馬海燕，曹雪丹

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系，寧夏銀川750021；2.浙江省柑桔研究所，浙江臺(tái)州318026）

不同酵母發(fā)酵寧夏赤霞珠葡萄酒風(fēng)味分析

馬海燕1，曹雪丹2

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系，寧夏銀川750021；2.浙江省柑桔研究所，浙江臺(tái)州318026）

以寧夏產(chǎn)赤霞珠釀酒葡萄為原料，采用α-AstreeⅡ型電子舌和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)3種不同酵母釀造的干紅葡萄酒的口感及揮發(fā)成分進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用主成分分析進(jìn)行辨別。結(jié)果表明，3種酵母發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒pH值、可滴定酸含量等理化指標(biāo)存在顯著差異，且3種葡萄酒樣品可以被電子舌很好的區(qū)分，第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為97.92%和1.25%，總貢獻(xiàn)率為99.17%。同時(shí)，從這3種酵母發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒中共鑒定出52種化合物，主要包括醇類(lèi)化合物11種，酯類(lèi)化合物28種，酮和醛類(lèi)化合物4種，酸類(lèi)化合物5種，其他化合物4種；雖然主要香氣的組成基本相似，但不同香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量均存在差異。

酵母；赤霞珠；葡萄酒；電子舌；氣質(zhì)聯(lián)用

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）又名解百納，是優(yōu)良的干紅葡萄酒釀造品種，原產(chǎn)自法國(guó)波爾多（Bordeaux）地區(qū)，因其能夠適應(yīng)多種不同氣候，現(xiàn)已在世界各地普遍種植。我國(guó)最早于1892年引入山東煙臺(tái)后，又在90年代大量引進(jìn)，目前在河北、新疆、寧夏、山東、甘肅、四川等十幾個(gè)省均有種植。寧夏自治區(qū)位于中國(guó)西部，全區(qū)葡萄基地面積已達(dá)61萬(wàn)畝，其中釀酒葡萄53萬(wàn)畝，是我國(guó)集中連片最大的產(chǎn)區(qū)，2015年葡萄酒產(chǎn)量9.5萬(wàn)t，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值166億元，這些葡萄酒主要來(lái)自我國(guó)九大優(yōu)質(zhì)葡萄產(chǎn)區(qū)之一的賀蘭山東麓地區(qū)，該產(chǎn)區(qū)位于北緯37°43'～39°23'之間，日照充足，雨量適中，所產(chǎn)葡萄品質(zhì)優(yōu)良，自2003年4月國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局通過(guò)了對(duì)“賀蘭山東麓葡萄酒”原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護(hù)申請(qǐng)以來(lái)，現(xiàn)已逐漸成為世界知名的葡萄酒產(chǎn)區(qū)。其中赤霞珠約占該產(chǎn)區(qū)葡萄總種植面積的70%左右，因此赤霞珠干紅葡萄酒風(fēng)味、質(zhì)量的提高對(duì)寧夏葡萄酒產(chǎn)業(yè)及原產(chǎn)地域保護(hù)均具重要意義。

酵母菌是葡萄酒釀造的主要微生物，主導(dǎo)酒精發(fā)酵的進(jìn)行，不僅對(duì)葡萄酒的口感、香氣、質(zhì)量有很大影響，對(duì)葡萄酒特色和風(fēng)格的形成也至關(guān)重要。即便是同一品種，不同酵母釀造出的葡萄酒，其酒質(zhì)和風(fēng)味也大不相同，存在顯著差異[1]。目前葡萄酒中已被檢出香味物質(zhì)的揮發(fā)性化合物有1 000多種，其中400多種是在酵母的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，主要包括高級(jí)醇、酯、芳香酮、萜烯類(lèi)、脂肪酸和揮發(fā)性酚類(lèi)等[2-4]。如果用本土酵母發(fā)酵，還可生產(chǎn)出具有地區(qū)特色的葡萄酒。所謂本土酵母，是指從葡萄園、葡萄果實(shí)、自然發(fā)酵汁中分離篩選出具有地域性特征的野生酵母菌株。一個(gè)地區(qū)的酵母種群，在每年的生長(zhǎng)繁殖中，逐漸適應(yīng)了該地區(qū)的特殊自然條件，并與當(dāng)?shù)氐钠咸哑贩N形成了良好的共生關(guān)系，易于在葡萄酒發(fā)酵中起到主導(dǎo)作用[5]，賦予葡萄酒特有的風(fēng)味，釀造出獨(dú)具風(fēng)格和特色的地域性酒種[6-7]。但是，目前寧夏赤霞珠干紅葡萄酒的釀造多選用普通的商品酵母，這在一定程度上造成香氣等特征不突出，風(fēng)格不明顯，導(dǎo)致葡萄酒質(zhì)量的同質(zhì)化加劇等不足，長(zhǎng)期依賴(lài)進(jìn)口商品酵母甚至?xí)绊懕就临Y源的豐富性和多樣性，限制自然酵母菌選育的有效性。近年來(lái)，世界知名葡萄酒產(chǎn)地的本土酵母菌群已被廣泛關(guān)注，我國(guó)主要葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母種群的研究也越來(lái)越多。如姜?jiǎng)P凱等[8]及李雙石等[9]對(duì)中國(guó)葡萄酒產(chǎn)區(qū)本土酵母種群的多樣性進(jìn)行了概括研究，劉愛(ài)國(guó)[10]從寧夏賀蘭山東麓葡萄自然發(fā)酵汁中，分離得到葡萄酒相關(guān)酵母8個(gè)屬10個(gè)種等。而本土酵母在寧夏赤霞珠干紅葡萄酒的應(yīng)用及風(fēng)味研究鮮見(jiàn)報(bào)道。這項(xiàng)研究在一定程度上可為我國(guó)原產(chǎn)地域葡萄酒的分類(lèi)、鑒別提供科學(xué)參考，并對(duì)我國(guó)地域特色葡萄酒品牌的建立以及葡萄酒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

為了研究本土酵母對(duì)寧夏赤霞珠干紅葡萄酒風(fēng)味的影響，本試驗(yàn)采用電子舌和GC-MS分析技術(shù)對(duì)分別采用寧夏本土篩選的釀酒酵母和常用的進(jìn)口商品酵母釀造的3種赤霞珠干紅葡萄酒樣品進(jìn)行風(fēng)味及香味成分的鑒定，以期為寧夏赤霞珠干紅葡萄酒的優(yōu)化、鑒別和保護(hù)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄：赤霞珠，產(chǎn)自寧夏賀蘭山東麓鴿子山葡萄園。

酵母菌：安琪CECA型酵母（選自寧夏），上海鼎唐國(guó)際貿(mào)易有限公司提供，下稱(chēng)“安琪”；卓越XR型酵母（產(chǎn)自法國(guó)），寧夏諾盟生物科技有限公司提供，下稱(chēng)“諾盟”；Lalvin Clos型酵母（產(chǎn)自丹麥），上海杰兔工貿(mào)有限公司提供，下稱(chēng)“杰兔”。

氫氧化鈉、菲林試劑、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

α-AstreeⅡ型電子舌：法國(guó)Alpha M.O.S.公司；Agilent7890A型氣相色譜儀、Agilent5975C質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS的SPME萃取頭：美國(guó)Supelco公司；PB-10普及型pH計(jì)：德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的制備工藝

1.3.2 理化分析

pH的測(cè)定采用pH計(jì)法；總酸、還原糖和酒精度的測(cè)定分別按GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酸堿滴定法、直接滴定法和酒精計(jì)法[11]。

1.3.3 電子舌分析

1.3.3.1 電子舌校準(zhǔn)

校準(zhǔn)程序：將傳感器陣列在超純水中清洗10 s，然后使用0.01mol/L的鹽酸作為校準(zhǔn)液，在標(biāo)準(zhǔn)液中反應(yīng)120 s，如此重復(fù)8次。

1.3.3.2 電子舌診斷

診斷程序：傳感器陣列在超純水中清洗10 s，然后在0.01mol/L的鹽酸作為校準(zhǔn)液反應(yīng)120 s，在超純水中清洗10 s，0.01mol/L的NaCl校準(zhǔn)液反應(yīng)120 s，再次清洗10 s，最后在0.01mol/L的谷氨酸鈉校準(zhǔn)液反應(yīng)120 s，以上過(guò)程循環(huán)6次。上述3種標(biāo)準(zhǔn)溶液在主成分分析圖中的貢獻(xiàn)率必須達(dá)到99%以上，說(shuō)明儀器傳感器正常。

1.3.3.3 電子舌檢測(cè)

分別量取80mL試驗(yàn)樣品，與超純水交錯(cuò)擺放在自動(dòng)檢測(cè)盤(pán)上，編輯自動(dòng)檢測(cè)程序，使樣品檢測(cè)和清洗交錯(cuò)進(jìn)行。電子舌傳感器檢測(cè)時(shí)間120 s，每1秒采集1次數(shù)據(jù)，清洗時(shí)間：10 s，數(shù)據(jù)類(lèi)型：cleaning。按照該段程序測(cè)量2次后，傳感器響應(yīng)強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，每樣品重復(fù)檢測(cè)8次，選取后6次的測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

1.3.4 GC-MS分析

準(zhǔn)確量取5mL酒樣移入10mL鉗口樣品瓶中，加入2.60 g NaCl，20μL內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮（0.946mg/mL），聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器上60℃加熱平衡30min后，采用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附40min，插入GC進(jìn)樣口解析5min進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-WAX（30 m× 320μm×0.25μm），程序升溫，起始溫度40℃，保持3 min，以3℃/min升至160℃，保持2 min，再以8℃/min升至220℃，保持3min，進(jìn)樣口溫度250℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，離子化方式EI，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍為30 AMU/ sec～550AMU/sec。

定性分析：應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，并利用C6-C20正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算各個(gè)色譜峰的保留指數(shù)。分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST05a）進(jìn)行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行人工譜圖分析，確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)組成。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±S.E）表示。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵葡萄酒的理化分析結(jié)果

3種不同釀酒酵母發(fā)酵寧夏赤霞珠干紅葡萄酒的pH值、可滴定酸、還原糖和酒精度等理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 不同酵母發(fā)酵赤霞珠葡萄酒的理化指標(biāo)Table1 Physical-chemical indexes of Cabernet Sauvignon wines fermented by different yeast

由表1可知，“安琪”酵母發(fā)酵的赤霞珠葡萄酒的pH值和可滴定酸與“諾盟”和“杰兔”具有顯著差異（P＜0.05），其中“安琪”的pH值較低，且可滴定酸含量也比較低，這可能是因?yàn)槠咸丫浦兴岬膹?qiáng)弱程度和金屬離子的緩沖能力有關(guān)，導(dǎo)致pH值與酸度之間沒(méi)有必然的線(xiàn)性對(duì)應(yīng)的關(guān)系。同時(shí)，3種樣品的還原糖含量和酒精度也存在明顯的差異。

2.2 不同酵母發(fā)酵葡萄酒的電子舌分析結(jié)果

電子舌（electronic tongue，ET）是一種利用多傳感陣列感測(cè)液體樣品的特征響應(yīng)信號(hào)，通過(guò)信號(hào)模式識(shí)別處理及專(zhuān)家系統(tǒng)學(xué)習(xí)識(shí)別，對(duì)樣品進(jìn)行定性或定量分析的一類(lèi)新型分析測(cè)試技術(shù)設(shè)備[12-13]。主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是將多個(gè)指標(biāo)化為較少的幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)方法。采用PCA方法分析3種不同釀酒酵母發(fā)酵的寧夏赤霞珠干紅葡萄酒的電子舌響應(yīng)值結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同酵母釀造赤霞珠葡萄酒電子舌信號(hào)主成分分析圖Fig.1 Electronic tongue analysis results of Cabernet Sauvignon wines fermented by different yeast

由圖1可知，第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為97.92%和1.25%，總貢獻(xiàn)率為99.17%。這兩個(gè)主成分幾乎可以包含樣品的所有信息，“安琪”、“諾盟”和“杰兔”3個(gè)酵母發(fā)酵的干紅葡萄酒風(fēng)味成分的電子舌響應(yīng)值沒(méi)有重疊區(qū)域，區(qū)分度較好。并且，“安琪”酵母發(fā)酵的赤霞珠葡萄酒樣品的電子舌相應(yīng)信號(hào)分析值位于橫坐標(biāo)軸的負(fù)值區(qū)域，與“諾盟”和“杰兔”兩個(gè)樣品相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明3個(gè)樣品中“安琪”酵母發(fā)酵的葡萄酒風(fēng)味相對(duì)而言更加獨(dú)特，較易區(qū)分。

2.3 不同酵母發(fā)酵葡萄酒的GC-MS分析結(jié)果

3種不同釀酒酵母發(fā)酵寧夏赤霞珠干紅葡萄酒的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖如圖2所示。結(jié)合氣相色譜保留指數(shù)和有關(guān)文獻(xiàn)[1，14-20]從中鑒定出揮發(fā)性化合物的具體名稱(chēng)、保留時(shí)間及匹配度等分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 不同酵母發(fā)酵赤霞珠葡萄酒香氣成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC/MS total ion chrom atogram of volatile com pounds in Cabernet Sauvignon wines fermented by different yeast

表2 赤霞珠葡萄酒中揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table2 GC/MS analysis results of volatile components in Cabernet Sauvignon wines fermented by different yeast

續(xù)表2 赤霞珠葡萄酒中揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Continue table2 GC/MS analysis results of volatile components in Cabernet Sauvignon wines fermented by different yeast

由表2可知，從3種不同釀酒酵母發(fā)酵的寧夏赤霞珠干紅葡萄酒中共鑒定出52種化合物，主要包括醇類(lèi)化合物11種，酯類(lèi)化合物28種，酮和醛類(lèi)化合物4種，酸類(lèi)化合物5種，其他化合物4種。

從“安琪”酵母釀造的寧夏赤霞珠干紅葡萄酒中鑒定出52種化合物，占總揮發(fā)性成分的93.28%；其中，酯類(lèi)和醇類(lèi)化合物分別占61.37%和19.62%，是主要的揮發(fā)性成分。

從“諾盟”酵母釀造的寧夏赤霞珠干紅葡萄酒中鑒定出48種化合物，占總揮發(fā)性成分的93.33%；其中，酯類(lèi)和醇類(lèi)化合物分別占61.72%和19.94%，是主要的揮發(fā)性成分。

從“杰兔”酵母釀造的寧夏赤霞珠干紅葡萄酒中鑒定出49種化合物，占總揮發(fā)性成分的92.98%。其中，酯類(lèi)和醇類(lèi)化合物分別占62.63%和18.11%，是主要的揮發(fā)性成分。

其中環(huán)己烷、己酸乙酯、庚酸乙酯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇4種化合物并非3種葡萄酒樣品所共有，可能是不同釀酒酵母發(fā)酵香氣特征的重要化合物。

3 結(jié)論

1）3種酵母發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒中，本土酵母“安琪”發(fā)酵樣品的pH值和可滴定酸含量顯著低于其他二者（P＜0.05），且三者在還原糖含量和酒精度這兩個(gè)指標(biāo)也存在一定的差異。

2）α-AstreeⅡ型電子舌可以對(duì)3種樣品進(jìn)行很好的區(qū)分，其第1主成分的貢獻(xiàn)率高達(dá)97.92%，第1主成分和第2主成分的總貢獻(xiàn)率為99.17%。且本土酵母“安琪”發(fā)酵樣品的電子舌相應(yīng)信號(hào)分析值與“諾盟”和“杰兔”相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明其口感風(fēng)格更加獨(dú)特。

3）采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)從3種樣品中共鑒定出52種化合物，主要包括醇類(lèi)化合物11種（含量≥18.11%），酯類(lèi)化合物28種（含量≥61.37%），酮和醛類(lèi)化合物4種，酸類(lèi)化合物5種，其他化合物4種。其中本土酵母“安琪”發(fā)酵樣品中鑒定出化合物52種，高于“諾盟”48種和“杰兔”49種，說(shuō)明其香氣成分更加復(fù)雜。

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Flavour Analysis of Ningxia Cabernet Sauvignon Wine Fermentated by Different Yeast

MA Hai-yan1，CAO Xue-dan2
（1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Technology，Ningxia Polytechnic，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Zhejiang Citrus Research Institute，Taizhou 318026，Zhejiang，China）

Dry red wine was made by Cabernet Sauvignon planted in Ningxia.The taste and volatile components of wine samples which was fermented by three different yeast strains were analyzed by an α-Astree Ⅱelectronic tongue and gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）with principal component analysis.The results showed that its physical-chemical indexes like the pH and content of titratable acids in the wines fermented by three different yeast strains were quite different，and the three wine samples could be separated in different groups by the electronic tongue.In principal component analysis（PCA），the first and second principal component contributory ratio were 97.92%and 1.25%respectively，the two principal components could explain 99.17%of the total information.The main aromatic components of these wine samples were basically similar，52 aroma constituents were identified，contained 11 alcohols，28 esters，4 aldehyde and ketone compounds，5 acids and 4 others；but there were differences on the categories and contents of aroma components.

yeast strains；Cabernet Sauvignon；wine；electronic tongue；GC-MS

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.033

2016-08-31

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院（或?qū)幭膹V播電視大學(xué)）科研發(fā)展基金資助“寧夏本土釀酒酵母發(fā)酵葡萄酒的品質(zhì)分析”（XJ201501）

馬海燕（1982—），女（回），助教，碩士，研究方向：葡萄與葡萄酒。