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        高糖條件下鋅對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分泌VEGF的影響

        2017-03-04 02:53:13陳艷艷李愛朋侯璐璐盧伯洋
        中國實驗診斷學(xué) 2017年2期
        關(guān)鍵詞:糖尿病水平

        陳艷艷,楊 威,李愛朋,侯璐璐,盧伯洋,董 宇

        (吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼二科,吉林 長春130021)

        *通訊作者

        高糖條件下鋅對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分泌VEGF的影響

        陳艷艷,楊 威,李愛朋,侯璐璐,盧伯洋,董 宇*

        (吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼二科,吉林 長春130021)

        糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,糖尿病患者視網(wǎng)膜缺血缺氧,導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)代償性增加,促進(jìn)了視網(wǎng)膜新生血管的形成。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜分泌VEGF的主要細(xì)胞,在糖尿病患者早期即會產(chǎn)生一系列病理生理的改變,從而導(dǎo)致VEGF的表達(dá)增加,在DR的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。鋅本身在抗氧化和抑制糖尿病所致的視網(wǎng)膜損傷上具有多方面生理作用,而糖尿病患者血清鋅水平與血糖呈顯著負(fù)相關(guān),本實驗擬通過體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞,觀察補(bǔ)鋅能否抑制體外培養(yǎng)的Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)的增加。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        DAB顯色劑(武漢博士德公司)、H-DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL Co.)、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(蘭州民海公司 )、兔抗鼠VEGF 多克隆抗體(武漢博士德公司)、免疫組織化學(xué)SP試劑盒(武漢博士德公司)、 TritonX-10(Promega 公司)、胰蛋白酶 (Hylclone Co)。

        1.2 Müller 細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

        將出生后3-5天大乳鼠(雌雄不限)(吉林大學(xué)動物中心提供),用75%酒精浸泡麻醉后,無菌操作取出眼球,PBS液沖洗3遍,沿角膜緣旁約1 mm處環(huán)行剖開眼球,去除晶狀體和玻璃體,留后半眼球壁置于DMEM培養(yǎng)液中輕輕剝離視網(wǎng)膜,去除富含血管及髓放線后將視網(wǎng)膜剪碎成約1 mm×1 mm小片組織。吸取組織塊置于培養(yǎng)瓶中,加足量含20%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于5%CO2,37℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。約7天后,細(xì)胞從組織塊周邊爬出并達(dá)到80%以上融合,此時進(jìn)行消化傳代:將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液吸出,加入0.1 mol/L PBS輕輕沖洗殘余培養(yǎng)液2次,小心吸出后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶37℃下消化,顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞周邊剛剛回縮即停止,加入等量含血清的DMEM培養(yǎng)液,用吸管吹打后吸入離心管中離心800 r/min×5 min,棄上清液,加入培養(yǎng)液重懸沉淀,1∶2-1∶3移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),第2代細(xì)胞供實驗用。

        1.3 Müller細(xì)胞的鑒定

        視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞的免疫組化染色按試劑盒說明書操作。結(jié)果判定:以在細(xì)胞的胞膜、胞漿或胞核部位出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽性,陽性細(xì)胞在蓋片上分布須均勻一致。

        1.4 實驗分組

        將2代培養(yǎng)細(xì)胞分為4組。正常組(N):5 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液;高糖組(G):25 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液;正常加鋅組(N+Z):本組僅加5.0 μmol/L ZnSO4。高糖加鋅組(G+Z): 分別加入2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L ZnSO4。各組加入條件液后繼續(xù)培養(yǎng)6天。

        1.5 結(jié)果判定

        采用Imagepro-Plus軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用計算機(jī)圖像處理技術(shù)測定染色細(xì)胞累積光密度(IOD)。每張片子取五個視野,每個視野選定10個左右細(xì)胞測定灰度值。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

        2 結(jié)果

        高糖組前5天Müller細(xì)胞VEGF水平高于高糖加鋅組,到第6天高糖組Müller細(xì)胞VEGF水平接近甚至低于高糖加鋅組;高糖組與正常組相比,前5天Müller細(xì)胞VEGF水平顯著升高,第6天基本降至正常,Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)在第四天達(dá)高峰,高糖組與高糖加鋅組比較,Müller細(xì)胞VEGF水平顯著增高,并具有顯著性差異(P<0.01),高糖組與正常組比較Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)水平顯著增高,具有顯著性差異(P<0.01);正常加鋅組、正常組與高糖加鋅組比較Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

        表1 各組Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)灰度值結(jié)果

        與正常組比較,*P<0.01,與高糖組比較,△P<0.01

        3 討論

        糖尿病是一個糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)的發(fā)生是由于糖尿病所造成的缺血缺氧的體內(nèi)環(huán)境,致使氧化應(yīng)激增加,氧自由基增多,氧化產(chǎn)物堆積,損傷了視網(wǎng)膜組織,造成微血管病變并導(dǎo)致血管閉塞,進(jìn)而導(dǎo)致促血管生成因子和抑制因子的失衡,造成新生血管的形成.而新生血管生成因子中以VEGF研究頻率最高,VEGF能特異作用于視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞,可能是最直接的眼內(nèi)新生血管形成因子。正常條件下表達(dá) VEGF 的細(xì)胞有多種細(xì)胞,包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Müller細(xì)胞、周細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等,糖尿病時Müller 細(xì)胞VEGF分泌增加,在DR發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[1],本實驗便是從Müller細(xì)胞著手,尋找抑制Müller細(xì)胞分泌VEGF的有效途徑和方法。

        本實驗中采用25 mmol/L的高糖濃度體外培養(yǎng)Müller細(xì)胞,可以模擬糖尿病時體內(nèi)高血糖狀態(tài)[2],正常條件下各時相Müller細(xì)胞VEGF的表達(dá)一直處于低且平穩(wěn)的水平,上下起伏波動不明顯,而高糖條件下1天、2天、3天、4天Müller細(xì)胞VEGF明顯隨著時間延長表達(dá)顯著增加,第5天開始下降,但仍明顯高于正常對照組,第6天降至接近甚至低于正常水平,說明了正常條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞VEGF穩(wěn)定低表達(dá),而高糖條件可以誘導(dǎo)Müller細(xì)胞VEGF的表達(dá)增加,且第1到第4天表現(xiàn)出明顯的時間依賴性,隨時間延長表達(dá)亦顯著增加,直到第5天、第6天細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變,功能下降,部分細(xì)胞失去表達(dá)VEGF的功能,導(dǎo)致VEGF逐漸下降到等同甚或低于正常條件組細(xì)胞VEGF表達(dá)量,此時的細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)衰老達(dá)不到正常細(xì)胞的狀態(tài),在本實驗中,高糖組及高糖加鋅組至第6天時VEGF表達(dá)反而下降,可能與此有關(guān)。實驗中發(fā)現(xiàn)在高糖條件下,隨時間延長,VEGF表達(dá)增加的現(xiàn)象,與臨床上我們看到的隨糖尿病病程越長,發(fā)生DR的可能性亦逐漸增加相一致。

        目前國外大量體內(nèi)、外研究均證實,鋅在1型和2型糖尿病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,在T2D患者,隨著血清鋅水平的下降,糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)病率的增加,補(bǔ)鋅可以改善血糖控制、降低糖尿病微血管病的發(fā)生率[3-6]。Moustafa研究表明鋅可以防止糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激過程并控制高血糖[7]。但是鋅缺乏作為糖尿病微血管并發(fā)癥的病因的證據(jù)還有待于更多的臨床研究證實[8]。本實驗通過體外高糖條件下培養(yǎng)的Müller細(xì)胞加鋅,研究補(bǔ)鋅對高糖情況下Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響,我們發(fā)現(xiàn)加鋅對高糖條件下培養(yǎng)的Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)有明顯抑制作用,與國外研究結(jié)果相一致。高糖加鋅組同正常組及正常加鋅組比較無差異性(P>0.05),而高糖加鋅組和高糖組細(xì)胞比較其VEGF表達(dá)水平具有顯著性差異(P<0.01),說明鋅對高糖條件下Müller細(xì)胞VEGF的分泌具有抑制效應(yīng),試驗中我們發(fā)現(xiàn)高糖加鋅組中5.0 μmol/L鋅濃度下與正常條件下各時相Müller細(xì)胞VEGF的表達(dá)曲線變化相接近,但因該研究尚處于體外培養(yǎng)細(xì)胞研究階段,是否為或接近為臨床最佳治療濃度,仍需大量研究證實,故適用于人類的最佳治療鋅濃度也可能成為未來研究熱點(diǎn)。

        [1]Robbins MA,Cepko CL.Control of Muller glial cell proliferation and activation following retinal injury[J].Nat.Neurosci,2000,3(9):873.

        [2]薛慶善,主編.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.483-484.

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        [5]Wenzlau JM,Frisch LM,Hutton JC,et al.Changes in zinc transporter 8 autoantibodies following type 1 diabetes onset:The type 1 diabetes genetics consortium autoantibody workshop[J].Diabetes Care,2015,38(Suppl 2):S14.

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        1007-4287(2017)02-0307-03

        2016-04-15)

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