p50蛋白表達均顯著高于對照組(P<0.05)。觀察組治療3個月后IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達和p65、p50蛋白表達均較治療前顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 新風膠囊能有效改善AS患者由免疫炎癥介導的血瘀證，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路活化、維持機體Th1/Th2動態(tài)平衡狀態(tài)有關。

強直性脊柱炎;血瘀;NF-κB信號通路;新風膠囊

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一類發(fā)病晚期脊柱呈“竹節(jié)樣”變化的進行性自身免疫性疾病，多發(fā)于青壯年男性，其病因隱匿，病程緩慢而纏綿，誤診率及致殘率很高[1-2]。目前，AS的確切發(fā)病機制尚不明確，臨床上缺乏有效的治療方案。新風膠囊是我國自主研發(fā)的具有健脾化濕通絡功效的中成藥，近年來大量臨床數(shù)據(jù)顯示其在改善AS患者由免疫炎癥介導的血瘀證方面具有良好療效[3]。本研究通過觀察AS患者在新風膠囊治療前后外周血細胞因子及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號通路相關指標的變化，初步研究新風膠囊的作用機制，為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例與對照 選擇2014年3月～2015年6月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院門診及住院的42例AS患者作為觀察組，其中男32例，女10例，年齡23～48(33.12±5.46)歲，病程1.40～18.60(12.14±3.56)年?；颊咴\斷均符合美國風濕病協(xié)會(ACR)1984年修訂的強直性脊柱炎紐約診斷標準。排除標準：① 脊柱出現(xiàn)嚴重畸形者；② 1個月內(nèi)使用過腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑者；③ 研究者認為不宜參與該項研究的受試者。選取同期本院體檢中心的40名健康志愿者作為對照組，已排除自身免疫性疾病，其中男30例，女10例，年齡23～49(33.26±5.35)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，納入研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 TransScript?Two-Step RT-PCR SuperMix試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；纖溶酶原抑制劑-2(PAI-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血栓烷A2(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)、血小板α-顆粒膜蛋白(GMP140)、白細胞介素(IL)1β、IL-6、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人p50單抗、鼠抗人p65單抗和兔抗人β-actin單抗均購自Santa Cruz公司(美國)。37℃恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo公司(美國)，AB17500型熒光定量PCR儀購于AppliedBiosystems公司(美國)，Elx800-UV酶標儀購于BioTek公司(美國)，倒置光學顯微鏡(奧林巴斯CKX-41)購自奧林巴斯株式會社(日本)。

1.3 治療方案 觀察組服用新風膠囊(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，批號：201205291，規(guī)格：0.5 g/粒)，每次1.5 g，每日3次，連續(xù)服藥3個月[4]。在治療期間可根據(jù)病情需要服用非甾體抗炎藥物，不能加服其他免疫抑制劑及治療本病的藥物。

1.4 血清中相關細胞因子含量測定 兩組患者均于治療前后取清晨空腹靜脈血10 ml，室溫下靜置2 h后3 000 r/min離心15 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10的含量，具體操作步驟嚴格按照說明書相關規(guī)定進行。

1.5 RT-PCR實驗 取1.4項下的靜脈血離心沉淀，采用RT-PCR法檢測NF-κB信號通路相關指標IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達。參照試劑盒說明書分別提取細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)對照進行PCR擴增，目的基因的引物設計是根據(jù)GeneBank提供IκBα、IKKβ、p65、p50的mRNA序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(見表1)。采用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析，測出各條帶IOD值，以β-actin作為內(nèi)參照。

表1 目的基因的引物設計

1.6 Western blot實驗 取1.4項下的靜脈血離心沉淀，收集細胞用PBS洗滌2次，加入1×SDS上樣緩沖液300 μl，冰上放置30 min，超聲裂解細胞，4℃，15 000 r/min條件下離心10 min，收集上清為細胞裂解液。用BCA法進行蛋白定量，10% SDA-PAGE垂直電泳分離，上樣量為30 μg/孔，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚乙烯二氟膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，1 ∶1 000 稀釋的鼠抗人p65單抗、1 ∶1 000稀釋的鼠抗人的p50單抗、1 ∶4 000稀釋的兔抗人的β-actin單抗室溫孵育1 h，膜洗3次，加入1 ∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵育1 h，膜洗3次，用ECL發(fā)光系統(tǒng)進行顯影，采用ImageJ軟件對條帶進行半定量分析，測出各條帶IOD值，以β-actin作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血血清細胞因子含量比較 見表2。與對照組比較，觀察組治療前外周血PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6等細胞因子含量均顯著升高(P<0.05)，而IL-4和IL-10含量均顯著降低(P<0.05)。觀察組采用新風膠囊治療3個月后，PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6均較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10含量均顯著提高(P<0.05)，同時TXA2、PGI2、GMP140含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 兩組外周血血清細胞因子含量比較±s)

與對照組比較：*P<0.05；與治療前比較：#P<0.05

2.2 新風膠囊對AS患者外周血的 IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表達影響 見表3、圖1。采用RT-PCR檢測AS患者外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組治療前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達均顯著升高(P<0.05)。觀察組采用新風膠囊治療3個月后，外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達均較治療前顯著降低(P<0.05)。

表3 兩組IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達情況

與對照組比較：*P<0.05；與治療前比較：#P<0.05

圖1 兩組IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達情況

2.3 新風膠囊對AS患者外周血p65、p50蛋白表達影響 見表4、圖2。Western blot檢測兩組MCF-7細胞的p65、p50蛋白表達，結(jié)果顯示，與對照組比較，觀察組治療前p65、p50蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。觀察組采用新風膠囊治療3個月后，p65、p50蛋白表達均較治療前顯著降低(P<0.05)。

表4 兩組p65、p50蛋白表達情況

與對照組比較：*P<0.05；與治療前比較：#P<0.05

圖2 兩組p65、p50蛋白表達

3 討論

3.1 AS的中醫(yī)學病機分析 AS是一種全身性自身免疫疾病，可導致髖關節(jié)損害、中軸關節(jié)疼痛及頸部、腰背強直且活動不利等，嚴重降低患者的生活質(zhì)量,中醫(yī)將其歸于“痹證”范疇[5]。AS患者脈絡痹阻不通，氣滯血瘀，瘀結(jié)不散，筋脈失養(yǎng)，不溫煦四肢，發(fā)展為筋攣骨松，關節(jié)變形，難以行走[6]。目前臨床上主要通過 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140 等指標反映血瘀證，其中 PAI-2 是尿激酶型纖溶酶原激活劑的高效專一抑制劑，抑制纖溶酶原激活物誘導的血纖蛋白凝塊的溶解；TXA2 是一種血栓素，可以激活血小板、使其聚集；PGI2是血栓素的對抗劑，它的合成減少可促進血栓形成；GMP140 是血小板活化釋放的特異標志之一，可反映體內(nèi)血小板的活化程度及血栓形成傾向[7-8]。本研究中，觀察組治療前外周血 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140 等細胞因子含量均顯著高于對照組(P<0.05)，提示AS患者普遍存在血瘀證。

3.2 新風膠囊的主要成分和臨床應用 新風膠囊是我國自主研發(fā)的具有健脾化濕通絡功效的中成藥，其由黃芪、雷公藤、薏苡仁、蜈蚣等多味中藥材組成。方中黃芪補氣固表、托瘡生肌，雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，薏苡仁除痹、排膿、解毒散結(jié)，蜈蚣息風解痙，全方具有健脾化濕通絡功效[9]。近年來，臨床研究證實新風膠囊能有效改善AS患者的血瘀證，盛長健 等[4]研究證實新風膠囊治療強直性脊柱炎患者具有良好臨床療效并能改善患者的生活質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，觀察組在采用新風膠囊治療3個月后 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140均較治療前顯著降低(P<0.05)，提示新風膠囊有助于改善AS患者由免疫炎癥介導的血瘀證。

3.3 新風膠囊治療AS的作用機制 NF-κB 作為信號轉(zhuǎn)導的樞紐，它通過調(diào)控大量基因轉(zhuǎn)錄，釋放 TNF-α、IL-10和IL-1β 等細胞因子，是機體免疫反應的關鍵調(diào)控者[10]。本研究中，觀察組治療前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表達和 p65、p50 蛋白表達均顯著高于對照組(P<0.05)，提示 AS 患者的 NF-κB 信號通路處于高活化狀態(tài)。而 AS 患者采用新風膠囊治療3個月后IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表達和 p65、p50 蛋白表達均較治療前顯著降低(P<0.05)，提示新風膠囊可能通過抑制NF-κB信號通路活化，調(diào)節(jié)細胞因子的變化，從而維持機體 Th1/Th2 動態(tài)平衡狀態(tài)，降低炎癥反應。

細胞因子作為關節(jié)炎癥的重要介質(zhì)，是 AS 免疫炎癥主要參與者。本研究發(fā)現(xiàn) AS 患者 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著高于健康人群(P<0.05)，而 IL-4和IL-10 含量均顯著低于健康人群(P<0.05)。正常情況下，TNF-α、IL-1β、IL-6 作為機體重要的免疫炎癥因子，其功能往往受到 IL-4、IL-10 等抑制炎癥反應的細胞因子制約，從而維持正常機體的 Th1/Th2 動態(tài)平衡。本研究結(jié)果提示，AS 患者存在 Th1/Th2 失衡，并且失衡向免疫炎癥方向漂移。觀察組采用新風膠囊治療3個月后 TNF-α、IL-1β、IL-6 均較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10 含量均顯著提高(P<0.05)，同時 TXA2、PGI2、GMP140 含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示新風膠囊改善AS患者血瘀證可能與維持Th1/Th2 平衡狀態(tài)、減輕免疫炎癥反應有關。

AS 患者血瘀證的發(fā)生涉及諸多基因的激活以及信號的調(diào)控，NF-κB 作為信號轉(zhuǎn)導的樞紐，它在血瘀證發(fā)展過程中起著決定性作用。新風膠囊能有效改善 AS 患者由免疫炎癥介導的血瘀證，其作用機制可能與抑制 NF-κB 信號通路活化，維持機體 Th1/Th2 動態(tài)平衡狀態(tài)有關。

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(接收日期：2016-12-24)

The relationship between blood stasis condition and cytokine/NF-κB signaling pathway in patients with ankylosing spondylitis and the intervention mechanism of Xinfeng capsule

SUNLi-ming,WEIFang-jing

(1DeptofInspection,theSecondAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010030,China；2DeptofCardiology,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010050,China)

Objective To explore the relationship between blood stasis condition and cytokine/NF-κB signaling pathway in patients with ankylosing spondylitis and the intervention mechanism of Xinfeng capsule. Methods A total of 42 patients with ankylosing spondylitis were selected as observation group, and 40 healthy subjects were enrolled as control group. Observation group taked Xinfeng capsule, each 1.5 grams, 3 times every day, continuous medication for 3 months. The blood immune and blood stasis cytokine were detected by ELISA, and NF-κB signaling pathway indicators gene and protein expression were measured by RT-PCR and Western-blot. Results Compared with control group, the content of PAI-2, TNF-α, TXA2, PGI2, GMP140, IL-1β and IL-6 in observation group significantly increased pre-treatment(P<0.05), and IL-4, IL-10 significantly decreased(P<0.05). The content of PAI-2, TNF-α, TXA2, PGI2, GMP140, IL-1β and IL-6 significantly decreased after the observation group were treated with the Xinfeng capsule treatment for 3 months(P<0.05), and IL-4, IL-10 significantly increased(P<0.05). The gene expression of IκBα， IKKβ, p65, p50 mRNA and the protein expression of p65, p50 in the observation group before treatment showed higher than control group(P<0.05), and those showed lower after treated with the Xinfeng capsule treatment for 3 months(P<0.05). Conclusions Xinfeng capsule can improve inflammation in patients with AS by the immune-mediated blood stasis, and the mechanisms could related to down-regulated expression of NF-κB and maintain body Th1/Th2 state of dynamic equilibrium.

ankylosing spondylitis;blood stasis;NF kappa B signaling pathway;Xinfeng capsule

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.01.018

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 0100302內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050

孫立明,男，碩士,主管檢驗,主要從事醫(yī)學檢驗研究,E-mail:158481750@qq.com； 魏芳晶,女,博士,教授,主任醫(yī)師,通訊作者,主要從事冠心病介入治療研究及心臟干細胞移植、基因治療研究, E-mail:jingjixw@163.com

R 681.51;R 593.23;R 286

A

1008-0287(2017)01-0038-04