楊伊然,胡 曉,楊賢慶,*,李來好,陳勝軍,吳燕燕,林婉玲,黃 卉,馬海霞
(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東 廣州 510300;2.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 大連 116023)
藍圓鲹蛋白酶解物的螯合礦物離子活性研究
楊伊然1,2,胡 曉1,楊賢慶1,*,李來好1,陳勝軍1,吳燕燕1,林婉玲1,黃 卉1,馬海霞1
(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東 廣州 510300;2.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 大連 116023)
以藍圓鲹為原料,采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶對其進行水解,研究酶解產(chǎn)物與鈣、亞鐵、鋅離子的螯合活性。結(jié)果表明:藍圓鲹經(jīng)胰蛋白酶水解,水解度為23.14%時其產(chǎn)物具有較高螯合鐵、鋅離子的活性,其螯合率分別高達96.63%和94.28%;藍圓鲹經(jīng)木瓜蛋白酶水解,水解度為22.00%時,其產(chǎn)物具有較高螯合鈣離子的活性,其螯合率高達96.78%;同時研究表明上述兩種酶解物還具有較好的抗氧化活性,其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼半抑制濃度值分別為3.74 mg/mL和3.64 mg/mL。此外,氨基酸分析表明藍圓鲹高螯合礦物離子活性的酶解物中天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸含量較高。
藍圓鲹;酶解物;螯合活性;礦物離子;抗氧化
藍圓鲹(Decapterus maruadsi)為暖水性中上層魚,主要分布在我國海南省東部近海岸、福建沿岸等地,產(chǎn)量大、分布廣,是一種重要的經(jīng)濟魚類。藍圓鲹的蛋白含量在18%左右,但由于其出肉率低,直接食用價值不高,多用于生產(chǎn)飼料,其精深加工水平及高值化利用水平低,造成一定程度的資源浪費。
生物活性肽是對生物機體的生命活動有益或具有特定生理作用的肽類化合物,其對保健食品及生化藥物的開發(fā)具有極其重要的作用[1],近些年受到研究學(xué)者們的廣泛關(guān)注。酶解法水解食源性蛋白,是獲得生物活性肽最高效的方法之一[2]。水產(chǎn)蛋白的肽鏈中大多含有以特定氨基酸序列通過肽鍵連接而成的肽段,該肽段經(jīng)酶解釋放后將具有一定的生物活性[1,3]。研究表明,具有礦物元素結(jié)合活性的肽,可以有效增強人體對礦物元素的吸收率[4],并可從多種食物蛋白水解物中獲取此類多肽,這種新型的生物活性肽已得到國內(nèi)外專家的廣泛認可。
為提高藍圓鲹精深加工和綜合利用水平,本實驗以藍圓鲹魚肉為原料,采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶水解制備藍圓鲹蛋白酶解物,研究其與鈣、亞鐵、鋅離子的螯合活性與抗氧化特性,以期為制備分離礦物離子結(jié)合肽的研究與開發(fā)提供參考。
1.1 材料與試劑
藍圓鲹市售,去除頭和內(nèi)臟,清洗干凈后絞成魚糜,冷凍備用。
木瓜蛋白酶(6 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、透析袋 齊云試劑公司;2.4 L堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司;甲醛、三氯乙酸、硫酸亞鐵、氯化鋅、氯化鈣廣州化學(xué)試劑廠;三氯化鐵、鐵氰化鉀 天津市福晨化學(xué)試劑廠。
1.2 儀器與設(shè)備
3K30臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;Alphal-4冷凍干燥機 德國Christ公司;Delta320精密pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;809Titrando自動電位滴定儀 瑞士Metrohm公司;KjeltecTM2300蛋白自動分析儀 丹麥Foss公司;MARS-5高壓高通量微波消解系統(tǒng) 美國CEM公司;7900 ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜 美國安捷倫公司;METER SUNRISE酶標儀 奧地利TECAN公司。
1.3 方法
1.3.1 酶解液的制備
參照王婷婷[5]的方法并加以修改。取一定質(zhì)量魚肉,按1∶2(m/V)料液比加水,按總加酶量0.3%(m/m),分別加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、2.4 L堿性蛋白酶,在其各自最佳反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度條件下對藍圓鲹魚糜進行酶解(表1)。酶解結(jié)束后,酶解液經(jīng)高溫滅酶15 min,4 ℃、10 000 r/min離心20 min、過濾,得到澄清酶解液。
表1 酶解最適條件Table1 Optimal conditions for enzymatic hydrolysis
1.3.2 水解度的測定
氨態(tài)氮含量采用雙指示劑甲醛滴定法[7]測定;總氮含量采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。
蛋白質(zhì)水解度(degree of hydrolysis,DH)如式(1)計算[6]。
1.3.3 蛋白回收率的測定
酶解液中總氮含量及原料中總氮含量的測定:采用GB 5009.5—2010方法。蛋白回收率按式(2)計算。
式中:m1為酶解液中總氮質(zhì)量/mg;m2為原料中總氮質(zhì)量/mg。
1.3.4 酶解物螯合活性的測定
參考范鴻冰等[8]方法并加以修改,將酶解物分別與3 種礦物離子在中性條件下螯合1 h。螯合后將溶液移入透析袋透析(截留分子質(zhì)量:100 D),透析24 h,共換超純水6 次。透析結(jié)束后記錄膨脹體積V,取5 mL透析后溶液于消化管內(nèi),加10 mL濃硝酸進行微波消解。將消解后溶液用超純水定容至100 mL,采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry ,ICP-MS)檢測出金屬離子質(zhì)量濃度ρ,并通過式(3)計算得出礦物離子與多肽的螯合率。
式中:ρ為檢測出金屬離子的質(zhì)量濃度/(mg/L);V為膨脹后體積/mL;n表示稀釋倍數(shù):m為金屬離子添加量/mg。
1.3.5 酶解物抗氧化活性鑒定
選擇分別與鈣、亞鐵、鋅3 種離子具有較高螯合活性的藍圓鲹蛋白酶解物,測定其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率、總還原力。
1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定
采用Chen Huaming等[9]的方法略做修改。0.007 9 g DPPH溶于100 mL無水乙醇,取0.5 mL樣品加0.5 mL無水乙醇作為空白記Aj,取0.5 mL無水乙醇加0.5 mL DPPH作為對照,記為A0,再取0.5 mL樣品與0.5 mL DPPH溶液混合,記為Ai。搖勻,室溫避光20 min,10 000 r/min離心10 min,在517 nm波長處測吸光度。按照公式(4)計算DPPH自由基清除率。
1.3.5.2 總還原力的測定
參照Ahmadi等[10]方法,略做改動,取1 mL樣品加入1 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液和1 mL質(zhì)量濃度為1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴振蕩20 min,再加入1 mL 10%(質(zhì)量分數(shù),下同)三氯乙酸,搖勻離心(10 000 r/min,10 min),取1 mL上清液,加入1 mL去離子水和0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液,50 ℃水浴10 min,在700 nm波長處測其吸光度,吸光度越大證明還原力越強。
1.3.6 氨基酸分析
參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。
2.1 酶解時間對蛋白水解度的影響
圖1 不同酶解時間對蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree
圖2 不同酶解時間對蛋白回收率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on protein recovery
用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶3 種蛋白酶對藍圓鲹魚肉進行酶解,酶解時間為1、2、4、6、8 h,滅酶后進行蛋白水解度的測定。由圖1可知,藍圓鲹蛋白的水解度隨酶解時間的延長逐漸增大,胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解8 h后水解度分別為24.71%、23.50%、27.80%。前6 h之內(nèi),水解度增幅明顯,在4~6 h之間,可能由于酶切位點較多,水解度的增幅較大,酶解6 h與8 h的水解度差異不明顯。由圖2可知,蛋白回收率也隨酶解時間的延長逐漸增大,前6 h增長明顯,之后增長緩慢。因此選擇6 h為本實驗最佳酶解時間。由圖1、2結(jié)果可知,堿性蛋白酶水解能力大于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。故對藍圓鲹魚肉水解效果由大到小依次為堿性蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶。
Nalinanon等[11]在鰹魚胃蛋白酶水解的魚肉的研究中,以2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) free radical,ABTS+·)、DPPH自由基清除率、亞鐵離子螯合率為抗氧化指標,發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與水解度存在密切關(guān)系。在不同的水解度條件下,蛋白酶解物中的多肽對自由基的清除率存在差異。所以,對蛋白水解度的研究必不可少。
2.2 酶解時間對螯合率的影響
圖3 鈣離子螯合率的測定Fig.3 Calcium ion chelating rates of different enzymatic hydrolysates at different hydrolysis times
圖4 亞鐵離子螯合率的測定Fig.4 Ferrous ion chelating rates of different enzymatic hydrolysates at different hydrolysis times
圖5 鋅離子螯合率的測定Fig.5 Zinc ion chelating rates of different enzymatic hydrolysates at different hydrolysis times
采用3 種酶水解藍圓鲹蛋白,分別與鈣、亞鐵、鋅3 種離子進行螯合反應(yīng),透析去掉未螯合的礦物離子,檢測并計算3 種礦物離子與酶解物的螯合率。
由圖3可知,當酶解時間達到6 h,木瓜蛋白酶解物與鈣離子的螯合率達到最大值96.78%,略高于胰蛋白酶解物,但明顯高于堿性蛋白酶解物。由圖4、5可知,在胰蛋白酶水解6 h條件下,亞鐵離子和鋅離子與胰蛋白酶解物具有最大螯合率96.63%和94.28%。當酶解時間達到8 h,3 種金屬離子的螯合率反而略有下降,原因可能是藍圓鲹蛋白被水解為小肽或更小的氨基酸,降低了其螯合活性。
盡管多肽結(jié)構(gòu)與金屬元素螯合活性的關(guān)系尚未被完全確定,但肽的分子質(zhì)量大小,氨基酸組成和種類確實影響多肽的金屬螯合活性。研究顯示,不同原料中肽的分子質(zhì)量在一定范圍內(nèi)與金屬離子的螯合活性存在關(guān)聯(lián),但不能簡單確定分子質(zhì)量大小與螯合活性的關(guān)系。Wang Chan等[12]從水解的芝麻蛋白中分離純化出6 種鋅離子結(jié)合肽,分子質(zhì)量均小于500 D。Seth等[13]在鐵螯合物不溶性雞肌肉蛋白消化組氨酸殘基作用的研究中發(fā)現(xiàn),螯合物中只有10%的鐵離子與小分子肽或氨基酸結(jié)合,多數(shù)鐵離子結(jié)合的肽分子質(zhì)量都大于10 kD。Torres-Fuentes等[14]在水解鷹嘴豆蛋白中多肽與鐵螯合活性的研究中發(fā)現(xiàn),含有組氨酸的肽段與鐵離子具有螯合活性。Lee等[15]從豬血中分離出鐵離子結(jié)合肽,主要由天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸組成。所以經(jīng)過不同酶,不同水解時間處理后的藍圓鲹蛋白多肽,具有不同的金屬離子螯合率,主要原因是由于酶切位點不同,形成不同分子質(zhì)量和氨基酸組成的肽鏈,以至于不同多肽與金屬離子的配位鍵存在差異。王子懷等[16]綜述了金屬離子與肽的螯合反應(yīng)機理,影響金屬離子與肽螯合活性的因素包括:氨基、亞氨基、羧基,及某些特殊種類的氨基酸,除此之外,有些肽類對金屬離子還具有吸附作用。
2.3 抗氧化活性
表2 DPPH自由基清除率、總還原力的測定Table2 DPPH radical scavenging activity and total reducing power
DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基,其乙醇溶液呈紫色,在517 nm波長處具有最大吸光度,當存在可供氫的抗氧化劑時,DPPH溶液顏色變淺吸光值變小[17]。由表2可知,3 種酶解物DPPH自由基半清除率(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的清除能力大于堿性蛋白酶,而前兩者相差較小。曹榮等[18]在刺參腸、性腺酶解多肽體外抗氧化作用研究中發(fā)現(xiàn),刺參腸酶解多肽對DPPH自由基IC50為3.31 mg/mL。張風(fēng)等[19]在蝦頭蝦殼蛋白質(zhì)酶解制備抗氧化肽的研究中,在最佳酶解工藝條下酶解液DPPH自由基清除率為96.58%,還原力為0.77,均與本實驗得到結(jié)果相似。
胰蛋白酶解物與木瓜蛋白酶解物抗氧化能力與礦物離子螯合活性顯著高于堿性蛋白酶,表明物離子螯合活性與其抗氧化特性存在關(guān)聯(lián),這與Carrasco-Castilla等[20]的研究結(jié)果一致。
蛋白酶解物的抗氧化活性與其氨基酸序列有關(guān),而這取決于所用酶的種類[21]。由于蛋白酶的酶切位點不同,所以經(jīng)不同蛋白酶處理后的蛋白可以獲得不同氨基酸序列和長度的活性肽[22]。為研究氨基酸組成與藍圓鲹酶解物金屬螯合活性與抗氧化活性的關(guān)系,對魚肉及胰蛋白酶解物進行氨基酸分析,結(jié)果如表3所示。
表3 藍圓鲹酶解液與魚肉中的氨基酸組成及含量Table3 Amino acid compositions ofDecapterus maru a dsi muscle aanndd its enzymatic hydrolysates %
研究表明,當多肽中天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸含量較高時,多肽與一些礦物離子表現(xiàn)出較強的螯合能力[23,27],由本實驗中氨基酸分析的結(jié)果可以知,經(jīng)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解的藍圓鲹蛋白酶解物中,天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸在總氨基酸中所占比例較大。從氨基酸組成的角度來看,藍圓鲹魚肉適合作為制備礦物元素結(jié)合肽的原料。造成螯合活性和抗氧化活性差異的主要原因除氨基酸組成差異外,還包括多肽的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的不同,需要對酶解物進行分離純化,進一步確定礦物元素結(jié)合肽的結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量大小。
有研究表明,肽的氨基酸序列與組成決定了其抗氧化活性,一級結(jié)構(gòu)是構(gòu)成活性肽抗氧化特性的因素之一。在肽鏈中氨基酸殘基會參與抗氧化的反應(yīng),通常是因為它們與過渡金屬元素螯合具有清除自由基的能力[28]。在半胱氨酸和蛋氨酸的殘基中,親核的含硫氨基酸側(cè)鏈和色氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸的芳香側(cè)鏈可以很容易地提供氫原子,因此這些氨基酸殘基被認為具有潛在的抗氧化活性,盡管它們在一定條件下也可能促進氧化反應(yīng)的進行[29]。大多數(shù)分離得到的抗氧化肽的N末端含有疏水性氨基酸(如亮氨酸和纈氨酸),并且多肽序列中含有賴氨酸、天冬氨酸、組氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸[30]。
本實驗以藍圓鲹為原料,期望通過水解度對酶解物螯合活性影響的研究,為制備礦物離子結(jié)合活性肽提供參考。實驗通過3 種蛋白酶對藍圓鲹魚肉進行酶解,在不同時間、水解度條件下研究酶解物的礦物離子結(jié)合活性。結(jié)果表明:酶解時間在6 h以內(nèi),3 種酶解物的礦物離子螯合活性隨著水解度的增大而增大,當酶解時間達到8 h,3 種酶解物螯合活性略微下降。藍圓鲹胰蛋白酶水物與亞鐵、鋅離子具有較高的螯合活性,螯合率高達96.63%、94.28%;木瓜蛋白酶解物與鈣離子具有較高的螯合活性,螯合率為96.78%。
研究同時發(fā)現(xiàn),藍圓鲹酶解物的礦物元素螯合活性與抗氧化活性之間存在相關(guān)性,礦物離子螯合活性較高的胰蛋白酶解物與木瓜蛋白酶解物的抗氧化活性也高于堿性蛋白酶解物。對酶解產(chǎn)物的氨基酸分析表明:具有較高螯合活性和抗氧化活性的酶解物中幾種特定的氨基酸含量占總氨基酸的比例較大。綜合以上分析,在特定水解度條件下,經(jīng)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解得到的藍圓鲹酶解物可具備較好的礦物離子螯合能力與抗氧化能力。
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Mineral Ion Chelating Activity of Enzymatic Protein Hydrolysates from Decapterus maruadsi Muscle
YANG Yiran1,2, HU Xiao1, YANG Xianqing1,*, LI Laihao1, CHEN Shengjun1, WU Yanyan1, LIN Wanling1, HUANG Hui1, MA Haixia1
(1. Key Laboratory of Aquatic Producut Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciencces, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023)
In this research, we studied the chelating activity of Decapterus maruadsi muscle hydrolyzed by three different proteases, trypsin, papain and alcalase, towards Ca2+, Fe2+and Zn2+. The results showed that the hydrolysates produced by trypsin (DH = 23.14%) had the highest chelating activity towards Fe2+and Zn2+with chelating rates of 96.63% and 94.28%, respectively. The hydrolysates by papain (DH = 22.0%) had the highest Ca2+chelating activity with a chelating rate of 96.78%. It was also shown that both enzymatic hydrolysates had good antioxidant activity. The half maximal inhibitory concentration (IC50) values of the trypsin and papain hydrolysates for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity were 3.74 and 3.64 mg/mL, respectively. In addition, the amino acid sequence analysis showed that the hydrolysates with higher contents of Glu, Asp and Lys had higher mineral ion chelating activity.
Decapterus maruadsi; hydrolysate; chelating activity; mineral ions; antioxidant
10.7506/spkx1002-6630-201703015
A
1002-6630(2017)03-0088-06
楊伊然, 胡曉, 楊賢慶, 等. 藍圓鲹蛋白酶解物的螯合礦物離子活性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3): 88-93. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201703015. http://www.spkx.net.cn
YANG Yiran, HU Xiao, YANG Xianqing, et al. Mineral ion chelating activity of enzymatic protein hydrolysates from Decapterus maruadsi muscle[J]. Food Science, 2017, 38(3): 88-93. (in Chinese with English abstract)
10.7506/ spkx1002-6630-201703015. http://www.spkx.net.cn
2016-06-30
國家海洋公益性項目(201305018);國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31301454);農(nóng)業(yè)部財政重大專項(NFZX2013);廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201401C02;Z2015008);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2015BAD17B03-02)
楊伊然(1991—),女,碩士研究生,研究方向為食品加工與功能食品。E-mail:yanyiran123@126.com
*通信作者:楊賢慶(1963—),男,研究員,本科,研究方向為水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。E-mail:yxqgd@163.com