王 泳，賈 彥，任效東，明 珠，江 巖，趙 培?，龐廣昌，閻亞麗，陳慶森?

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

嗜酸乳桿菌胞外蛋白調(diào)控MAPK和PI3K-AKT信號途徑關(guān)鍵蛋白活化水平

王 泳，賈 彥，任效東，明 珠，江 巖，趙 培?，龐廣昌，閻亞麗，陳慶森?

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

探討并揭示嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6005分泌的相關(guān)蛋白質(zhì)促進腸道健康及分子機制具有重要研究價值。本實驗在確定了L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29結(jié)腸癌細胞增殖的基礎(chǔ)上，進一步探討67 ku和37 ku的胞外蛋白通過何種途徑發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細胞增殖。研究以HT-29細胞作為靶細胞，用絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）信號通路為考察對象，以Western Blotting為手段，分析兩個通路中關(guān)鍵的靶點蛋白p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）、磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated AKT，p-AKT）、PI3K的表達水平，以探討并闡述源于L. acidophilus CICC6005胞外蛋白調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖狀況的分子機制。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的67 ku和37 ku胞外蛋白分別作用HT-29細胞一定時間后，兩種胞外蛋白均具有下調(diào)兩個信號通路途徑中p-ERK1/2、p-p38、p-AKT、PI3K蛋白的表達，且存在濃度依賴關(guān)系；但對p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表達沒有影響。因此，源于L. acidophilus CICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表現(xiàn)出顯著的抑制HT-29細胞增殖的功能，其機制可能與調(diào)控MAPK和PI3K-AKT兩個信號通路中幾個關(guān)鍵的靶點蛋白的活化水平相關(guān)。該研究結(jié)果提示，食用嗜酸乳桿菌其分泌的胞外蛋白質(zhì)將達到維護腸道健康的目標(biāo)。

嗜酸乳桿菌CICC6005；胞外蛋白；HT-29結(jié)腸癌細胞；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）；磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）天然存在于人和動物的胃腸道和口腔中，有益生保健特性，常與嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌一同用于酸奶的生產(chǎn)[1]。已報道的L. acidophilus生物學(xué)功能主要有：耐胃酸和耐膽汁鹽，可順利通過人體胃腸道系統(tǒng)[2]；產(chǎn)VK和乳糖酶，有些菌株能產(chǎn)生細菌素，如：嗜酸乳菌素（acidolin）、乳酸菌素（acidophilin）、乳酸殺菌素（lactocidin），抑制病原菌和腐敗菌的生長，維護腸道健康[3]。美國梅奧診所把L. acidophilus用于心臟病治療，雖尚處于“傳統(tǒng)或科學(xué)理論”和“未進行徹底的人體試驗、安全性和有效性尚未證明”階段[4]，但已證實其有改善腸道微生態(tài)失衡以及生物拮抗作用[5-6]。近期比較熱門的幾種L. acidophilus菌株的研究，均與人類健康密切相關(guān)。美國營養(yǎng)學(xué)會上的一篇報道指出酸奶中L. acidophilus L1降低血清膽固醇濃度6%～10%，能有效降低冠心病發(fā)病率[7]。L. acidophilus LA-5菌株與腸相關(guān)淋巴組織（gutassociated lymphoid tissue，GALT）和脂代謝密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為增強細胞因子表達、抗體功能以及沙門氏菌吞噬作用、改善及增強腸道菌群多樣性、調(diào)節(jié)機體免疫力、降低膽固醇水平、緩解乳糖不耐癥、抑制腸黏膜腫瘤細胞的增殖[8-10]。還發(fā)現(xiàn)L. acidophilus LA-5能抑制乳腺癌細胞的生長[11]。L. acidophilus NCFM存活于健康和疾病人群的胃腸道系統(tǒng)中，也是常規(guī)食品（牛奶、酸奶和嬰幼兒奶粉）和膳食補充劑中常見的益生菌。從表現(xiàn)型和遺傳型上把L. acidophilus NCFM歸為A1型嗜酸乳桿菌菌株[12]。菌株NCFM的功能主要有抑制誘導(dǎo)大鼠異常隱窩的形成、降低了結(jié)腸癌發(fā)病率、顯著降低小腸細菌過度生長的透析病人血液中毒胺的水平、促進乳糖不耐癥患者對乳糖的消化等。還發(fā)現(xiàn)菌株NCFM能在Caco-2和HT-2黏液分泌細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生存，產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，能很好的用于遺傳操作和DNA的導(dǎo)入[13]。人們?nèi)粘ＯM的L. acidophilus NCFM也有抗炎作用，其能緩解發(fā)燒、咳嗽、流鼻涕等癥狀[14-15]。益生菌與人體健康的作用機制尚需更深入研究。

有研究揭示食用經(jīng)過遺傳改造的L. acidophilus能重置小鼠可能導(dǎo)致癌癥的免疫應(yīng)答，并縮小前癌結(jié)腸息肉[16]。此前已有對腸道微生物L(fēng). acidophilus的研究證實，若刪除其脂磷壁酸（lipteihcoicacid，LTA）分子的基因，會降低導(dǎo)致小鼠結(jié)腸炎的炎癥應(yīng)答[17]。為研究LTA是否為促進腫瘤過度活躍的炎癥應(yīng)答的因素之一，Khazaie等[16]給病理性炎癥和前癌結(jié)腸息肉的小鼠口服缺乏LTA的L. acidophilus，結(jié)果證實該療法重置了過度活躍的炎癥應(yīng)答，小鼠的腸內(nèi)環(huán)境恢復(fù)到了健康的平衡態(tài)；除此，還發(fā)現(xiàn)L. acidophilus可能具有調(diào)控腸內(nèi)免疫、逆轉(zhuǎn)某些前癌狀態(tài)及預(yù)防諸如結(jié)腸癌等炎癥驅(qū)動的惡性腫瘤的功能。

已有研究表明，益生菌分泌的一些代謝產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠促進腸道穩(wěn)態(tài)，在保健食品的開發(fā)研究中具有顯著的開發(fā)潛力[18]。研究結(jié)果已經(jīng)闡述了益生菌的胞外蛋白可以參與調(diào)節(jié)腸黏膜的免疫機制，包括與定殖在腸道的菌群的“信息交流”、與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用、調(diào)節(jié)黏膜屏障功能等，通過這些機制可以促進腸道穩(wěn)態(tài)。胞外蛋白對腸黏膜免疫機制的調(diào)節(jié)通過可識別胞外蛋白的受體的互作來實現(xiàn)，如Toll樣受體等，通過胞內(nèi)信號級聯(lián)識別胞外蛋白及其攜帶的信息。一般情況下，信號要通過不同的通路途徑進行傳輸，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）信號通路和糖原合成激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）信號通路等[19]。這些信號通路途徑的激活會引起下游基因表達的改變，從而細胞水平也隨之發(fā)生改變。因此，MAPK和PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有很重要的作用，弄清胞外蛋白作用的信號通路對結(jié)腸癌中的作用機制，并且對其靶點（即一些關(guān)鍵蛋白）進行早期干預(yù)，可以減輕腸道黏膜的損傷，維持腸上皮穩(wěn)態(tài)，防止結(jié)腸癌等腸道疾病的發(fā)生[20-21]。Schlee等[22]研究發(fā)現(xiàn)L. acidophilus PZ 1138、發(fā)酵乳桿菌PZ 1162，干酪乳桿菌干酪亞種LMGP-17806混合益生菌分泌的胞外蛋白可以通過激活NF-κB和MAPK信號通路誘導(dǎo)上皮細胞抗菌肽hβD-2的分泌。Bernardo等[23]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌分泌的肽類物質(zhì)可以誘導(dǎo)人類腸道樹突細胞產(chǎn)生白細胞介素（interleukin，IL）-10，IL-10對炎癥、自身免疫疾病的預(yù)防和腸道穩(wěn)態(tài)的維持有很重要的作用。

近些年來，益生菌分泌的胞外蛋白成為學(xué)者們研究的一個新的熱點，相關(guān)生理功能的研究已有報道。目前，胞外蛋白可分為兩類，第一類是含有信號肽且位于序列N-末端的蛋白質(zhì)，第二類是因細菌細胞壁的正常周期從細菌直接脫落的蛋白質(zhì)。分泌胞外蛋白的益生菌主要有乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌等[24-25]。Yan Fang等[26]采用離子交換法從鼠李糖乳桿菌上清液純化出兩種蛋白質(zhì)p75、p40，它們通過激活蛋白PI3K-AKT信號通路，從而抑制細胞凋亡和防止小鼠腸上皮細胞的損傷，揭示了p75和p40是一類促生長因子，是維持人類胃腸道穩(wěn)態(tài)重要的分泌蛋白，可以通過特殊的信號通路保護腸黏膜屏障并促進腸上皮穩(wěn)態(tài)。因此，這些研究確認了益生菌分泌的胞外蛋白在腸道黏膜中發(fā)揮著很重要的免疫調(diào)節(jié)作用，為腸道疾病特別是腸道腫瘤的緩解、修復(fù)和治療方面開辟一條新途徑。

基于以上研究成果，闡明益生菌分泌的胞外蛋白維持人類胃腸道穩(wěn)態(tài)和保護腸黏膜屏障的機制是一個非常重要的科學(xué)問題。本研究將以L. acidophilus CICC6005分離純化的胞外蛋白為研究對象，以人HT-29結(jié)腸癌細胞作為模型，通過對MAPK和PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路途徑中關(guān)鍵蛋白因子的研究，進一步探討并揭示L. acidophilus CICC6005胞外蛋白抑制結(jié)腸癌細胞的分子機制，并為L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白作為抑制、治療結(jié)腸癌的生物功能產(chǎn)品的開發(fā)提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CICC6005的 67 ku和37 ku胞外蛋白產(chǎn)物，由天津市食品生物技術(shù)重點實驗室分離純化獲得[27]。

人結(jié)腸癌HT-29細胞購自江蘇齊氏生物科技有限公司。

全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG） 北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白預(yù)染Marker #0671 立陶宛Fermantas公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；兔抗人c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）單克隆抗體、兔抗人細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）單克隆抗體、兔抗人p38單克隆抗體、兔抗人磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）單克隆抗體、兔抗人p-JNK單克隆抗體、兔抗人p-ERK單克隆抗體、兔抗人p-AKT單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體 美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人β-肌動蛋白多克隆抗英國Abcam公司；ECL超敏底物化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽、DYCZ-40D型迷你轉(zhuǎn)印電泳槽、DYY-2C型電泳儀 北京六一儀器廠；PVDF膜（0.45 μm） 美國Millipore公司；X射線攝影暗匣（127 mm×178 mm） 廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；X-OMAT型醫(yī)用X射線膠片 銳珂（廈門）醫(yī)療器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人結(jié)腸癌HT-29細胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)

用于HT-29細胞生長的培養(yǎng)基：10 mL胎牛血清和90 mL改良型RPMI-1640培養(yǎng)基混勻。細胞凍存液：5 mL胎牛血清、改良型4 mL RPMI-1640培養(yǎng)基和1 mL 10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）混勻。

人結(jié)腸癌細胞株HT-29，接種于直徑100 mm培養(yǎng)皿中，貼壁后分組藥物刺激48 h。分組：對照組（只有HT-29細胞）、37 ku胞外蛋白組（HT-29細胞＋37 ku胞外蛋白）、67 ku胞外蛋白組（HT-29細胞＋67 ku胞外蛋白）。兩種胞外蛋白干預(yù)劑量的參照文獻[28]，67 ku和37 ku胞外蛋白組劑量均設(shè)4 個質(zhì)量濃度組，分別為0.001、0.010、0.100、1.000 μg/mL。

1.3.2 提取細胞總蛋白

人結(jié)腸癌HT-29細胞總蛋白質(zhì)的提取，按全蛋白抽提試劑盒說明書進行操作。提取蛋白于－80 ℃分裝保存，避免反復(fù)凍融。采用二喹啉甲酸法確定總蛋白量，操作按說明書步驟。

1.3.3 Western Blotting

參照文獻[28]的方法。L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對MAPK和PI3K-AKT信號通路中p38/p-p38（38 ku）、ERK/p-ERK（42/44 ku）、JNK/p-JNK（46/54 ku）、p-AKT（60 ku）和PI3K（85 ku）的表達水平的檢測分析，其中加樣操作：向細胞總蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液，前者與后者體積比4∶1，煮沸變性5 min，冷卻至室溫，用微量加樣器吸取樣品，潛水加樣。檢測蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜條件如表1。

表1 MAPK和PI3K-AKT信號通路中各檢測蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜條件Table1 Transmembrane conditions for measured proteins involved in MAPK and PII33KK--AAKKTT signaling pathways

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，進行單因素方差分析，處理結(jié)果以±s表示，定義P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對HT-29結(jié)腸癌細胞MAPK信號通路的影響

根據(jù)本研究方案的設(shè)計，重點考察L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對HT-29結(jié)腸癌細胞MAPK信號通路家族中3 個關(guān)鍵靶點蛋白（p38、ERK和JNK）活化水平，確定胞外蛋白干預(yù)后是否通過調(diào)控這幾個關(guān)鍵蛋白的活性狀態(tài)達到MAPK信號通路的調(diào)控，最終闡述胞外蛋白抑制HT-29細胞的增殖的分子水平。

p38是MAPK家族成員之一，當(dāng)p38受到外界刺激時，其蘇氨酸（Thr180）與酪氨酸（Tyr182）磷酸化同時被激活，激活后的p38 MAPK作用于其下游底物，包括各種轉(zhuǎn)錄因子等，使其轉(zhuǎn)錄活性升高，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此有效控制這條信號傳導(dǎo)通路的活性，可達到緩解和治療疾病的作用[29]。ERK1/2通路是MAPK的一個重要信號途徑，在調(diào)節(jié)細胞的生長、遷移、分化、存活和凋亡中具有重要作用。JNK是MAPK超家族成員之一，特異性刺激因素先引起絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogenactivated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）活化，接下來磷酸化和活化MAPKK的亞型MKK4和MKK7，它們再依次磷酸化和活化JNK[30]，活化后的JNK可以參與下游相關(guān)基因表達，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。采用Western Blotting技術(shù)檢測各組HT-29細胞p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK蛋白表達量的變化，結(jié)果分別如圖1所示，隨后利用Quantity One凝膠成像分析軟件獲得各個條帶的灰度積分值，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參對各目的蛋白進行標(biāo)準(zhǔn)化定量，得到的各組樣品p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK的相對灰度積分值，分別見圖2所示。

圖1 嗜酸乳桿菌胞外蛋白對HT-29細胞各蛋白表達量的影響Fig.1 Effect of extracellular proteins from L. acidophilus on protein expression in HT-29 cells

圖2 不同胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作用HT-29細胞對各組蛋白表達量的影響Fig.2 Changes in protein expression in HT-29 cells exposed to different concentrations of extracellular proteins from L. acidophilus

由圖2a可知，不同質(zhì)量濃度67 ku胞外蛋白作用HT-29細胞48 h，p38蛋白的磷酸化程度隨其質(zhì)量濃度的增大而逐漸減弱，其中A1組與對照組比較p-p38蛋白的表達抑制較為顯著（P＜0.05），A2、A3、A4組能極顯著降低p38蛋白磷酸化程度（P＜0.01）；p38蛋白的磷酸化程度也隨37 ku胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而減弱，B1、B2、B3、B4組能顯著抑制p-p38蛋白的表達，其中，B2組、B3組、B4組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。由圖2b可知，各組總p38蛋白的表達與對照比較，無顯著性差異（P＞0.05）。由圖2c、d可知，ERK磷酸化程度較對照組都顯著下降，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，其中，A1，B1組顯著降低ERK磷酸化的表達（P＜0.05），A2、A3、A4、B2、B3、B4組能極顯著降低ERK磷酸化的表達（P＜0.01）；ERK的表達不隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的變化而改變，即各組ERK蛋白的表達與對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。由圖2e、f可知，各組JNK蛋白表達量與對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。兩種胞外蛋白分別在不同質(zhì)量濃度條件下處理HT-29細胞48h，JNK的磷酸化程度也不隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而發(fā)生改變，各組p-JNK蛋白表達量與對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 L. acidophilus CICC6005胞外蛋白對HT-29結(jié)腸癌細胞PI3K-AKT信號通路影響的研究

AKT是細胞通路PI3K-AKT的關(guān)鍵分子，在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中位于PI3K的下游。PI3K是腸上皮細胞增殖信號的一條主要信號途徑。HT-29結(jié)腸癌細胞的增殖主要依賴PI3K的活性[31]，因此，抑制PI3K的活性，有利于對結(jié)腸癌的緩解和治療。采用Western Blotting技術(shù)檢測各組HT-29細胞p-AKT、PI3K蛋白表達量的變化，結(jié)果如圖3所示，隨后利用Quantity One凝膠成像分析軟件獲得各個條帶的灰度積分值，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參對p-AKT和PI3K目的蛋白進行標(biāo)準(zhǔn)化定量，得到的各組樣品p-AKT和PI3K蛋白的相對灰度積分值，見圖4所示。

圖3 嗜酸乳桿菌胞外蛋白對HT-29細胞p-AKT（a）、PI3K（bb）蛋白表達量的影響Fig.3 Effect of extracellular proteins from L. acidophilus on the expression of p-AKT (a) and PI3K (b) in HT-29 cells

圖4 不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度對HT-29細胞p-AKT（a）、PI3K（bb）表達量的變化Fig.4 Changes in protein expression of p-AKT (a) and PI3K (b) in HT-29 cells exposed to different concentrations of extracellular proteins from L. acidophilus

由圖4a可以看出，不同質(zhì)量濃度的兩種胞外蛋白作用HT-29結(jié)腸癌細胞后，AKT的磷酸化水平明顯下調(diào)，隨著兩種胞外蛋白質(zhì)量濃度的逐步增高，它們的磷酸化水平的下調(diào)都更加明顯，其中A1、B1組與對照組比較無明顯差異（P＞0.05），A2、B2組抑制AKT的磷酸化作用較為顯著（P＜0.05），A3、A4、B3、B4組能極顯著降低AKT磷酸化的表達（P＜0.01）。由圖4b可知，PI3K蛋白的表達水平隨著兩種胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低，其中A1、A2、B1組與對照組比較，PI3K蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），A3、A4、B2、B3、B4組均能極顯著降低PI3K蛋白的表達（P＜0.01）

3 討 論

L. acidophilus是人體腸道中的重要微生物，能改善和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，增強機體免疫力，降低膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥以及抑制腫瘤細胞的形成等，起到健康促進效果。益生菌的胞外蛋白可以參與調(diào)節(jié)腸黏膜的免疫機制，包括與宿主免疫系統(tǒng)的作用、調(diào)節(jié)黏膜屏障功能等，通過這些機制可以促進腸道穩(wěn)態(tài)。胞外蛋白可以作為功能性蛋白用于腸道疾病的生物免疫治療，為解決腸道疾病提供了一條新的有效途徑[32]。已報道研究結(jié)論均指向，信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的異常貫穿在結(jié)直腸癌等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展的各個階段[33]。研究證實，結(jié)直腸癌的發(fā)生與細胞增殖和凋亡失控有關(guān)，通過調(diào)控不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使結(jié)腸癌細胞凋亡減少，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生。本實驗室前期的研究已確定L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白對HT-29細胞的增殖有明顯抑制作用，并呈劑量和時間依賴關(guān)系[34]。

MAPKs是一類細胞內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是連接細胞膜表面受體與決定基因表達之間的重要信號調(diào)節(jié)酶，所以MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是將細胞外信號傳導(dǎo)入胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。目前MAPK家族包括3 個主要成員，分別為p38、ERK1/2，JNK，這些酶激活一些轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達[35]。

p38是MAPK家族中的重要成員，它是絲氨酸/酪氨酸激酶，當(dāng)酪氨酸和蘇氨酸磷酸化后，從而激活p38，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、分裂、死亡以及細胞間功能同步，已有許多研究成果進行了報道[36]。蔣莎莉[35]用表沒食子兒茶素沒食子酸酯作用于HT-29細胞的研究表明，該活性成分可能通過抑制p38 MAPK、視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白的磷酸化，下調(diào)細胞周期蛋白D1、p53、增殖細胞核抗原蛋白表達，誘導(dǎo)HT-29細胞G1期阻滯，抑制HT-29細胞增殖。Miki等[38]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中p38 MAPK蛋白呈高表達，并且與增殖及凋亡指數(shù)相關(guān)。Tang Jun[38]與ONO[39]等研究表明在結(jié)腸癌細胞中存在p38γ的mRNA，并發(fā)現(xiàn)阻斷了p38γ的表達后，結(jié)腸癌細胞惡性程度降低及表型逆轉(zhuǎn)，由此認為，p38γ與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Jin Heiying等[40]應(yīng)用基因芯片和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測茶多酚對結(jié)腸癌的抑制率及其分子機制，結(jié)果提示茶多酚通過抑制p38等基因上調(diào)腫瘤抑制率。本課題組前期研究中，利用Western Blotting初步研究了乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）對UC小鼠腸黏膜免疫信號通路（NF-κB和p38 MAPK）的影響，結(jié)果表明，乳源CGMP可以顯著抑制抑制NF-κB的激活，CGMP雖然對p38 MAPK的抑制效果不顯著，但仍具有抑制其激活的趨向[41]。本實驗以L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白對HT-29結(jié)腸癌細胞總蛋白p38和其磷酸化水平進行研究。結(jié)果表明，各組p38蛋白的表達量與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）；67 ku胞外蛋白處理HT-29細胞48 h，p38蛋白的磷酸化程度隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而逐漸減弱，其中，0.001 μg/mL的67 ku胞外蛋白可顯著降低p38蛋白磷酸化程度（P＜0.05），0.010、0.100、1.000 μg/mL的67 ku胞外蛋白能極顯著抑制p-p38蛋白的表達（P＜0.01），p38蛋白的磷酸化程度也隨著37 ku胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而減弱，0.001、0.010、0.100、1.000 μg/mL的胞外蛋白質(zhì)量濃度均能顯著抑制p-p38蛋白的表達（P＜0.05或P＜0.01）。這表明L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白可能通過抑制p38蛋白磷酸化程度來調(diào)控腫瘤細胞的增殖，并與胞外蛋白對HT-29細胞增殖抑制作用相對同步。

ERK是MAPK三條主要信號傳導(dǎo)通路之一。ERK1和ERK2是ERKs中的兩個重要成員，分子質(zhì)量分別為44、42 ku。ERK1/2受上游特異性刺激分子MEK1/2雙磷酸化激活，活化的ERK蛋白（p-ERK1/2）形成二聚體，從細胞質(zhì)移位到細胞核，通過調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子而引起細胞增殖分化。p-ERK1/2活性升高可以刺激腸上皮細胞增生與分化，在人結(jié)腸癌細胞中可檢測p-ERK表達水平提高。有研究表明，激活的ERK/MAPK信號傳導(dǎo)通路在結(jié)腸癌形成、發(fā)展的過程中起著十分重要作用[42]。付蕾等[43]研究表明，葉黃素對HT-29結(jié)腸癌細胞可以通過下調(diào)ERK蛋白的磷酸化水平抑制結(jié)腸癌HT-29細胞增殖，并且還可以誘導(dǎo)HT-29細胞凋亡。Bocca等[44]研究發(fā)現(xiàn)共軛亞油酸能下調(diào)Caco-2細胞中Raf-1的表達水平和ERK1/2的磷酸化水平，并伴隨著下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc的表達減少，以達到抑制結(jié)腸癌細胞的增殖的效果。Minelli等[45]在大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，載有醇丁酸酯的固體脂質(zhì)納米粒能通過下調(diào)p-p38及p-ERK的表達，從而抑制大腸癌的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，67 ku和37 ku胞外蛋白處理后，ERK磷酸化程度較對照組都顯著下降，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，其中，0.001 μg/mL的67 ku胞外蛋白和37 ku胞外蛋白能顯著降低ERK磷酸化程度的表達（P＜0.05），其他各組也極顯著降低ERK磷酸化的水平（P＜0.01）。ERK的表達不隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的變化而改變，即各組ERK蛋白的表達與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）。許多研究已證實ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常表達或者異常活化與腫瘤關(guān)系密切相關(guān)，因此，阻斷該信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)對于結(jié)、直腸癌等腫瘤的治療具有重大的意義，本研究結(jié)果也證實了這一結(jié)論，即L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白可以通過阻斷細胞內(nèi)ERK信號通路的激活發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

JNK是一種能夠特異性磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的激酶，JNK的直接上游激酶MEK4（MKK4，JNKK1）和MEK7（MKK7，JNKK2）通過雙磷酸化JNK的Thr183和Tyr185位點而激活JNK[46-47]。JNK信號通路的MAPKKK主要有：MEKK1、2、3、4混合連接激酶、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶和TGF-β激活的蛋白激酶[30]。JNK受到上游信號分子的激活后，可使細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的氨基末端第63位和第73位絲氨酸殘基被磷酸化，進一步刺激并激活c-Jun，提高其轉(zhuǎn)錄活性。c-Jun磷酸化后還可以促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體的形成，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合很多基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1位點，以增強其基因的轉(zhuǎn)錄活性能力[48]。此外，JNK激活之后還可以使轉(zhuǎn)錄因子Ets-like protein-1和活化轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-2發(fā)生磷酸化，并使其轉(zhuǎn)錄活性增強。本研究結(jié)果表明，兩種胞外蛋白分別在不同質(zhì)量濃度（0.001、0.010、0.100、1.000 μg/mL）條件下處理HT-29細胞48 h，JNK的磷酸化程度也不隨其質(zhì)量濃度的增大而發(fā)生改變，各組p-JNK蛋白水平與對照組比較也無顯著差異（P＞0.05）。雖然并行存在5 條MAPK信號通路，但是到目前為止關(guān)于結(jié)直腸癌的研究主要集中在ERK1/2和p38信號通路[48]。提示L. acidophilus CICC6005胞外蛋白并沒有通過抑制JNK蛋白磷酸化表達的水平變化來抑制HT-29結(jié)腸癌細胞的增殖。

PI3K-AKT信號通路與細胞的增殖、分化、凋亡等細胞反應(yīng)之間有著密切的聯(lián)系。PI3K蛋白具有類酯激酶和蛋白激酶的活性，AKT是PI3K通路中的一個重要的下游激酶，并且具有絲/蘇氨酸激酶活性，當(dāng)PI3K蛋白激活后，其直接作用AKT蛋白使其發(fā)生磷酸化，從而使下游信號通路因子NF-κB抑制蛋白，NF-κB、Bad蛋白、caspase-9、caspase-3等發(fā)生磷酸化反應(yīng)，進而實現(xiàn)其各種生物學(xué)作用，比如促進細胞周期進程、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡[49-51]。PI3K-AKT信號通路中任環(huán)節(jié)的異常都與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后密切相關(guān)。PI3K-AKT信號通路已成為一個新的治療靶點。多種物質(zhì)在誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡和抑制細胞增殖時，伴有PI3K-AKT信號通路各重要蛋白表達的變化。楊琨等[52]的研究表明，咖啡酸苯乙酯可下調(diào)PI3K-AKT信號通路中AKT的磷酸化程度從而上調(diào)其信號通路下游因子caspase-3、caspase-9的表達，這種方式可以抑制結(jié)腸癌細胞Lovo生長的作用。有研究采用人結(jié)腸癌Caco-2細胞為研究對象，使用二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）對其進行干預(yù)，結(jié)果表明DHA可以通過降低p-AKT蛋白的表達水平抑制Caco-2細胞的增殖，并可以誘導(dǎo)其凋亡，但是DHA作用于正常人結(jié)腸細胞NCM460細胞時，表現(xiàn)出抵抗作用[53]。Semba等[54]研究表明LY294002可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞（DLD-1、LoVo、HCT15和Colo205）凋亡并且抑制其增殖，其分子機制為下調(diào)AKT的磷酸化水平，增強caspase-3的活性。但各種細胞對LY294002的敏感性不同，LoVo細胞的敏感性最強。Park等[55]研究表明，利用視黃醇作用人結(jié)腸癌細胞HCT116和SW620 30 min后，通過降低PI3K蛋白的活性誘導(dǎo)兩種結(jié)腸癌細胞的凋亡，并且研究還發(fā)現(xiàn)PI3K蛋白的表達水平與其細胞凋亡呈正相關(guān)。王鶴霏等[56]研究顯示，硼替佐米可以抑制結(jié)腸癌SW480細胞增殖。其機制可能與抑制人第10號染色體磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）蛋白降解，抑制p-AKT蛋白表達水平有關(guān)。本研究結(jié)果表明，對于不同質(zhì)量濃度的67 ku胞外蛋白作用HT-29結(jié)腸癌細胞后，AKT的磷酸化水平明顯下調(diào)，隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的提高，其磷酸化水平下調(diào)更加明顯，其中0.001 μg/mL的67 ku胞外蛋白與對照組比較無明顯差異（P＞0.05），0.010 μg/mL的67 ku胞外蛋白抑制AKT磷酸化較為顯著（P＜0.05），質(zhì)量濃度為0.100、1.000 μg/mL時均能極顯著降低p-AKT的表達（P＜0.01）；PI3K蛋白的表達量也隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低，其中0.001、0.100 μg/mL組與對照組比較，PI3K蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），0.100、1.000 μg/mL組均能極顯著降低PI3K蛋白的表達（P＜0.01）。而對于37 ku的胞外蛋白可顯著下調(diào)HT-29結(jié)腸癌細胞中p-AKT蛋白表達水平，但其中0.001 μg/mL的37 ku胞外蛋白作用結(jié)果與對照組比較無明顯差異（P＞0.0 5），0.0 1 0 μ g/m L的3 7 k u胞外蛋白抑制A K T磷酸化較為顯著（P＜0.0 5），質(zhì)量濃度0.1 0 0、1.0 0 0 μ g/m L均能極顯著降低AKT的表達（P＜0.01）；PI3K蛋白的表達量也隨胞外蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低，其中0.001 μg/mL組與對照組比較，PI3K蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），0.010、0.100、1.000 μg/mL組均能極顯著降低PI3K蛋白的表達（P＜0.01）。胞外蛋白對HT-29結(jié)腸癌細胞PI3K蛋白表達和AKT磷酸化程度呈正相關(guān)，PI3K作為AKT的上游激活蛋白，說明胞外蛋白對HT-29結(jié)腸癌細胞增殖的抑制作用與PI3K-AKT信號通路有關(guān)，蛋白PI3K激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸發(fā)生磷酸化形成PIP3，隨后激活下游蛋白AKT，通過這種途徑來調(diào)控細胞的增殖和凋亡影響，因此，L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29細胞增殖的作用機制可能與對PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路的抑制有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究證實了固態(tài)培養(yǎng)L. acidophilus CICC6005分泌的兩種胞外蛋白在一定程度上具有抑制HT-29細胞中MAPK信號通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化程度，下調(diào)p-ERK1/2、p-p38蛋白的表達，但對p-JNK蛋白的表達沒有影響，同時也影響HT-29細胞中PI3K-AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達，下調(diào)p-AKT、PI3K蛋白的表達。研究結(jié)果揭示了L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29結(jié)腸癌細胞的分子機制，在促進腸道穩(wěn)態(tài)功效上，可能與MAPK和PI3K-AKT兩個信號通路相關(guān)。因此，我們的研究結(jié)果闡述了L. acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制結(jié)直腸癌細胞增殖作用的分子機制，也解釋了食用益生菌有助于人類解決結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展問題，該研究結(jié)果對人類腸道健康將產(chǎn)生積極的影響。

[1] 劉希山, 羅欣, 梁榮蓉, 等. 嗜酸乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合培養(yǎng)制作保健型發(fā)酵乳的研究[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2005(10)： 34-37.

[2] 孟和畢力格, 張和平, 王俊國. 一種嗜酸乳桿菌及其抗氧化活性的應(yīng)用： CN101333506[P]. 2008-12-31[2016-05-18]. http：//xueshu. baidu.com/s?wd=paperuri%3A%28a70ec4e4887230a62e193bf113ead 5be%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_ vurl=http%3A%2F%2Fd.wanfangdata.com.cn%2FPatent_ CN200710123098.X.aspx&ie=utf-8&sc_us=10231396440386347911

[3] 蘇安分. 嗜酸乳桿菌活菌制劑開發(fā)研究[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011： 1-7.

[4] MATTILA T, SANDHOLM P, MYLLRINEN R, et al. Technological challenges for future probiotic foods[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(2)： 173-182. DOI：10.1016/S0958-6946(01)00099-1.

[5] SINGHI S C, BARANWAL A. Probiotic use in the critically ILL[J]. Indian Journal of Pediatrics, 2008, 75(6)： 621-627. DOI：10.1007/ s12098-008-0119-1.

[6] QIAO J, LI H, WANG Z, et al. Effects of Lactobacillus acidophilus dietary supplementation on the performance, intestinal barrier function, rectal microflora and serum immune function in weaned piglets challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2015, 107(4)： 883-891. DOI：10.1007/s10482-015-0380-z.

[7] ANDERSON J W, GILLILAND S E. Effect of fermented milk (yogurt) containing Lactobacillus acidophilus L1 on serum cholesterol in hypercholesterolemic humans[J]. Journal of the American College of Nutrition, 1999, 18(1)： 43-50. DOI：10.1080/07315724.1999.10718826.

[8] MINIELLO V L, MORO G E, ARMENIO L. Prebiotics in infant milk formulas： new perspectives[J]. Acta Paediatrica Supplement, 2003, 91(441)： 68-76. DOI：10.1111/j.1651-2227.2003.tb00649.x.

[9] ALM L, ROBINSON R K. The therapeutic effects of various cultures-an overview[J]. Therapeutic Properties of Fermented Milks, 1991： 45-64.

[10] MARTINI M C, LEREBOURS E C, LIN W J, et al. Strains and species of lactic acid bacteria in fermented milks (yogurts)： effect on in vivo lactose digestion[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 1991, 54(6)： 1041-1046.

[11] KRISHNAMURTHY K, WANG G, ROKHFELD D, et al. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide[J]. Breast Cancer Research, 2007, 10(6)： 1-16. DOI：10.1186/bcr2211.

[12] FIJAN SABINA. Microorganisms with claimed probiotic properties：an overview of recent literature[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2014, 11(5)： 4745-4767. DOI：10.3390/ijerph110504745.

[13] 楊相宜, 滿朝新, 劉穎, 等. 嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對小鼠免疫相關(guān)基因的調(diào)控[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(5)： 213-217. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201305044.

[14] LEE Y K, SALMINEN S. Handbook of probiotics and prebiotics[M]. 2nd ed. New Jersey： John Wiley & Sons, 2008： 447-449. DOI：10.1002/97804. 70432624.

[15] XIE C, LI J, WANG K, et al. Probiotics for the prevention of antibiotic-associated diarrhoea in older patients： a systematic review[J]. Travel Medicine and Infectious Disease, 2015, 13(2)： 128-134. DOI：10.1016/j.tmaid.2015.03.001.

[16] KHAZAIE K, ZADEH M, KHAN M W, et al. Abating colon cancer polyposis by Lactobacillus acidophilus deficient in lipoteichoic acid[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(26)： 10462-10467. DOI：10.1073/pnas.1207230109.

[17] BORTHAKUR A, BHATTACHARYYA S, KUMAR A, et al. Lactobacillus acidophilus alleviates platelet-activating factor-induced inflammatory responses in human intestinal epithelial cells[J]. PLoS Pathogens, 2013, 8(10)： e75664. DOI：10.1371/journal.pone.0075664.

[18] NAGPAL R, KUMAR A, KUMAR M, et al. Probiotics, their health benefits and applications for developing healthier foods： a review[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2012, 334(1)： 1-15. DOI：10.1111/j.1574-6968.2012.02593.x.

[19] KIM I. Zinc induces tau hyperphosphorylation through extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) pathway[D]. Seoul： Yonsei University , 2007： 3-24.

[20] PENG Cheng, LIU Xiangqun, LIU Enyu, et al. Norcantharidin induces HT-29 colon cancer cell apoptosis through the αvβ6-extracellular signalrelated kinase signaling pathway[J]. Cancer Science, 2009, 100(12)： 2302-2308. DOI：10.1111/j.1349-7006.2009.01320.x.

[21] 孟菲, 王春鳳, 楊桂連. 益生菌與腸上皮細胞間相互作用及免疫調(diào)節(jié)機制[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(21)： 394-398. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201321077.

[22] SCHLEE M, WEHKAMP J, ALTENHOEFER A, et al. Induction of human beta-defensin 2 by the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 is mediated through fl agellin[J]. Infection and Immunity, 2007, 75(5)：2399-2407. DOI：10.1128/IAI.01563-06.

[23] BERNARDO D, SáNCHEZ B, ALHASSI H O, et al. Microbiota/host crosstalk biomarkers： regulatory response of human intestinal dendritic cells exposed to lactobacillus extracellular encrypted peptide[J]. PLoS ONE, 2012, 7(5)： e36262. DOI：10.1371/journal.pone.0036262.

[24] 訾禎禎, 楊志偉. 細菌蛋白分泌途徑的研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2011(8)： 44-50.

[25] 李超, 董明盛. 乳酸菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展[J]. 食品科學(xué), 2005,26(1)： 255-259.

[26] YAN F, CAO H, COVER T L, et al. Soluble proteins produced by probiotic bacteria regulate intestinal epithelial cell survival and growth[J]. Gastroenterology, 2007, 132(2)： 562-575. DOI：10.1053/ j.gastro.2006.11.022.

[27] 賈彥, 任效東, 陳慶森, 等. 嗜酸乳桿菌胞外蛋白的分離純化及抑制HT-29細胞增殖作用的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(11)： 56-61. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.11.009.

[28] GONG J, CHEN Q, YAN Y, et al. Effect of casein glycomacropeptide on subunit p65 of nuclear transcription factor-κB in lipopolysaccharidestimulated human colorectal tumor HT-29 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2014, 3(2)： 51-55. DOI：10.1016/j.fshw.2014.04.001.

[29] 金伯泉. 細胞和分子免疫學(xué)[M]. 2版. 北京： 科學(xué)出版社, 2001：539-581.

[30] WESTON C R, DAVIS R J. The JNK signal transduction pathway[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2007, 19(2)： 142-149. DOI：10.1016/ j.ceb. 2007.02.001.

[31] HUET C, SAHUQUILLO-MERINO C, COUDRIER E, et al. Absorptive and mucussecreting subclones isolated from a multipotent intestinal cell line (HT-29) provide new models for cell polarity and terminal differentiation[J]. Journal of Cell Biology, 1987, 105(1)： 345-357. DOI：10.1083/jcb.105.1.345.

[32] 陳慶森, 任效東. 一種乳酸菌胞外蛋白的提取方法及應(yīng)用：CN104388503A[P]. 2015-03-04[2016-05-18]. http：//xueshu.baidu. com/s?wd=paperuri%3A%2893c7f5278acb4ef33bada86e4695e6b 4%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_ vurl=http%3A%2F%2Fd.wanfangdata.com.cn%2FPatent%2FCN2014 10680804.0%2F&ie=utf-8&sc_us=8756046018456331948.

[33] CHEN Qingsen, WANG Hua, ZHU Chenchen, et al. Anti-apoptotic effects of milk-derived casein glycomacropeptide on mice with ulcerative colitis[J]. Food and Agricultural Immunology, 2014, 25(4)：453-466. DOI：10.1080/09540105.2013.823912.

[34] 王華, 陳慶森. 乳源酪蛋白糖巨肽抗細胞凋亡干預(yù)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎效應(yīng)研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(1)： 230-234.

[35] 蔣莎莉. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯體外對人結(jié)腸癌HT-29細胞生長抑制作用及機制研究[D]. 衡陽： 南華大學(xué), 2009： 5-27.

[36] 運晨霞, 郭宏偉, 鄧家剛, 等. 芒果苷對2215細胞MAPK信號通路表達的影響[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2011, 27(8)： 915-917.

[37] MIKI H, YAMADA H, MITAMURA K. Involvement of p38 MAP kinase in apoptotic and proliferative alteration in human colorectal cancers[J]. Anticancer research, 1998, 19(6B)： 5283-5291.

[38] TANG J, QI X, MERCOLA D, et al. Essential role of p38gamma in K-Ras transformation independent of phosphorylation[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(25)： 23910-23917. DOI：10.1074/jbc. M500699200.

[39] ONO K, HAN J. The p38 signal transduction pathway： activation and function[J]. Cell Signalling, 2000, 12(1)： 1-13. DOI：10.1016/S0898-6568(99)00071-6.

[40] JIN H Y, TAN X, LIU X, et al. The study of effect of tea polyphenols on microsatellite instability colorectal cancer and its molecular mechanism [J]. International Journal of Colorectal Disease, 2011, 25(3)： 1407-1415. DOI：10.1007/s00384-010-1095-2.

[41] ZHU Ming, JIA Yuchen, YAN Yali, et al. Amelioration effect of bovine casein glycomacropeptide on ulcerative colitis in mice[J]. Food and Agricultural Immunology, 2015, 26(5)： 717-728. DOI：10.1080/095401 05.2015.1018874.

[42] 多玥荷, 孫莉娜, 應(yīng)森林, 等. 西黃丸通過ERK/MAPK信號通路對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2013, 28(10)：3055-3057.

[43] 付蕾, 陳曉哲, 張慧娟, 等. 葉黃素對人結(jié)腸癌HT29細胞增殖的抑制及其機制[J]. 世界華人消化雜志, 2013, 21(13)： 1234-1244. DOI：10.11569/wcjd.v21.i13.1239.

[44] BOCCA C, BOZZO F, GABRIEL L, et al．Conjugated linoleic acid inhibits Caco-2 cellgrowth via ERK-MAPK signaling pathway[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2007, 18(5)： 332-340. DOI：10.1016/j.jnutbio.2006.07.001.

[45] MINELLI R, OCCHIPINTI S, GIGLIOTTI C L, et al. Solid lipid nanoparticles of cholesteryl butyrate inhibit the proliferation of cancer cells in vitro and in vivo models[J]. British journal of pharmacology, 2013, 170(2)： 233-244. DOI：10.1111/bph.12255.

[46] BROWN M D, SACKS D B. Protein scaffolds in MAP kinase signalling[J]. Cellular Signalling, 2009, 21(4)： 462-469. DOI：10.1016/ j.cellsig.2008.11.013.

[47] AKELLA R, MOON T M, GOLDSMITH E J. Unique MAP kinase binding sites[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1784(1)： 48-55. DOI：10.1016/j.bbapap.2007.09.016.

[48] 鄧蓉, 朱孝峰, 周軍民, 等．二萜類化合物excisanin A誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW620細胞凋亡及機制研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2006, 22(3)：273-277.

[49] 王楠, 林洪麗, 吳泰華, 等. TIMP-1抑制大鼠腎小球系膜細胞凋亡與磷脂酰肌醇3激酶/絲/蘇氨酸激酶通路的研究[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2006, 26(14)： 1059-1061. DOI：10.3969/ j.issn.1005-2194.2006.14.007.

[50] 劉漪, 李雪梅, 譚永星. 氫氣飽和生理鹽水對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損、神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響[J]. 臨床神經(jīng)病學(xué)雜志, 2013, 26(5)： 351-354.

[51] VOLATE S, KAWASAKI B T, HURT E M, et al. Gossypol induces apoptosis by activating p53 in prostate cancer cells and prostate tumor initiating cells[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2010, 9(2)：461-470. DOI：10.1158/1535-7163.MCT-09-0507.

[52] 楊琨, 何葵, 李鵬, 等. 咖啡酸苯乙酯對人結(jié)腸癌PI3K/AKT信號通路的影響[J]. 社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 11(6)： 1-3.

[53] TOIT-KOHN J L, LOUW L, ENGELBRECHT A M. Docosahexaenoic acid induces apoptosis in colorectal carcinoma cells by modulating the PI3kinase and p38 MAPK pathways[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2009, 20(2)： 106-114. DOI：10.1016/ j.jnutbio.2007.12.005.

[54] SEMBA S, ITOH N, ITOH M, et al. The in vitro and in vivo effects of 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-chromone (LY294002), a specif i c inhibitor of phosphatidy linositol 3-kinase, in human colon cancer cells[J]. Clinical Cancer Research, 2002, 8(6)： 1957-1963.

[55] PARK E Y, WILDER E T, CHIPUK J E, et al. Retinol decreases phosphatidy linositol 3-kinase activity in colon cancer cells[J]. Molecular Carcinogenesis, 2008, 47(4)： 264-274. DOI：10.1002/ mc.20381.

[56] 王鶴霏, 封斌, 孫藝, 等. 蛋白酶抑制劑硼替佐米抑制PI3K/Akt通路致結(jié)腸癌SW480細胞凋亡[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2013, 13(11)：2044-2048.

Extracellular Proteins from Lactobacillus acidophilus Regulate the Activation of Critical Proteins Involved in the MAPK and PI3K-AKT Signaling Pathways

WANG Yong, JIA Yan, REN Xiaodong, MING Zhu, JIANG Yan, ZHAO Pei?, PANG Guangchang, YAN Yali, CHEN Qingsen?
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Purpose： To explore the role and molecular mechanism of proteins secreted by L. acidophilus CICC6005 in promoting intestinal health and to reveal that this topic is well worth further investigation. Methods： This experiment determined extracellular proteins secreted by L. acidophilus CICC6005 to inhibit the proliferation of HT-29 cells and further explored the pathway by which the extracellular proteins 67 and 37 ku inhibited tumor proliferation. In the present study, HT-29 cells were used as target cells to evaluate the expression levels of the critical target protein p38, c-Jun N-terminal kinase (JNK), c-Jun N-terminal kinase (ERK), phosphorylated p38 (p-p38), phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK), phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK), phosphorylated protein kinase B (p-AKT), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) in the mitogen activated protein kinase (MAPK) and (phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B) PI3K-AKT signaling pathways through Western blotting in order to explore the molecularmechanism by which that the extracellular proteins from L. acidophilus CICC6005 regulated the proliferation of colon cancer cells. Results： Exposure of HT-29 cells to different concentrations of 67 and 37 ku extracellular proteins from L. acidophilus CICC6005 could significantly inhibit the expression of p-ERK1/2, p-p38, p-AKT and PI3K in a dose-dependent manner for both signaling pathways but not the expression of p-JNK, ERK1/2, p38 and JNK. Conclusion： The extracellular proteins 37 and 67 ku from L. acidophilus CICC6005 could inhibit the proliferation of HT-29 cells, and the mechanism might be related to the activation level of the critical proteins involved in the MAPK and PI3K-AKT pathways. Consumption of extracellular proteins from L. acidophilus could help to maintain intestinal health.

Lactobacillus acidophilus CICC6005; extracellular proteins; colon cancer cell line HT-29; mitogen activated protein kinase (MAPK); phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B (PI3K-AKT)

10.7506/spkx1002-6630-201703026

TS201.3

A

1002-6630（2017）03-0155-09

2016-06-12

國家自然科學(xué)基金面上項目（31071522）；天津商業(yè)大學(xué)國家基金培育項目（160120）

王泳（1993—），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、功能成分與腸道健康的關(guān)系。E-mail：15620616749@163.com

?通信作者：趙培（1978—）女，副教授，碩士，研究方向為細胞分子生物學(xué)，黏膜細胞信號傳導(dǎo)。E-mail：zhaopei@tjcu.edu.cn陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、功能成分與腸道健康的關(guān)系。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn

王泳, 賈彥, 任效東, 等. 嗜酸乳桿菌胞外蛋白調(diào)控MAPK和PI3K-AKT信號途徑關(guān)鍵蛋白活化水平[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3)： 155-163. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703026. http：//www.spkx.net.cn

WANG Yong, JIA Yan, REN Xiaodong, et al. Extracellular proteins from Lactobacillus acidophilus regulate the activation of critical proteins involved in the MAPK and PI3K-AKT signaling pathways[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 155-163. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703026. http：//www.spkx.net.cn