李文，曾國慶，陳愛寶，楊學(xué)洪，穆繼宏

(中國人民解放軍第425醫(yī)院骨科，海南 三亞572008)

兔膝關(guān)節(jié)開放性海水浸泡損傷模型的構(gòu)建

李文，曾國慶，陳愛寶，楊學(xué)洪，穆繼宏

(中國人民解放軍第425醫(yī)院骨科，海南 三亞572008)

目的 探索并構(gòu)建理想的兔膝關(guān)節(jié)開放性海水浸泡損傷的動(dòng)物模型。方法 取新西蘭白兔60只，建立兔膝關(guān)節(jié)開放性損傷模型，按照不同的海水浸泡時(shí)間分為對照組、0.5 h組、1 h組、3 h組和6 h組，每組各12只。對照組不予處理，各實(shí)驗(yàn)組制備膝關(guān)節(jié)開放性傷口，分別給予相應(yīng)的海水浸泡時(shí)間。術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口及存活情況，于術(shù)后7 d抽取各組白兔膝關(guān)節(jié)液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測關(guān)節(jié)液中炎性因子白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果3 h組和6 h組的7 d存活率分別為91.7%、75.0%，其余各組均為100.0%；1 h組、3 h組和6 h組的14 d存活率分別為91.7%、83.3%和58.3%，其余各組均為100.0%。術(shù)后7 d，3 h組和6 h組中關(guān)節(jié)液IL-1β水平分別為(37.50±6.1)pg/mL和(38.40±5.1)pg/mL，明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而3 h組和6 h組中關(guān)節(jié)液IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；術(shù)后7 d，1 h組和3 h組關(guān)節(jié)液中的TNF-α水平分別為(297.48±35.7)pg/mL和(312.84±34.0)pg/mL，高于0.5 h組和對照組，低于6 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而1 h組和3 h組關(guān)節(jié)液中的TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 海水浸泡3 h構(gòu)建兔膝關(guān)節(jié)海水浸泡損傷的動(dòng)物模型具有動(dòng)物存活率高、炎性反應(yīng)活躍等特點(diǎn)，是一種理想的關(guān)節(jié)開放性海水浸泡損傷的動(dòng)物模型。

膝關(guān)節(jié)；海水浸泡；動(dòng)物模型；兔

隨著人們對海洋的不斷認(rèn)識和探索，海水浸泡損傷在戰(zhàn)創(chuàng)傷中所占的比例不斷增大。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立合理的膝關(guān)節(jié)開放性海水浸泡損傷動(dòng)物模型，了解動(dòng)物模型的病理機(jī)制，提高關(guān)節(jié)海水浸泡傷的臨床處理水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取普通新西蘭白兔60只，體質(zhì)量(2.4±0.2)kg，雌雄不限。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為五組，每組12只。其中4組按膝關(guān)節(jié)外傷后海水浸泡時(shí)間分為0.5 h組、1 h組、3 h組和6 h組，另1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不予如何處理，作為對照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?各實(shí)驗(yàn)組白兔按0.l mL/kg給予速眠新肌注麻醉，四肢固定在實(shí)驗(yàn)臺上，單側(cè)膝關(guān)節(jié)去毛，常規(guī)消毒、鋪單。沿髕旁內(nèi)側(cè)做約2.5cm的橫行切口，逐層切開至關(guān)節(jié)囊，直至關(guān)節(jié)腔，暴露關(guān)節(jié)軟骨面。在自然天氣情況下將各組家兔患膝傷口在海水中分別浸泡0.5h、1h、3h和6h，浸泡結(jié)束后用無菌生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，依次縫合傷口。對照組白兔不予處理。術(shù)后全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按常規(guī)分籠喂養(yǎng)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 臨床觀察 大體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷口情況、關(guān)節(jié)活動(dòng)度等，比較各組間術(shù)后7 d和14 d的生存率。

1.3.2 關(guān)節(jié)液炎性因子指標(biāo) 于術(shù)后第7天按相同方式麻醉、消毒，采用注射器于膝關(guān)節(jié)外側(cè)間隙向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1.0mL無菌生理鹽水，待充分混勻后抽取1.0mL關(guān)節(jié)液備用。樣本置于離心管中，1 500r/min離心20min，-70℃保存待測。采用ELISA試劑盒檢測各樣本中白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的水平。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后7 d和14 d各組白兔的生存率比較 全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后第1天均能站立，傷口無明顯滲出，局部皮膚無紅腫。術(shù)后第3天，3 h組和6 h組部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患膝出現(xiàn)腫脹，局部皮溫高，傷口無明顯滲出。術(shù)后第5天，1 h組1例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患膝出現(xiàn)紅腫，皮溫稍高。術(shù)后14 d臨床觀察，存活的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，僅6 h組出現(xiàn)1例傷口不愈合，見表1。

表1 術(shù)后7 d和14 d各組生存率比較[只(%)]

2.2 術(shù)后7 d各組白兔關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α的水平 術(shù)后7 d，各組兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α的水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3 h組和6 h組的IL-1β水平明顯高于0.5 h組和1 h組(P＜0.05)，且0.5 h組和1 h組的IL-1β水平高于對照組(P＜0.05)；此外，6 h組的TNF-α水平明顯高于1 h組和3 h組(P＜0.05)，且1 h組和3 h組的TNF-α水平明顯高于對照組和0.5 h組。這表明長時(shí)間的海水浸泡容易引發(fā)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，見表2。

表2 術(shù)后7 d各組白兔膝關(guān)節(jié)液IL-1β和TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

表2 術(shù)后7 d各組白兔膝關(guān)節(jié)液IL-1β和TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與0.5 h組比較，bP＜0.05；與1 h組比較，cP＜0.05；與3 h組比較，dP＜0.05。

組別對照組0.5 h組1 h組3 h組6 h組F值P值只數(shù)12 12 12 11 9 IL-1β 25.49±2.8 30.21±5.8a31.58±4.7a37.50±6.1abc38.40±5.1abc13.694＜0.05 TNF-α 252.00±57.9 254.77±38.1 297.48±35.7ab312.84±34.0ab353.62±32.3abcd13.100＜0.05

3 討論

海水是一種較為復(fù)雜的致傷因素，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)開放性損傷，海水浸泡將加重創(chuàng)傷后機(jī)體的病理生理改變，從而導(dǎo)致不同的預(yù)后及治療方案[1-2]。由于關(guān)節(jié)內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且軟骨、滑膜等組織自愈能力欠佳，故建立合適的關(guān)節(jié)內(nèi)海水浸泡傷動(dòng)物模型將有助于了解其病理改變，提供合理的臨床治療方案。

有學(xué)者研究證明，高滲液體可刺激單核細(xì)胞內(nèi)炎性介質(zhì)基因的表達(dá)[3]。發(fā)生海水浸泡傷后，與創(chuàng)傷愈合的相關(guān)蛋白早期表達(dá)減弱以及機(jī)體對海水中致病菌的暴露，都可能是影響組織愈合的因素[4-5]。林建寧等[6]觀察了家兔海水浸泡開放性骨折的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)海水浸泡使傷口的感染率增高，骨折愈合的滿意率下降，骨痂形成不良率增高，骨折愈合過程延遲[7]。筆者假設(shè)海水浸泡對膝關(guān)節(jié)開放性損傷產(chǎn)生重要的影響，在關(guān)節(jié)及全身感染率、關(guān)節(jié)內(nèi)組織不可逆損傷、關(guān)節(jié)液中炎性因子的表達(dá)等方面發(fā)揮作用，那么通過比較不同海水浸泡時(shí)間的差別，可以總結(jié)出致死率低、關(guān)節(jié)內(nèi)炎性改變明顯的兔膝關(guān)節(jié)海水浸泡傷模型。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海水浸泡6 h的動(dòng)物模型生存率相對較低，傷口周圍炎性反應(yīng)較其他各組明顯。這可能與關(guān)節(jié)內(nèi)和全身感染相關(guān)，全身性炎癥反應(yīng)致多器官功能障礙。盡管此組動(dòng)物模型能夠提供足夠嚴(yán)重的關(guān)節(jié)損傷，但造模過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損失較多，造模失敗率及經(jīng)濟(jì)損傷過大；相對而言，0.5 h、1 h和3 h組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有更高的存活率。

關(guān)節(jié)液中炎性因子的水平可以間接反映關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海水浸泡可以使損傷組織內(nèi)的炎性因子含量升高并參與組織繼發(fā)損傷，TNF-α、白介素-8(IL-8)、NO的含量在浸泡后3～36 h內(nèi)明顯較單純損傷高[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7 d，1 h、3 h和6 h組的兔膝關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α的水平均高于對照組，表明海水浸泡損傷是兔膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)較為敏感的致傷因素。同時(shí)，海水浸泡0.5 h和1 h的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中IL-1β水平明顯低于3 h和6 h組；海水浸泡1 h和3 h的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)液中TNF-α的水平明顯低于6 h組，說明海水浸泡時(shí)間會(huì)影響關(guān)節(jié)液中炎性因子的水平。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，1 h、3 h及6 h的海水浸泡時(shí)間均能夠造成兔海水浸泡傷模型膝關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)，浸泡時(shí)間越長，炎性因子水平升高越明顯。長時(shí)間的海水浸泡使關(guān)節(jié)組織內(nèi)的滲透壓改變，合并特殊致病菌感染等因素，發(fā)生一系列病理生理改變，大量炎性因子介入，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)不可逆的組織損傷[9]。

海水浸泡致膝關(guān)節(jié)損傷的作用機(jī)制十分復(fù)雜，本研究的造模過程未能納入關(guān)節(jié)損傷和海水浸泡傷的全部致傷因素，如低體溫、復(fù)合損傷、關(guān)節(jié)內(nèi)骨折等。這些因素能夠在不同程度上改變損傷的進(jìn)程，隨著研究的深入，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)逐步完善此動(dòng)物模型。

綜上所述，采用1 h、3 h及6 h海水浸泡兔膝關(guān)節(jié)的造模方法可以提高關(guān)節(jié)液中的炎性因子水平，但6 h海水浸泡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率較低，因而1 h和3 h的海水浸泡時(shí)間可以滿足兔膝關(guān)節(jié)海水浸泡損傷的造模需要，而3 h的浸泡時(shí)間更容易引發(fā)造模所需的炎癥反應(yīng)。該兔膝關(guān)節(jié)海水浸泡損傷模型可應(yīng)用于進(jìn)一步研究，在損傷分型、病理改變和早期救治等方面發(fā)揮作用。

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Establishment of a rabbit model of seawater immersion after knee injury.

LI Wen,ZENG Guo-qing,CHEN Ai-bao, YANG Xue-hong,MU Ji-hong.Department of Orthopedics,the 425thHospital of Chinese PLA,Sanya 572008,Hainan, CHINA

ObjectiveTo explore and construct a rabbit model of seawater immersion after knee injury. MethodsSixty rabbits of knee injury were randomly divided into five groups:control group,0.5 h group,1 h group, 3 h group and 6 h group.The control group was subjected to simple knee injury,and other groups received seawater immersion of different duration respectively.The wound and survival was observed.After 7 days,the content of interleukin-1 β(IL-1 β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the synovial fluid in each group was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsThe 7-d survival rate was 91.7%in 3 h group,75.0%in 6 h group,and 100.0%in other groups.The 14-d survival rate was 91.7%in 1 h group,83.3%in 3 h group,58.3%in 6 h group,and 100.0%in other groups.Seven days after treatment,the IL-1β levels of synovial fluid in 3 h group and 6 h group showed no statistically significant difference,which were(37.50±6.1)pg/mL and(38.40±5.1)pg/mL,but they were significantly higher than those in other groups.Seven days after treatment,the TNF-α content of synovial fluid in 1 h group and 3 h group,(297.48±35.7)pg/mLand(312.84±34.0)pg/mL respectively,were significantly higher than that in 0.5 h group and control group but lower than that in 6 h group(P＜0.05).ConclusionThe models of seawater immersion for 3 hours after knee injury have higher survival rate and more inflammatory reactions,which are recommended.

Knee;Seawater immersion;Animal model;Rabbits

R-332

A

1003—6350（2017）02—0183—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.004

2016-07-07)

海南省三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號：2014YW47）

穆繼宏。E-mail：mu.jihong@hotmail.com