姜文燦，岳素文，何賞，陳琛，孫慧珍，江洪，王成彬

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院臨檢科，北京 100853；2.北京泰格瑞分子檢驗(yàn)有限公司，北京 100085；3.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325000 )

·專題筆談·

實(shí)時(shí)熒光定量PCR非特異性分析*

姜文燦1,3，岳素文2，何賞1，陳琛1，孫慧珍1，江洪2，王成彬1,3

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院臨檢科，北京 100853；2.北京泰格瑞分子檢驗(yàn)有限公司，北京 100085；3.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325000 )

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)因靈敏度高、操作簡(jiǎn)便在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而，伴隨其高靈敏度存在的非特異性問(wèn)題在一定程度上限制了其應(yīng)用。不同于普通檢測(cè)方法，該技術(shù)的非特異性問(wèn)題主要由可以指數(shù)擴(kuò)增的引物二聚體(primer dimer, PD)引起。對(duì)此，引物設(shè)計(jì)時(shí)使用的中部同序引物對(duì)可以從根本上避免PD的產(chǎn)生，從而解決由其引起的非特異性問(wèn)題。該文從PCR的發(fā)展和本質(zhì)、PCR非特異性產(chǎn)生的原因和應(yīng)對(duì)策略等方面作一總結(jié)及分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；非特異性；引物二聚體

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是在體外模擬體內(nèi)核酸復(fù)制過(guò)程從而達(dá)到快速核酸檢測(cè)目的的一門核心技術(shù)，相比于一般信號(hào)疊加的檢測(cè)方法，其具有指數(shù)放大的模式使靈敏度提升了上百萬(wàn)倍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上加入信號(hào)系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，繼承了傳統(tǒng)PCR靈敏度高和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣本的定量檢測(cè)，并進(jìn)一步提升了PCR技術(shù)的靈敏度。該技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。然而，在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，其難以克服的非特異性問(wèn)題在一定程度上限制了該技術(shù)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用。因此，本文從PCR的發(fā)展、非特異性問(wèn)題產(chǎn)生的原因及解決非特異性問(wèn)題進(jìn)行討論，并以常用的探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR作為對(duì)象進(jìn)行分析。

1 PCR技術(shù)的發(fā)展和本質(zhì)

PCR非特異性問(wèn)題與其發(fā)展歷史和PCR的本質(zhì)密不可分。1953年Watson建立的DNA雙螺旋模型及半保留復(fù)制法則奠定了PCR擴(kuò)增的分子基礎(chǔ)；1971年Khorana等[4]發(fā)表了1篇核酸體外擴(kuò)增相關(guān)論文；1985年，Wittwer等[5]根據(jù)指數(shù)擴(kuò)增或幾何級(jí)數(shù)式放大的能力，發(fā)明了由一對(duì)特異引物結(jié)合、復(fù)制靶分子基因，體外(于試管內(nèi))模擬天然基因半保留復(fù)制的PCR擴(kuò)增技術(shù)。然而，因同樣起始量的樣本經(jīng)PCR級(jí)聯(lián)放大以后變化太大而產(chǎn)量不均一，致使常規(guī)終末PCR難以定量檢測(cè)。1997年，采用動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)與靶初始量成反比(反對(duì)數(shù)關(guān)系)的封閉熒光定量PCR技術(shù)誕生。根據(jù)發(fā)光原理的不同，該技術(shù)主要分為熒光染料法PCR和各種熒光核酸探針PCR兩大類[6]。

靶分子數(shù)量以2n級(jí)數(shù)激增，是PCR最核心的本質(zhì)。常規(guī)PCR通常進(jìn)行30個(gè)熱循環(huán)，而230約等于109，靶模板以如此高的擴(kuò)增速度擴(kuò)增是一般線性放大檢測(cè)方法無(wú)可比擬的，其靈敏度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通的檢測(cè)方法?，F(xiàn)階段使用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通常反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)飛克級(jí)(10-15g)水平或數(shù)個(gè)分子。這也是PCR成為應(yīng)用最廣、最核心技術(shù)的根本原因。此外，其指數(shù)放大亦伴隨PCR高度的特異性，PCR特異性直接由引物的特異性決定，引物一端的非特異錯(cuò)配擴(kuò)增甚至完全配對(duì)擴(kuò)增也僅是線性增大，自然遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上指數(shù)擴(kuò)增或幾何級(jí)數(shù)放大。另外，引物特異性少量的降低或與靶序列微弱的不匹配雖然也會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增速率的下降，但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上特異的指數(shù)或幾何級(jí)數(shù)放大，換而言之，靶模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增或幾何級(jí)數(shù)放大即可保證PCR擴(kuò)增檢測(cè)的高特異性。除此之外，PCR的熔解曲線也具有極高的特異性，靶擴(kuò)增產(chǎn)物顯示典型狹窄變性溫度，即特定Tm值。探針?lè)≒CR通過(guò)增加一條結(jié)合探針使特異性更有保證，但在多數(shù)情況下普通PCR的特異性已經(jīng)足夠，因此PCR非特異性也主要由指數(shù)放大或幾何放大這一本質(zhì)決定。

2 PCR非特異性產(chǎn)生的原因

2.1 引物模板非特異性結(jié)合 超靈敏且呈幾何級(jí)數(shù)放大的PCR技術(shù)在帶來(lái)高靈敏度檢測(cè)的同時(shí)也帶來(lái)難以克服的非特異障礙，如引物在低溫條件下非特異性結(jié)合模板所導(dǎo)致的非特異擴(kuò)增等。然而，一方面，Taq酶在低于40 ℃時(shí)的環(huán)境中活性很低，不足以引起PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；另一方面，PCR反應(yīng)中僅一條引物與其他模板結(jié)合引起的非特異線性擴(kuò)增為線性擴(kuò)增，不能與靶模板的特異性指數(shù)擴(kuò)增相比。故而低溫啟動(dòng)不是非特異性出現(xiàn)的關(guān)鍵原因。

2.2 引物二聚體(primer dimer, PD) PD是由引物間互為模板、互為引物所形成的，其指數(shù)擴(kuò)增是引起PCR非特異性的根本原因，也是PCR反應(yīng)非特異性難以克服的根本原因。一般3′末端數(shù)個(gè)堿基連續(xù)反向互補(bǔ)的引物，在不加模板的本底染料法PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，約在幾個(gè)至十幾個(gè)循環(huán)處即出現(xiàn)可見的PD擴(kuò)增；一對(duì)常規(guī)設(shè)計(jì)的引物本底PCR反應(yīng)的Ct值在30左右(這也是普通PCR只進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)的主要原因)。染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的嵌合染料可結(jié)合任何雙鏈產(chǎn)物，而反應(yīng)體系中PD在經(jīng)過(guò)30個(gè)熱循環(huán)之后出現(xiàn)明顯的指數(shù)擴(kuò)增，因此PD的Ct值多在30左右，從而致使Ct值在30～38之間的低濃度靶分子無(wú)法區(qū)分是PD還是擴(kuò)增產(chǎn)物(檢測(cè)時(shí)Ct值均顯示為30)。探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR中靶特異探針雖可繞開PD引起的假陽(yáng)性，但高濃度的PD可與靶模板競(jìng)爭(zhēng)靶引物，抑制了引物同低濃度靶模板的結(jié)合，從而限制了其檢測(cè)的靈敏度。

2.3 汽霧膠污染 熒光定量PCR進(jìn)程中，除螺旋蓋毛細(xì)管外，所謂的“閉管分析”多數(shù)情況下并不完全密閉，大多數(shù)0.2 mL PCR試管或96孔板，在熱循環(huán)95 ℃變性時(shí)，高溫高壓下就會(huì)有一些氣霧膠溢(擠)出管蓋。氣霧膠不僅含高濃度已擴(kuò)增的陽(yáng)性靶分子，更多的是一對(duì)過(guò)量引物間產(chǎn)生的小分子PD或引物-探針聚合體, 且每一個(gè)檢測(cè)反應(yīng)管/孔都會(huì)產(chǎn)生PD非特異性指數(shù)擴(kuò)增。隨著重復(fù)，泄漏的污染物會(huì)反復(fù)地進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增、積聚，隨后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR不是從第1個(gè)循環(huán)開始而是從上次PCR結(jié)束循環(huán)數(shù)開始，由此PCR污染物越來(lái)越嚴(yán)重。

除上述情況外，常規(guī)PCR檢測(cè)中也會(huì)出現(xiàn)由于其他原因所造成的非特異性擴(kuò)增，但均為非指數(shù)擴(kuò)增，因此，只有一對(duì)引物均為非特異結(jié)合、延伸的擴(kuò)增才能引起非特異性指數(shù)的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的非特異性包括內(nèi)生PD和外源氣霧膠兩個(gè)方面，二者也會(huì)相互影響，內(nèi)生PD非特異性之源不消除就難以判斷氣霧膠控制效果；反之外源氣霧膠不控制就難以消除內(nèi)源PD引起的PCR非特異性。

3 解決PCR非特異性的策略

3.1 引物設(shè)計(jì) 在PCR體系穩(wěn)定的情況下，真正決定模板能否實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的關(guān)鍵程序?yàn)橐镌O(shè)計(jì)。同樣，克服PCR非特異性的首要方法應(yīng)從引物設(shè)計(jì)入手。引物引起的指數(shù)非特異性主要源于其堿基序列，一對(duì)完全同序的引物絕對(duì)沒有引物非特異性。相同標(biāo)簽輔助-無(wú)引物二聚體(homo-tag assisted non-dimer, HAND)技術(shù)采用完全同序引物標(biāo)簽，通過(guò)引物二聚體單鏈5′端自身結(jié)合形成二級(jí)機(jī)構(gòu)，抑制其與游離引物的結(jié)合,但該方法不僅顯著抑制PD的擴(kuò)增,也沒有選擇性地減低了靶模板特異性擴(kuò)增效率[7]。與此不同，另有學(xué)者根據(jù)一對(duì)完全同序引物絕沒有非特異性的現(xiàn)象，采用部分同序引物抑制PD的擴(kuò)增，將“同序”置于引物中部偏3′端，能最大化地選擇性抑制PD擴(kuò)增而不影響靶擴(kuò)增效率[8]；PCR體系中添加與引物中部同序部位配對(duì)結(jié)合的含反義堿基的Oligo，反義堿基的存在使其不能作為模板和非特異性延伸的起點(diǎn)，能進(jìn)一步特異性地選擇放大對(duì)PD抑制的作用。在無(wú)3′末端反向互補(bǔ)常規(guī)引物設(shè)計(jì)原則基礎(chǔ)上，選擇中部6～8個(gè)堿基同序引物對(duì)和結(jié)合中部8～10個(gè)反義堿基Oligo在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的40個(gè)循環(huán)反應(yīng)內(nèi)，沒有PD非特異性擴(kuò)增的干擾。配合礦物油封閉下的PCR成份緩釋策略，將徹底杜絕PD非特異性，通常選擇一端引物溶于高比重粘糖溶液并預(yù)先加入PCR管底部，再小心加入PCR其他成份反應(yīng)液及封閉油并保持一段時(shí)間分層，待PCR熱變性自動(dòng)混勻熱啟動(dòng)；加礦物油封閉不影響熒光光路但要避免熱蓋下的油面上濺起的PCR反應(yīng)液出現(xiàn)熱循環(huán)擴(kuò)增及泄露，若出現(xiàn)反應(yīng)液泄露，也可由于缺少一端引物而成為無(wú)效的擴(kuò)增及泄露。

3.2 反應(yīng)體系優(yōu)化及技術(shù)改進(jìn) 目前，各種控制非特異的措施如變化PCR組分、添加各種化學(xué)試劑等均得到一定程度的應(yīng)用。例如單鏈結(jié)合蛋白(single strand binding-protein,SSB)、基因32蛋白和引物結(jié)合反義堿基Oligo的使用，但其對(duì)特異與非特異擴(kuò)增基本是平行的，顯著抑制PCR非特異性的同時(shí)也不同程度地干擾了靶特異性擴(kuò)增效率。此外，對(duì)反應(yīng)體系使用熱啟動(dòng)的策略也可以在一定程度上減輕非特異性問(wèn)題，具體措施包括：蠟包中Mg2+離子熱釋放、聚合酶Taq修飾抑制(包括端N缺失的KlenTaq, 抗Taq酶抗體和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar，以及四氧化戊烷熱激活引物)等[9-11]。但多數(shù)低溫?zé)釂?dòng)作用有限，僅可以將非特異性擴(kuò)增推后1～2個(gè)循環(huán)，并不能解決后續(xù)的非特異性產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增。而傳統(tǒng)使用的PCR預(yù)變性后手工加入PCR反應(yīng)組分的絕對(duì)熱啟動(dòng)策略對(duì)非特異性出現(xiàn)的本底Ct值也僅推后1～3個(gè)循環(huán)。

3.3 其他 為了控制產(chǎn)物氣霧膠污染，現(xiàn)在采用的策略還包括過(guò)濾系統(tǒng)、產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice，GMP)車間、P3/P4實(shí)驗(yàn)室，然而擴(kuò)增產(chǎn)物氣霧膠再污染僅靠過(guò)濾系統(tǒng)、GMP車間、P3/P4實(shí)驗(yàn)室是隔絕不了的。對(duì)于氣霧膠再污染，可采用dUTP代替dTTP產(chǎn)物再結(jié)合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG)降解絕大部分?jǐn)U增產(chǎn)物的策略，但該方法對(duì)反應(yīng)過(guò)程中新產(chǎn)生的PD作用有限。

不設(shè)置熱蓋的PCR儀器熒光光路必須均位于管底橫向讀取熒光，否則油面上的濺起液冷凝至管蓋會(huì)遮擋熒光。獨(dú)立設(shè)置的擴(kuò)增室或物理隔絕的PCR儀器是防止外源氣霧膠再污染的最可靠策略。

4 熒光探針PCR非特異性

以最常用的TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR為例，體系中引入一靶特異熒光標(biāo)記探針，一方面靶探針不針對(duì)引物序列而不會(huì)結(jié)合PD非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，增加了一定的特異性。但PD的擴(kuò)增在探針?lè)≒CR中不可見并不代表其不存在或不起作用，同引物雙重PCR相互間嚴(yán)重干擾、抑制；在共同引物的雙靶分子擴(kuò)增條件下，濃度降低10倍的靶模板的擴(kuò)增會(huì)被高濃度靶分子徹底抑制；本底Ct值為30的PD擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)性抑制低一個(gè)數(shù)量級(jí)的低濃度靶分子擴(kuò)增，PD非特異性降低了PCR系統(tǒng)靈敏度，低濃度樣本結(jié)果產(chǎn)生假陰性反應(yīng)[12-13]。采用中部同序引物推后本底Ct值也有助于提升探針?lè)≒CR的靈敏度。

另一方面，過(guò)量引物與探針之間也產(chǎn)生一定程度的非特異聚合、延伸的擴(kuò)增，不加靶模板的PCR本底系統(tǒng)，一對(duì)引物與熒光標(biāo)記TaqMan探針可產(chǎn)生Ct值為33～35的非特異性擴(kuò)增曲線，且隨著反復(fù)的重復(fù)同一PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增平臺(tái)期熒光吸收峰值越來(lái)越高， Ct值也逐漸前移，產(chǎn)生一定的假陽(yáng)性。探針自身兩兩結(jié)合的解鏈?zhǔn)絋aqMan/水解探針(中國(guó)專利CN201510961208.4)一定程度有助于降低探針?lè)≒CR本底擴(kuò)增[14]。

由于一些如血液、泥土等樣本及提取時(shí)殘留的PCR抑制成分干擾或抑制PCR樣本檢測(cè)而產(chǎn)生假陰性反應(yīng)。從2000年開始逐步出現(xiàn)不同熒光波長(zhǎng)的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增的探針?lè)≒CR報(bào)道，如通過(guò)內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增監(jiān)測(cè)PCR抑制劑成分所造成的假陰性[15]；到2010年采用管家基因等不同靶序列的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增探針?lè)≒CR成為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)程序。然而，不同序列的雙引物雙重PCR也存在一定相互干擾、抑制，低濃度的靶擴(kuò)增逐漸被高濃度的靶分子所抑制，不同引物的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增非競(jìng)爭(zhēng)性抑制更低濃度靶分子擴(kuò)增和引物—探針間聚合的非特異本底擴(kuò)增[16]。結(jié)果客觀上使所有陰性樣本全部陰性反應(yīng)，商業(yè)探針?lè)≒CR試劑盒表面上看靈敏度高且沒有假陽(yáng)性，而其本質(zhì)為內(nèi)標(biāo)基因的存在抑制了引物—探針聚合產(chǎn)生的非特異性。過(guò)量的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增反而增加了系統(tǒng)假陰性，內(nèi)標(biāo)的用量也尚無(wú)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

內(nèi)標(biāo)增加了系統(tǒng)復(fù)雜性。內(nèi)標(biāo)引物與靶引物更加容易形成PD及多聚合擴(kuò)增，非特異性本底Ct值(約為30)進(jìn)一步前移，使PCR系統(tǒng)靈敏度進(jìn)一步降低，反而提高了系統(tǒng)假陰性程度，然而，內(nèi)標(biāo)用以監(jiān)測(cè)PCR抑制所導(dǎo)致的假陰性出現(xiàn)，卻增加了假陰性。但降低PD非特異性的中部同序優(yōu)化引物和調(diào)整本底至Ct值近30時(shí)的對(duì)照內(nèi)標(biāo)仍有一定的應(yīng)用效果。樣本中抑制劑的監(jiān)測(cè)可通過(guò)樣本添加模板質(zhì)粒、染料法PCR熔解曲線分析，或者調(diào)整PCR反應(yīng)基線來(lái)監(jiān)測(cè)，能上下波動(dòng)的擴(kuò)增基線顯示PCR沒有抑制。

5 展望

PCR技術(shù)自推出以來(lái)得到了飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，顯示了其強(qiáng)大的生命力和發(fā)展?jié)摿ΑＳ捎谄潇`敏、特異、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為分子檢測(cè)的核心技術(shù)之一，隨著該技術(shù)的普及，免疫結(jié)合PCR的分子診斷技術(shù)將得到推廣。如今，大批科研工作者基于核酸擴(kuò)增原理對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行了不斷深入的研究和改良，使其特性得到了進(jìn)一步的完善，并推出來(lái)其他核酸擴(kuò)增技術(shù)。隨著科技的發(fā)展，檢測(cè)更準(zhǔn)確、更迅速的PCR擴(kuò)增儀將不斷被推出，聯(lián)合不斷革新的軟件分析技術(shù)，該技術(shù)將得到進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.14

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2012YQ03026107)。

姜文燦，1992年生，男，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)研究。

王成彬，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail: wangcbin301@163.com；江洪，博士，E-mail: tagarray@163.com。

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2017-02-07)