劉 昊(LIU Hao)，徐修禮(XU Xiu-li)，張瑞雪(ZHANG Rui-xue)

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710032)

·綜述·

艱難梭菌感染實(shí)驗(yàn)室檢測方法進(jìn)展

劉 昊(LIU Hao)，徐修禮(XU Xiu-li)，張瑞雪(ZHANG Rui-xue)

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710032)

艱難梭菌； 艱難梭菌感染； 培養(yǎng)； 基因檢測； 分子生物學(xué)方法

艱難梭菌(Clostridiumdifficile,CD)是一種專性厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌，1935年首次在新生兒腸道正常菌群中被分離出來。1978年起人們發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌是引起抗生素相關(guān)性腹瀉、醫(yī)院性腹瀉及假膜性腸炎的主要病原體。有資料顯示，25%～30%的抗生素相關(guān)性腹瀉以及90%以上的假膜性腸炎均是由CD引起的，美國由艱難梭菌感染(Clostridium-difficileinfection,CDI)所致的病死率可達(dá)7.1%[1]。但是，不是所有的CD均會產(chǎn)生典型的臨床癥狀，CD致病主要是因?yàn)楫a(chǎn)生A、B兩種毒素。有研究認(rèn)為，毒素B對于CDI感染的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要[2]。因此，對于CDI的診斷應(yīng)當(dāng)基于毒素的檢測，而不僅僅是細(xì)菌的鑒定。

對產(chǎn)毒素CD的快速檢測是采取及時的感染控制措施和適當(dāng)治療的關(guān)鍵。2010年美國衛(wèi)生保健流行病學(xué)會(Society for Healthcare Epidemiology of America, SHEA)和美國感染病學(xué)會(Infectious Diseases Society of America,IDSA)發(fā)表了對于CDI患者的管理指南[3]，該指南對診斷方法進(jìn)行了說明，認(rèn)為只應(yīng)對腹瀉患者的糞便樣本進(jìn)行檢測，對無癥狀患者不應(yīng)進(jìn)行CD相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查與治療。其推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)、毒素A/B酶免疫分析法、細(xì)胞培養(yǎng)毒素中和試驗(yàn)、兩步法及核酸擴(kuò)增法等，其中核酸擴(kuò)增法具有廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)室檢查是艱難梭菌相關(guān)性腹瀉診斷、治療及預(yù)防控制過程中的重要依據(jù)。最常用的酶免疫分析法簡單、快速但缺乏靈敏性，而更敏感的毒素中和實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)費(fèi)時費(fèi)力無法滿足臨床要求。近年來，分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展，以XpertC.difficile、illumigeneC.Difficile、BD MAX C.diff等為代表的CD診斷新方法縮短了檢測周期，且靈敏度非常高，為CDI的診治提供了新的手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。為更好地了解CD感染實(shí)驗(yàn)室診斷，現(xiàn)就CD的檢測方法做一綜述。

1 細(xì)胞培養(yǎng)毒素中和試驗(yàn)(cell culture cytotoxicity neutralization assay, CCNA)

一直以來，CCNA被認(rèn)為是CDI實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，原理為直接檢測由毒素所致單層培養(yǎng)細(xì)胞的變性、壞死、凋亡等細(xì)胞病變效應(yīng)。由于其操作復(fù)雜，主觀性強(qiáng)，對實(shí)驗(yàn)環(huán)境及條件要求苛刻，難以標(biāo)準(zhǔn)化，且比較昂貴，故難以在臨床上推廣使用。且近年來隨著產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)及分子生物學(xué)方法的發(fā)展，其作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的地位受到了挑戰(zhàn)。研究[4-5]表明，與核酸擴(kuò)增法和產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)相比，CCNA的靈敏度較低，普遍低于90%。

2 產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)(toxigenic culture, TC)

近年來，隨著CDI發(fā)病率的不斷增高，高致病性的新菌株型別的產(chǎn)生迫使實(shí)驗(yàn)室再次關(guān)注發(fā)展細(xì)菌培養(yǎng)，以尋求新的檢測方法。傳統(tǒng)的CD培養(yǎng)是將糞便標(biāo)本直接接種于環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂(cycloserine-cefoxitin fructose agar，CCFA)[6]培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48 h。后來在此基礎(chǔ)上做了許多改進(jìn)，包括加入馬血、牛磺膽酸鹽和溶解酵素等以促進(jìn)孢子的萌發(fā)，提高靈敏度。另外，在培養(yǎng)之前將糞便用乙醇沖擊或加熱處理，殺滅其他細(xì)菌，有利于孢子富集。和直接接種相比，肉湯富集培養(yǎng)可提高敏感度約20%[7]。

另外，顯色培養(yǎng)基也被用于CD的培養(yǎng)及鑒定。BioMérieux先后開發(fā)了IDCd培養(yǎng)基，CLO培養(yǎng)基和chromIDC.diffile(CDIF)培養(yǎng)基[8]。Eckert等[9]比較了CCFA48 h、CLO48 h、CDIF 24 h與48 h 4種培養(yǎng)基的性能，以4種培養(yǎng)基混合培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，得出其靈敏度分別為70.4%、85.2%、74.1%和87%。而Carson等[8]從培養(yǎng)時間，是否進(jìn)行乙醇沖擊前處理等方面進(jìn)一步比較了CCFA與CDIF培養(yǎng)基的性能，發(fā)現(xiàn)對谷氨酸脫氫酶陽性的糞便樣本在CDIF上直接培養(yǎng)和經(jīng)乙醇沖擊前處理后培養(yǎng)的靈敏度和復(fù)蘇率一致，而在CCFA上經(jīng)乙醇沖擊前處理后培養(yǎng)比直接培養(yǎng)靈敏度和復(fù)蘇率高10%。在CDIF上培養(yǎng)24 h與48 h的結(jié)果比較，CCFA與CDIF上均培養(yǎng)48 h后的結(jié)果比較，差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義，由此進(jìn)一步說明了CDIF用于CD培養(yǎng)、鑒定和核糖體分型方面的優(yōu)勢。

由于只有產(chǎn)毒素的CD才具有致病性，因此，對于培養(yǎng)陽性并鑒定為CD的菌落還需進(jìn)行毒素檢測。產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)操作繁瑣且耗時較長，但其優(yōu)點(diǎn)為靈敏度高、可獲得菌株，分離菌可進(jìn)一步用于基因分型，獲知細(xì)菌傳播機(jī)制，是流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前，一般作為金標(biāo)準(zhǔn)用于新檢測方法的評估、臨床耐藥監(jiān)測以及評估新的治療方法，偶爾也可用于患者的管理。

3 酶免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測毒素

目前，國內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室均采用ELISA法檢測CD毒素A和B，該方法耗時短，成本低，特異性高，但因其敏感性較低而逐漸被認(rèn)為是次選方法。Planche等[10]對英國臨床實(shí)驗(yàn)室常用的6種ELISA試劑盒性能評價的文章進(jìn)行系統(tǒng)綜述，最終發(fā)現(xiàn)各種試劑盒的診斷性能指標(biāo)間存在差異，認(rèn)為可能與各方法選擇的cut off值不同有關(guān)。按照文章中作者提出的將靈敏度90%和假陽性率低于3%作為可接受的標(biāo)準(zhǔn)，6種檢測試劑盒均不能滿足該標(biāo)準(zhǔn)，由此作者得出結(jié)論，ELISA檢測毒素不能單獨(dú)作為CDI的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

Eastwood等[11]采用6種ELISA檢測600例腹瀉患者的糞便樣本，并進(jìn)行3種橫向分析，以產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，得出靈敏度在60%～81%之間，特異度在91%～99.4%之間。同樣無一種方法的結(jié)果滿足Planche等[10]提出的標(biāo)準(zhǔn)，另外，文章也提到不一致的檢測結(jié)果不能通過重復(fù)試驗(yàn)糾正，由此提出，若需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，建議選擇另外一種檢測方法。其他研究[12]同樣提出了重復(fù)檢測的限制性。

4 谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)

GDH為CD表面大量表達(dá)的抗原性酶蛋白，產(chǎn)生數(shù)量高于毒素且具有較強(qiáng)穩(wěn)定性，可作為糞便中CD存在的標(biāo)志物。檢測GDH抗原具有非常高的敏感性和陰性預(yù)測值，早期研究[13]報道，該方法的靈敏度高于90%，陰性預(yù)測值可達(dá)99%，可作為GDH檢測的首選篩查方法。然而，最近研究[14]發(fā)現(xiàn)，對于非流行性BI/NAP1/027菌株，GDH的檢測靈敏度可能僅69%左右。另外，由于產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒CD以及梭菌屬其他種類細(xì)菌均可產(chǎn)生此酶，GDH檢測缺少特異性，故不能單獨(dú)作為快速診斷CD的首選方法，而通常將其作為兩步法或三步法的初篩實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于臨床。

TheC.DiffQUIK Chek Complete Assay (TechLab, Blacksburg，VA, USA)[15]將GDH抗原檢測和毒素A&B檢測結(jié)合起來，能夠在30 min左右獲得結(jié)果。Kim等[16]評價該方法，陰性預(yù)測值達(dá)98.5%，GDH檢測部分的靈敏度是91%，而毒素檢測部分的靈敏度較低(61%～78%)。因此，實(shí)驗(yàn)室可能需要另一種更敏感的方法檢測GDH陽性而毒素陰性的情況，分子生物學(xué)無疑是最好的選擇。

5 核酸擴(kuò)增法(nucleic acid amplification test, NAAT)

CD毒素A和毒素B分別由tcdA和tcdB基因編碼，而其表達(dá)被認(rèn)為是由tcdC基因下調(diào)或缺陷引起的?；驒z測可預(yù)測產(chǎn)毒性CD的存在，及其產(chǎn)毒能力的強(qiáng)弱。目前，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法主要應(yīng)用于實(shí)時熒光定量PCR，RT-PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等檢測糞便標(biāo)本中的產(chǎn)毒素CD，上述方法的敏感性高，特異性強(qiáng)，更方便、快速，但價格昂貴，并且由于其敏感性高，一些無癥狀攜帶者在檢測中也可能為陽性。Deshpande等[17]對1995—2010年發(fā)表的以CCNA或TC為金標(biāo)準(zhǔn)評價實(shí)時PCR檢測性能的文章(其中19篇符合標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行meta分析。PCR的合并靈敏度為90%，特異度為96%。診斷方法的準(zhǔn)確度與CD的流行率有關(guān)，在CD流行率分別為<10%，10%～20%和>20%時，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為71%、79%，93%、99%，98%、96%，因此，可認(rèn)為實(shí)時PCR對于CDI的診斷具有較高的靈敏度和特異度。

截至目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)了9種CD分子檢測平臺[18]，包括BD GeneOhm、BD Max、ProDesse ProGastro Cd Assay、Cepheid GeneXpertC.difficileAssay、Meridian Illumigene、Focus Technologies Simplexa、Great Basin Portrait Analyzer、Quidel AmpliVueC.difficileAssay、Nanosphere Verigene，其中Meridian Illumigene和Quidel AmpliVueC.difficileAssay檢測的是毒素A基因，其他均檢測的是毒素B基因。另外，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的上述檢測平臺中僅Meridian Illumigene采用的是環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)。各檢測方法的性能比較見表1。

表1 FDA批準(zhǔn)的9種NAATs檢測試劑盒的性能比較[18]

BD-GeneOhmTM C.diff是第一個被FDA批準(zhǔn)的分子檢測方法，是一個基于實(shí)時PCR檢測CD毒素B基因的平臺。該方法采用專用珠子溶菌手工提取DNA后，在Cepheid Smart Cycler上進(jìn)行擴(kuò)增，其檢測結(jié)果約在2 h后給出[19]。根據(jù)參比方法的不同其靈敏度為84%～96%，特異度為94%～99%。

Cepheid GeneXpertC.difficileAssay需要在其專門的儀器GeneXpert中完成檢測，該診斷方法采用全自動實(shí)時熒光定量PCR原理，將樣品處理、核酸擴(kuò)增、目標(biāo)序列的實(shí)時檢測整合于一體，能在50 min內(nèi)檢測患者糞便中CD產(chǎn)生的毒素B，甚至二元毒素，提供流行病學(xué)信息，有助于患者的早期治療及感染預(yù)防控制。Bababy等[20]對一所腫瘤醫(yī)院的560份糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，將該方法與兩步法(用酶免疫法檢測GDH作為初篩，陽性標(biāo)本再用毒素中和試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí))進(jìn)行比較，該研究分兩個階段，第一階段僅對GDH陽性標(biāo)本同時用Xpert PCR和CCNA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，結(jié)果不一致者再行糞便培養(yǎng)和細(xì)胞毒性檢測進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果GDH-Xpert PCR和GDH-CCNA的一致率為72%，其敏感度和特異度分別為100%和97%，57%和97%。第二階段則分別用Xpert PCR和GDH-CCNA檢測，一致率為95%。另外，對其中45份Xpert PCR檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行基因分型，并與PCR-核糖體分型、基因測序進(jìn)行比較，一致性可達(dá)90%以上。由此可見，Xpert PCR檢測CDI具有較高的敏感度和特異度，加之其基因分型能力，檢測快速、方便，極大地滿足了臨床需求。

Viala等[21]評價3種檢測糞便中CD毒素基因的分子診斷試劑盒性能，以TC作為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測當(dāng)?shù)匾凰t(yī)院的89份糞便標(biāo)本，最終得出，BD GeneOhmC.diff、XpertC.Difficile和illumigeneC.diff3種方法的靈敏度分別為95.5%、97.8%和86.7%，特異度分別為97.9%、97.9%和100%，準(zhǔn)確度分別為96.8%、97.9%和93.6%。XpertC.Difficile和illumigeneC.Difficile僅需1 h便可完成檢測，而BD GeneOhmC.diff需花費(fèi)2～3 h，綜合來看，XpertC.diff性能更佳，應(yīng)用于臨床優(yōu)勢更明顯。

2012年Le等[22]提出一種新的全自動實(shí)時PCR檢測CD毒素B基因的方法—BD MAXC.diff(Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。它與XpertC.difficile操作基本相同，取約10 μL糞便至BD MAX樣品緩沖管中，震蕩混勻后放入BD MAX儀器中，DNA提取(50～90 min，取決于樣本中可提取DNA的量)和實(shí)時PCR過程(30 min)均通過儀器自動完成。Le等[22]檢測360例腹瀉患者的糞便樣本，以TC為金標(biāo)準(zhǔn)，得出BD MAX C.diff的靈敏度和特異度分別為97.73%、99.68%。以TC為金標(biāo)準(zhǔn)，比較Cepheid GeneXpert、BD MAX 2種全自動CD分子診斷方法[23]，其靈敏度和特異度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩者具有全封閉系統(tǒng)、全自動操作、污染可能性小、人為錯誤少、結(jié)果精確度高、檢測時間短等優(yōu)點(diǎn)，因此，均可作為全自動快速分子診斷方法應(yīng)用于CDI診斷。但XpertC.diff一次性可同時檢測的樣本量取決于GeneXpert儀器的大小規(guī)格，與GeneXpert相比，BD MAX儀器最大的優(yōu)勢在于在相同的PCR平臺上，可同時進(jìn)行24個樣本的檢測[23]。

上述幾種NAATs檢測方法雖然基本原理、操作過程及花費(fèi)時間等有所區(qū)別，但檢測的靈敏度和特異度均非常高，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但目前尚無文獻(xiàn)對新的檢測方法做系統(tǒng)綜述。值得肯定的是，分子生物學(xué)方法與產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)的結(jié)果一致性高，且優(yōu)于CCNA，ELISA和兩步法。但需要指出的是，該種方法檢測CD毒素基因，對無癥狀攜帶者CDI的診斷可能會存在問題。文獻(xiàn)[24]報道，分子生物學(xué)方法的使用可能會使CDI的發(fā)病率增高50%以上，此外，上述幾種FDA批準(zhǔn)的分子檢測方法可能對實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件及工作人員有較高的專業(yè)要求。盡管如此，該方法仍是目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的方法。

綜上所述，產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)作為CDI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其在流行病學(xué)調(diào)查、耐藥監(jiān)測及方法評估等方面的作用是無法替代的，但因該方法自身的局限性尚不能很好的滿足臨床需要?；贕DH檢測的兩步法或三步法優(yōu)于ELISA檢測毒素，可應(yīng)用于臨床。而分子生物學(xué)方法無疑是當(dāng)前較好的CDI檢測方法，可與GDH檢測聯(lián)用也可單獨(dú)用于CD毒素的檢測，但其檢測性能及成本效益還需進(jìn)一步研究。因此，在現(xiàn)有CD診斷方法尚存缺陷的今天，各種方法取長補(bǔ)短，互相補(bǔ)充，可以為CD相關(guān)性腹瀉的診治提供有力依據(jù)。

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(本文編輯：曾翠)

Advances in laboratory testing forClostridiumdifficileinfection

(Institute of Clinical Laboratory Medicine, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

2016-06-18

劉昊(1989-),男(漢族)，陜西省西安市人，檢驗(yàn)技師，主要從事感染性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷。

徐修禮 E-mail：xxlxxl@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.022

R378.8

A

1671-9638(2017)01-0089-05