毛 晶，王 鵬，王祖浩，方 麗，王 輯，閔偉紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

松仁谷蛋白抗氧化肽的分離純化及一級結(jié)構(gòu)鑒定

毛 晶，王 鵬，王祖浩，方 麗，王 輯，閔偉紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

利用堿性蛋白酶酶解制備松仁谷蛋白水解物，采用超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色譜對酶解物進行分離純化，并利用質(zhì)譜進行結(jié)構(gòu)鑒定。對質(zhì)譜結(jié)果進行從頭測序，篩選得到兩種抗氧化肽肽段Glu-Leu-Leu-Lys-Leu-His（ELLKLH）、Glu-Lys-Asp-Phe-His-Leu（EKDFHL）。經(jīng)固相合成后得到純度分別為99.67%和95.15%的肽段，對其進行抗氧化活性測定。結(jié)果表明，在濃度為1 000 μmol/mL時，ELLKLH和EKDFHL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率分別為38.26%和29.54%，鐵離子螯合率分別為56.44%和48.66%。

松仁谷蛋白；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

松子（Semen Pini Koraiensis）為松科植物油松、紅松等球果[1-2]。松仁是其可食用部分，富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等，營養(yǎng)價值高。一直以來開發(fā)利用僅限于直接食用和榨油，對于榨油的副產(chǎn)品蛋白資源的利用較少，因此對松仁蛋白進行高效利用具有重要意義[3]。

自由基在人體內(nèi)由正常的生理活動產(chǎn)生，過多會引發(fā)一系列慢性疾病如衰老、癌癥和心血管疾病等。近年來，從動物或植物中得到的蛋白水解物，表現(xiàn)出很強的抗氧化活性，如清除自由基、螯合金屬離子等[4-6]。肽類物質(zhì)的分離純化常用方法主要有以下幾種：超濾法、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法以及高效液相色譜法等。通常采用單一的分離純化手段不能達到理想的分離效果，普遍采用多種分離技術(shù)聯(lián)用的手段[7]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，越來越多的肽段被鑒定出來。生物活性肽通常含有3～20 個氨基酸殘基，它們的活性都是基于它們的分子大小、氨基酸組成和序列[8-9]。通常認為具有供氫或供電子能力的氨基酸殘基如酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）及組氨酸（His）等具有清除自由基的能力，疏水性的氨基酸殘基如亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）能夠增強肽抑制脂質(zhì)過氧化的能力，而酸性氨基酸殘基如谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）及堿性氨基酸殘基如組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）具有螯合金屬離子的能力。此外，甘氨酸（Gly）及脯氨酸（Pro）等也被報道對肽的抗氧化活性具有一定的貢獻[10-11]。

本實驗通過酶解松仁谷蛋白得到具有抗氧化活性的多肽，對其進行分離純化和結(jié)構(gòu)分析，得到具有高抗氧化活性的序列，并驗證其活性，為長白山松子資源的深度開發(fā)和綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松子來源于長白山地區(qū)紅松；松仁谷蛋白（蛋白含量77.54%）為實驗室自制。

堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L 丹麥諾維信公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、菲洛嗪、Sephadex G-25、Sephadex G-15 美國Sigma公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；ZY-1000切向流超濾系統(tǒng) 上海紫裕生物科技有限公司；HD-21-88紫外檢測器 上海琪特分析儀器有限公司；DBS全自動部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；BSA224S型分析天平 北京賽多利斯科學儀器儀器有限公司；FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；1200系列高效液相色譜儀 美國Agilent公司；SPECTRA-MAX190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 松仁谷蛋白的提取

松仁分離蛋白通過堿溶酸沉法制備。脫脂松子→堿提（1 mol/L NaOH，等電點9.8）→離心（5 000 r/min，10 min）→取上清液→酸沉（調(diào)至pH 4.8）→沉淀→離心（5 000 r/min，10 min）→取沉淀→水洗3 次→調(diào)pH 7.0→冷凍干燥→松子分離蛋白。

根據(jù)Osborne法[12-15]提取谷蛋白。

1.3.2 松仁谷蛋白酶解物的制備

采用優(yōu)化后得出的最優(yōu)酶解條件，配制底物質(zhì)量分數(shù)4%的蛋白懸液，以加酶量7 100 U/g（以底物計）加入堿性蛋白酶，酶解時間180 min，酶解溫度50.5 ℃，酶解pH 9.5，制備具有抗氧化活性的酶解產(chǎn)物[16-17]。

1.3.3 超濾處理

將蛋白水解產(chǎn)物用切向流超濾系統(tǒng)及Biomax改良聚醚砜復合膜包進行超濾處理，分別采用膜分子截流分子質(zhì)量為10 kD和3 kD的超濾膜進行分離，得到大于10 kD、3～10 kD、小于3 kD 3種分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物，分別收集，凍干，測定活性。

1.3.4 抗氧化活性測定

鐵離子螯合能力的測定：參照Lee等[18]的方法；DPPH自由基清除能力測定：參照Xie Zhengjun等[19]的方法；ABTS＋·清除能力的測定：參照Kong Baohua等[20]方法；蛋白含量的測定：采用福林-酚法[21-24]。

1.3.5 Sephadex G-25凝膠層析

將超濾得到的抗氧化活性最強組分，配成30 mg/mL溶液，過0.22 μm濾膜。采用Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（1.6 cm×80 cm）進行分離，上樣量3 mL，洗脫液為蒸餾水，洗脫流速0.5 mL/min，于280 nm波長處檢測，并收集組分。將分離得到的組分收集凍干，測定抗氧化活性。

1.3.6 Sephadex G-15凝膠層析

將1.3.5節(jié)抗氧化活性最強組分，配成30 mg/mL溶液，過0.22 μm濾膜。采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱（1.6 cm×80 cm）進行分離，上樣量3 mL，以蒸餾水為洗脫液，洗脫流速0.5 mL/min，于280 nm波長處檢測，收集組分，將其凍干，測定抗氧化活性。

1.3.7 反相高效液相色譜分析

取1.3.6節(jié)抗氧化活性較強的凍干樣品，配成10 mg/mL溶液，過0.22 μm濾膜。于1200液相色譜儀進一步分離純化，色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：雙蒸水＋0.1%三氟乙酸，流動相B：乙腈＋0.1%三氟乙酸），上樣量40 μL。洗脫流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫30 ℃。洗脫條件：0～30 min，95%～72% A；30～50 min，72% A；50～60 min，72%～95% A。按圖譜上的峰收集各組分，多次上樣、收集后凍干、驗證，測定各組分抗氧化活性。

1.3.8 質(zhì)譜鑒定

凍干的樣品用50 μL A相（5%乙腈＋0.1%三氟乙酸溶液）重溶，15 000×g離心15 min后，取上清液置入進樣瓶，進行在線液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜系統(tǒng)為nano ACQUITYUPLC，與色譜相連的質(zhì)譜為Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀。樣品先以10 μL/min的流速將其結(jié)合在trap柱上（PepMap C18柱，100 μm×2 cm，3 μm），然后再在分析柱（Acclaim PepMap C18柱，75 μm×15 cm）上進行分離。B相為（100%乙腈＋0.1%三氟乙酸），流速為300 nL/min。梯度分離條件為：0～40 min B相溶液體積分數(shù)由5%升高至45%，40～45 min由45%線性增加至80%，45～50 min保持80%不變，50～60 min由80%降至5%。質(zhì)譜采用正離子模式掃描，掃描范圍m/z 400～1 800（質(zhì)譜檢測由上海易算生物科技有限公司完成）。

1.3.9 松仁谷蛋白抗氧化肽的合成

純度為99.67%和95.15%的2種抗氧化肽由北京中科亞光生物科技有限公司合成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾各組分抗氧化性活性比較

松仁谷蛋白水解物經(jīng)超濾分離得到3 個組分，分別為A1（＜3 kD）、A2（3～10 kD）、A3（＞10 kD），測定其肽含量。凍干后配成質(zhì)量濃度為4 mg/mL溶液測定抗氧化活性。由表1可知，A1組分DPPH自由基清除率為102.78%，ABTS＋·清除率為131.79%，均高于另外兩個組分。A3鐵離子螯合率高于A1和A2。綜合考慮選擇A1組分進行下一步純化。

2.2 Sephadex G-25分離

圖1 Sephadex G-25凝膠層析圖譜Fig.1 Sephadex G-25 chromatogram

由圖1可知，A1組分經(jīng)Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析分離后得到3 個組分，分別為B1、B2、B3。將其配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，并比較3 個組分的抗氧化活性，見表2。

表2 Sephadex G-25分離抗氧化活性肽組分抗氧化活性Table2 Antioxidant activity of peptides isolated on Sephadex G-25 column

由表2可見，B3組分的鐵離子螯合率為84.03%，DPPH自由基清除率為69.87%，均高于另外兩組。B1組分的ABTS＋·清除率最高。綜合考慮選擇B3組分進行下一步純化。

2.3 Sephadex G-15分離

圖2 Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析圖譜Fig.2 Sephadex G-15 chromatogram

由圖2可知，B3組分經(jīng)Sephdex G-15分離后得到兩個組分，分別收集凍干，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，并比較2 個組分的抗氧化活性，見表3。

表3 Sephadex G-15分離抗氧化活性肽組分抗氧化活性Table3 Antioxidant activity of peptides isolated on Sephadex G-15 column

C2組分的鐵離子螯合率為153.68%，DPPH自由基清除率為88.12%，ABTS＋·清除率為176.64%，均高于C1組分，所以選擇C2組分進行下一步純化。

2.4 反相高效液相色譜分離

圖3為C2組分的反相高效液相色譜圖譜，C2組分經(jīng)液相色譜分離后，選取了其中響應(yīng)值較高、分離度較好的5 個組分進行收集，分別為F1、F2、F3、F4、F5。對以上5 個組分進行收集凍干，并配制成0.5 mg/mL的溶液進行抗氧化性質(zhì)測定。

圖3 C2組分反相高效液相色譜 分析圖譜Fig.3 RP-HPLC analysis of fraction C2

圖4 液相色譜組分DPPH自由基清除率比較Fig.4 Comparison of DPPH radical scavenging rates of the fractions isolated by RP-HPLC

對液相色譜分離后得到的5 個組分進行DPPH自由基清除率測定，結(jié)果見圖4，F(xiàn)2組分的DPPH自由基清除率達424.86%，高于其他各組分，所以選擇F2組分進行下一步純化（F2組分的肽含量為0.003 mg/mL，回收率為0.26%）。

2.5 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖5 F2組分的一級質(zhì)譜Fig.5 Mass spectrum of fraction F2

經(jīng)過一級質(zhì)譜（圖5）和二級質(zhì)譜，獲得片段的質(zhì)荷比（m/z），通過從頭測序（de novo sequence）的方法對F2組分進行分析[25-32]，以質(zhì)譜的可信度及抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系為標準對得到的肽段序列進行篩選。結(jié)果得到2 種多肽，氨基酸序列分別為Glu-Leu-Leu-Lys-Leu-His（ELLKLH）、Glu-Lys-Asp-Phe-His-Leu（EKDFHL），見圖6。

圖6 ELLKLH和EKDFHL的二級質(zhì)譜圖Fig.6 Tandem mass spectrum of ELLKLH and EKDFHL

2.6 合成肽的活性

ELLKLH和EKDFHL兩種多肽由北京中科亞光生物科技有限公司合成，分子質(zhì)量分別為751.93 D和787.88 D，純度為99.67%和95.15%。并對合成后的肽進行DPPH自由基清除率及鐵離子螯合率的測定，見圖7。

圖7 EKDFHL和ELLKLH的DPPH自由基清除率（A）和鐵離子螯合率（BB）Fig.7 DPPH radical scavenging rates (A) and iron ion chelating rates (B) of EKDFHL and ELLKLH

由圖7可知，兩種多肽都具有DPPH自由基清除能力及鐵離子螯合能力，且隨著濃度上升抗氧化能力增強。ELLKLH的DPPH自由基清除能力和鐵離子螯合能力具均高于EKDFHL。

3 結(jié) 論

本研究通過酶解松仁谷蛋白獲得高抗氧化活性的酶解產(chǎn)物。利用超濾系統(tǒng)、Sephadex G-25、Sephadex G-15和反相高效液相色譜分離純化得到液相組分F2，該組分DPPH自由基清除率達到424.86%。應(yīng)用Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀對組分F2進行結(jié)構(gòu)鑒定。最終鑒定出2 種多肽氨基酸序列為Glu-Leu-Leu-Lys-Leu-His（ELLKLH）和Glu-Lys-Asp-Phe-His-Leu（EKDFHL），分子質(zhì)量分別為751.93 D和787.88 D。經(jīng)固相合成2 種多肽，純度達到99.67%和95.15%。結(jié)果顯示：在濃度為1 000 μmol/mL時，ELLKLH和EKDFHL的DPPH自由基清除率分別為38.26%和29.54%，鐵離子螯合率分別為56.44%和48.66%。

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Isolation, Purif i cation and Structural Analysis of Antioxidant Peptides Derived from Gluten in Pinus koraiensis Sieb.et Zucc Nut Kernels

MAO Jing, WANG Peng, WANG Zuhao, FANG Li, WANG Ji, MIN Weihong*
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In this work, the enzymatic hydrolysate of pine nut gluten produced with alkaline protease was isolated and purified by ultrafiltration, Sephadex G-25, Sephadex G-15 and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). The structural characteristics of the purif i ed fractions were identif i ed by Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometry, and de novo sequencing was performed based on the mass spectral data. Two antioxidant peptides were obtained with amino acid sequence of Glu-Leu-Leu-Lys-Leu-His (ELLKLH) and Glu-Lys-Asp-Phe-His-Leu (EKDFHL), respectively. After solid-phase synthesis, the purity of the peptides was 99.67% and 95.15%, respectively. The results of antioxidant activities showed that the DPPH free radical scavenging rates of ELLKLH and EKDFHL at a concentration of 1 000 μmol/mL were 38.26% and 29.54%, respectively, and the iron ion chelating rates were 56.44% and 48.66%, respectively.

pine nut glutenin; isolation and purif i cation; structural identif i cation

10.7506/spkx1002-6630-201703010

TS209

A

1002-6630（2017）03-0059-05

毛晶, 王鵬, 王祖浩, 等. 松仁谷蛋白抗氧化肽的分離純化及一級結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(3)： 59-63. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703010. http：//www.spkx.net.cn

MAO Jing, WANG Peng, WANG Zuhao, et al. Isolation, purif i cation and structural analysis of antioxidant peptides derived from gluten in Pinus koraiensis Sieb.et Zucc nut kernels[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 59-63. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703010. http：//www.spkx.net.cn

2016-06-30

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102206）

毛晶（1990—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：980243889@qq.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程、糧油科學與深加工技術(shù)。E-mail：minwh2000@163.com