孫立明, 魏芳晶

·臨床論著·

強(qiáng)直性脊柱炎活動(dòng)期患者血瘀狀態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子/NF-κB信號通路情況及新風(fēng)膠囊干預(yù)機(jī)制

孫立明1, 魏芳晶2

目的 探討新風(fēng)膠囊對強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者由免疫炎癥介導(dǎo)的血瘀證的影響及干預(yù)機(jī)制。方法 將42例AS患者作為觀察組，選取同期40名健康志愿者作為對照組。觀察組服用新風(fēng)膠囊，每次1.5 g，每日3次，連續(xù)服藥3個(gè)月。采用ELISA法檢測兩組外周血免疫和血瘀狀態(tài)相關(guān)細(xì)胞因子含量，并采用RT-PCR及Western blot法檢測NF-κB信號通路相關(guān)指標(biāo)基因、蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與對照組比較，觀察組治療前外周血PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子含量均顯著升高(P<0.05)，而IL-4和IL-10含量均顯著降低(P<0.05)。觀察組采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后，PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6均較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10含量均顯著提高(P<0.05)。觀察組治療前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)和p65、p50蛋白表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.05)。觀察組治療3個(gè)月后IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)和p65、p50蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 新風(fēng)膠囊能有效改善AS患者由免疫炎癥介導(dǎo)的血瘀證，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路活化、維持機(jī)體Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)有關(guān)。

強(qiáng)直性脊柱炎;血瘀;NF-κB信號通路;新風(fēng)膠囊

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一類發(fā)病晚期脊柱呈“竹節(jié)樣”變化的進(jìn)行性自身免疫性疾病，多發(fā)于青壯年男性，其病因隱匿，病程緩慢而纏綿，誤診率及致殘率很高[1-2]。目前，AS的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上缺乏有效的治療方案。新風(fēng)膠囊是我國自主研發(fā)的具有健脾化濕通絡(luò)功效的中成藥，近年來大量臨床數(shù)據(jù)顯示其在改善AS患者由免疫炎癥介導(dǎo)的血瘀證方面具有良好療效[3]。本研究通過觀察AS患者在新風(fēng)膠囊治療前后外周血細(xì)胞因子及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號通路相關(guān)指標(biāo)的變化，初步研究新風(fēng)膠囊的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例與對照 選擇2014年3月～2015年6月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診及住院的42例AS患者作為觀察組，其中男32例，女10例，年齡23～48(33.12±5.46)歲，病程1.40～18.60(12.14±3.56)年?；颊咴\斷均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)1984年修訂的強(qiáng)直性脊柱炎紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 脊柱出現(xiàn)嚴(yán)重畸形者；② 1個(gè)月內(nèi)使用過腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑者；③ 研究者認(rèn)為不宜參與該項(xiàng)研究的受試者。選取同期本院體檢中心的40名健康志愿者作為對照組，已排除自身免疫性疾病，其中男30例，女10例，年齡23～49(33.26±5.35)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 TransScript?Two-Step RT-PCR SuperMix試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；纖溶酶原抑制劑-2(PAI-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血栓烷A2(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)、血小板α-顆粒膜蛋白(GMP140)、白細(xì)胞介素(IL)1β、IL-6、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人p50單抗、鼠抗人p65單抗和兔抗人β-actin單抗均購自Santa Cruz公司(美國)。37℃恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo公司(美國)，AB17500型熒光定量PCR儀購于AppliedBiosystems公司(美國)，Elx800-UV酶標(biāo)儀購于BioTek公司(美國)，倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯CKX-41)購自奧林巴斯株式會(huì)社(日本)。

1.3 治療方案 觀察組服用新風(fēng)膠囊(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，批號：201205291，規(guī)格：0.5 g/粒)，每次1.5 g，每日3次，連續(xù)服藥3個(gè)月[4]。在治療期間可根據(jù)病情需要服用非甾體抗炎藥物，不能加服其他免疫抑制劑及治療本病的藥物。

1.4 血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量測定 兩組患者均于治療前后取清晨空腹靜脈血10 ml，室溫下靜置2 h后3 000 r/min離心15 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10的含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 取1.4項(xiàng)下的靜脈血離心沉淀，采用RT-PCR法檢測NF-κB信號通路相關(guān)指標(biāo)IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)。參照試劑盒說明書分別提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的基因的引物設(shè)計(jì)是根據(jù)GeneBank提供IκBα、IKKβ、p65、p50的mRNA序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(見表1)。采用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行半定量分析，測出各條帶IOD值，以β-actin作為內(nèi)參照。

表1 目的基因的引物設(shè)計(jì)

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 取1.4項(xiàng)下的靜脈血離心沉淀，收集細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入1×SDS上樣緩沖液300 μl，冰上放置30 min，超聲裂解細(xì)胞，4℃，15 000 r/min條件下離心10 min，收集上清為細(xì)胞裂解液。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDA-PAGE垂直電泳分離，上樣量為30 μg/孔，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚乙烯二氟膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，1 ∶1 000 稀釋的鼠抗人p65單抗、1 ∶1 000稀釋的鼠抗人的p50單抗、1 ∶4 000稀釋的兔抗人的β-actin單抗室溫孵育1 h，膜洗3次，加入1 ∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵育1 h，膜洗3次，用ECL發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯影，采用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行半定量分析，測出各條帶IOD值，以β-actin作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血血清細(xì)胞因子含量比較 見表2。與對照組比較，觀察組治療前外周血PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子含量均顯著升高(P<0.05)，而IL-4和IL-10含量均顯著降低(P<0.05)。觀察組采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后，PAI-2、TNF-α、TXA2、PGI2、GMP140、IL-1β、IL-6均較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10含量均顯著提高(P<0.05)，同時(shí)TXA2、PGI2、GMP140含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩組外周血血清細(xì)胞因子含量比較±s)

與對照組比較：*P<0.05；與治療前比較：#P<0.05

2.2 新風(fēng)膠囊對AS患者外周血的 IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表達(dá)影響 見表3、圖1。采用RT-PCR檢測AS患者外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組治療前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。觀察組采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后，外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)均較治療前顯著降低(P<0.05)。

表3 兩組IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)情況

與對照組比較：*P<0.05；與治療前比較：#P<0.05

圖1 兩組IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA基因表達(dá)情況

2.3 新風(fēng)膠囊對AS患者外周血p65、p50蛋白表達(dá)影響 見表4、圖2。Western blot檢測兩組MCF-7細(xì)胞的p65、p50蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，觀察組治療前p65、p50蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。觀察組采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后，p65、p50蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低(P<0.05)。

表4 兩組p65、p50蛋白表達(dá)情況

與對照組比較：*P<0.05；與治療前比較：#P<0.05

圖2 兩組p65、p50蛋白表達(dá)

3 討論

3.1 AS的中醫(yī)學(xué)病機(jī)分析 AS是一種全身性自身免疫疾病，可導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)損害、中軸關(guān)節(jié)疼痛及頸部、腰背強(qiáng)直且活動(dòng)不利等，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量,中醫(yī)將其歸于“痹證”范疇[5]。AS患者脈絡(luò)痹阻不通，氣滯血瘀，瘀結(jié)不散，筋脈失養(yǎng)，不溫煦四肢，發(fā)展為筋攣骨松，關(guān)節(jié)變形，難以行走[6]。目前臨床上主要通過 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140 等指標(biāo)反映血瘀證，其中 PAI-2 是尿激酶型纖溶酶原激活劑的高效專一抑制劑，抑制纖溶酶原激活物誘導(dǎo)的血纖蛋白凝塊的溶解；TXA2 是一種血栓素，可以激活血小板、使其聚集；PGI2是血栓素的對抗劑，它的合成減少可促進(jìn)血栓形成；GMP140 是血小板活化釋放的特異標(biāo)志之一，可反映體內(nèi)血小板的活化程度及血栓形成傾向[7-8]。本研究中，觀察組治療前外周血 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140 等細(xì)胞因子含量均顯著高于對照組(P<0.05)，提示AS患者普遍存在血瘀證。

3.2 新風(fēng)膠囊的主要成分和臨床應(yīng)用 新風(fēng)膠囊是我國自主研發(fā)的具有健脾化濕通絡(luò)功效的中成藥，其由黃芪、雷公藤、薏苡仁、蜈蚣等多味中藥材組成。方中黃芪補(bǔ)氣固表、托瘡生肌，雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，薏苡仁除痹、排膿、解毒散結(jié)，蜈蚣息風(fēng)解痙，全方具有健脾化濕通絡(luò)功效[9]。近年來，臨床研究證實(shí)新風(fēng)膠囊能有效改善AS患者的血瘀證，盛長健 等[4]研究證實(shí)新風(fēng)膠囊治療強(qiáng)直性脊柱炎患者具有良好臨床療效并能改善患者的生活質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，觀察組在采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后 PAI-2、TXA2、PGI2、GMP140均較治療前顯著降低(P<0.05)，提示新風(fēng)膠囊有助于改善AS患者由免疫炎癥介導(dǎo)的血瘀證。

3.3 新風(fēng)膠囊治療AS的作用機(jī)制 NF-κB 作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐，它通過調(diào)控大量基因轉(zhuǎn)錄，釋放 TNF-α、IL-10和IL-1β 等細(xì)胞因子，是機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控者[10]。本研究中，觀察組治療前外周血的IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表達(dá)和 p65、p50 蛋白表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.05)，提示 AS 患者的 NF-κB 信號通路處于高活化狀態(tài)。而 AS 患者采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后IκBα、IKKβ、p65、p50 mRNA 基因表達(dá)和 p65、p50 蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低(P<0.05)，提示新風(fēng)膠囊可能通過抑制NF-κB信號通路活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的變化，從而維持機(jī)體 Th1/Th2 動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，降低炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞因子作為關(guān)節(jié)炎癥的重要介質(zhì)，是 AS 免疫炎癥主要參與者。本研究發(fā)現(xiàn) AS 患者 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著高于健康人群(P<0.05)，而 IL-4和IL-10 含量均顯著低于健康人群(P<0.05)。正常情況下，TNF-α、IL-1β、IL-6 作為機(jī)體重要的免疫炎癥因子，其功能往往受到 IL-4、IL-10 等抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子制約，從而維持正常機(jī)體的 Th1/Th2 動(dòng)態(tài)平衡。本研究結(jié)果提示，AS 患者存在 Th1/Th2 失衡，并且失衡向免疫炎癥方向漂移。觀察組采用新風(fēng)膠囊治療3個(gè)月后 TNF-α、IL-1β、IL-6 均較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-4和IL-10 含量均顯著提高(P<0.05)，同時(shí) TXA2、PGI2、GMP140 含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示新風(fēng)膠囊改善AS患者血瘀證可能與維持Th1/Th2 平衡狀態(tài)、減輕免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

AS 患者血瘀證的發(fā)生涉及諸多基因的激活以及信號的調(diào)控，NF-κB 作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐，它在血瘀證發(fā)展過程中起著決定性作用。新風(fēng)膠囊能有效改善 AS 患者由免疫炎癥介導(dǎo)的血瘀證，其作用機(jī)制可能與抑制 NF-κB 信號通路活化，維持機(jī)體 Th1/Th2 動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)有關(guān)。

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(接收日期：2016-12-24)

The relationship between blood stasis condition and cytokine/NF-κB signaling pathway in patients with ankylosing spondylitis and the intervention mechanism of Xinfeng capsule

SUNLi-ming,WEIFang-jing

(1DeptofInspection,theSecondAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010030,China；2DeptofCardiology,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010050,China)

Objective To explore the relationship between blood stasis condition and cytokine/NF-κB signaling pathway in patients with ankylosing spondylitis and the intervention mechanism of Xinfeng capsule. Methods A total of 42 patients with ankylosing spondylitis were selected as observation group, and 40 healthy subjects were enrolled as control group. Observation group taked Xinfeng capsule, each 1.5 grams, 3 times every day, continuous medication for 3 months. The blood immune and blood stasis cytokine were detected by ELISA, and NF-κB signaling pathway indicators gene and protein expression were measured by RT-PCR and Western-blot. Results Compared with control group, the content of PAI-2, TNF-α, TXA2, PGI2, GMP140, IL-1β and IL-6 in observation group significantly increased pre-treatment(P<0.05), and IL-4, IL-10 significantly decreased(P<0.05). The content of PAI-2, TNF-α, TXA2, PGI2, GMP140, IL-1β and IL-6 significantly decreased after the observation group were treated with the Xinfeng capsule treatment for 3 months(P<0.05), and IL-4, IL-10 significantly increased(P<0.05). The gene expression of IκBα， IKKβ, p65, p50 mRNA and the protein expression of p65, p50 in the observation group before treatment showed higher than control group(P<0.05), and those showed lower after treated with the Xinfeng capsule treatment for 3 months(P<0.05). Conclusions Xinfeng capsule can improve inflammation in patients with AS by the immune-mediated blood stasis, and the mechanisms could related to down-regulated expression of NF-κB and maintain body Th1/Th2 state of dynamic equilibrium.

ankylosing spondylitis;blood stasis;NF kappa B signaling pathway;Xinfeng capsule

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.01.018

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 0100302內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050

孫立明,男，碩士,主管檢驗(yàn),主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究,E-mail:158481750@qq.com； 魏芳晶,女,博士,教授,主任醫(yī)師,通訊作者,主要從事冠心病介入治療研究及心臟干細(xì)胞移植、基因治療研究, E-mail:jingjixw@163.com

R 681.51;R 593.23;R 286

A

1008-0287(2017)01-0038-04