羅佳，嚴敏嘉，李小芳，何祖新，吳純潔，*

（1.成都中醫(yī)藥大學，四川成都611137；2.四川得恩德藥業(yè)有限公司，四川綿陽612000）

固態(tài)發(fā)酵紅曲中多糖含量測定方法的比較研究

羅佳1，嚴敏嘉1，李小芳1，何祖新2，吳純潔1，*

（1.成都中醫(yī)藥大學，四川成都611137；2.四川得恩德藥業(yè)有限公司，四川綿陽612000）

建立苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸顯色測定固態(tài)發(fā)酵紅曲中可溶性多糖含量的方法，并進行兩種方法的比較研究。固態(tài)發(fā)酵紅曲采用水提取紅曲多糖，所得多糖提取液用淀粉酶去除淀粉、Sevag試劑去除蛋白質，并經(jīng)醇沉得到紅曲多糖，再分別考察苯酚-硫酸和蒽酮-硫酸法兩種多糖含量測定方法的線性關系、重復性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率等指標。苯酚-硫酸法在30μg～70μg范圍內線性關系良好（R2=0.998 1），蒽酮-硫酸法在40μg～120μg范圍內線性關系良好（R2=0.999 7）。兩種方法學考察結果均較好，且測定紅曲多糖的含量苯酚-硫酸法為2.51%，蒽酮-硫酸法為2.52%，兩種方法結果相近。苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法均能用于測定固態(tài)發(fā)酵紅曲多糖含量。

紅曲；多糖；含量測定；苯酚-硫酸法；蒽酮-硫酸法

紅曲由紅曲霉屬真菌接種于大米發(fā)酵而成，是一種食療兼?zhèn)涞膫鹘y(tǒng)中藥。明代《本草綱目》記載：“紅曲，性溫、味甘，消食活血，健脾燥胃”[1]。近年來的研究表明紅曲中的多糖成分具有抗癌[2]、抗腫瘤[3]、增強機體免疫力[4]等功能。但目前對固態(tài)發(fā)酵紅曲中多糖的含量測定方法鮮有文獻報道，為此本文采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定紅曲多糖的含量，以期為紅曲多糖的含量測定提供科學參考。

1 材料

1.1 原料

固態(tài)發(fā)酵紅曲樣品：由四川得恩德藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑

D（+）-無水葡萄糖（批號：MUST-15041507）：中國科學院成都生物研究所；α-淀粉酶：sigma公司；苯酚、蒽酮、濃硫酸、乙醇、正丁醇、三氯甲烷（均為分析純）：成都市科化工試劑廠。

0.1 %蒽酮-硫酸試劑[5]：取0.1 g蒽酮溶于100mL冷卻的80%硫酸溶液中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器

BP211D AG型電子天平：德國Satorius；電熱恒溫水浴鍋：北京國華醫(yī)療器械廠；UV-6000型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；UPT-I-10T型超純水器：成都超純科技有限公司；SHZ-O（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發(fā)儀RE-2000B：上海亞榮生化儀器廠。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱定紅曲細粉2.00 g，采用回流法水提多糖，提取3次，每次1 h，合并提取液。提取液加入1%α-淀粉酶，于60℃水浴保溫水解淀粉，直至提取液遇碘水不變藍即淀粉水解完全，隨后沸水浴加熱5min滅活淀粉酶。再利用Sevag法去除提取液中的蛋白質，按體積比為5∶1（提取液：Sevag試劑）加入Sevag試劑，振搖后離心，上清液再加入Sevag試劑，重復操作直至無沉淀。

去除蛋白后的提取液濃縮至10mL，再加入無水乙醇使其乙醇體積分數(shù)達80%，醇沉24 h。醇沉后離心得到的沉淀即為紅曲多糖。紅曲多糖沉淀用水溶解并定容至50mL，即得供試品溶液。

2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

2.2.1 標準曲線的制備

葡萄糖對照品溶液的配制：精密稱取經(jīng)過105℃恒溫干燥24 h的無水葡萄糖對照品10mg，定容至100mL容量瓶，搖勻即得0.1mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

標準曲線的繪制：精密量取葡萄糖對照品溶液0.0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，置具塞試管中，分別加水補至1.0mL，再加入5%的苯酚溶液1mL，然后迅速加入濃硫酸5mL，混勻，沸水浴反應15min后用冰水終止反應。以第一份為空白對照，紫外-可見分光光度法在485 nm處測定吸光度。以葡萄糖的含量（μg）為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得到回歸方程：y= 0.010 4x+0.007，R2=0.998 1（葡萄糖含量線性范圍：30μg～70μg），結果見圖1。

圖1 苯酚-硫酸法葡萄糖標準曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose determination by phenol-sulfuric acid method

2.2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

精密量取供試品溶液1mL定容至50mL容量瓶，定容得待測樣品液。精密量取1mL待測樣品液置具塞試管中，加入5%苯酚水溶液1mL，然后迅速加濃硫酸5mL，混勻，沸水浴反應15min后冰水冷卻終止反應，以水為空白同法顯色為空白對照。

2.2.3 檢測波長的確定

以水空白為對照，對葡萄糖對照品溶液和供試品溶液顯色后在400 nm～800 nm波長范圍進行掃描測定。結果確定兩者在485nm有最大吸收，故確定485 nm為顯色波長。

2.2.4 重復性試驗

取同一批固態(tài)紅曲粉末6份，樣品按照2.1項下供試品制備的方法同時制備6份供試品溶液，照2.2.2項顯色后分別測定其吸光度A，分別為：0.217、0.219、0.212、0.210、0.211、0.215，結果RSD值為1.80%。本方法重復性良好。

2.2.5 精密度試驗

取一份供試品溶液，照2.2.2項顯色后，連續(xù)測定其吸光度值6次。吸光度分別為：0.217、0.218、0.218、0.219、0.217、0.217，結果RSD值為1.29%。證明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取一份供試品溶液，照2.2.2項顯色后，每隔10分鐘測定其吸光度。結果在1h之內，吸光度值分別為：0.217、0.217、0.216、0.215、0.214、0.214，RSD值為1.13%。結果表明，樣品液顯色后在1 h內吸光度值基本穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗

取同一批樣品6份，依2.1項制備供試品溶液，照2.2.2項下顯色測定供試品溶液多糖含量。然后取已知含量的供試品溶液加入相當含量的葡萄糖標準液，再同法測定多糖含量，并計算回收率?；厥章式Y果如表1所示。

表1 苯酚-硫酸法加樣回收率測定結果Table1 Sample recovery determination results of phenol-sulfuric acid method

2.3 蒽酮-硫酸法測定紅曲多糖含量

2.3.1 標準曲線的制備

按照2.2.1項下配置0.1mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別取0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL葡萄糖標準液至于具塞試管中，加水補至2.0mL，再加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6mL，混勻，沸水浴反應15min后冰水冷卻15min終止反應，以第一份為空白，紫外-可見分光光度法在625 nm處測定吸光度，以葡萄糖的含量（μg）為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得回歸方程y= 0.004 6x-0.006，R2=0.999 7，（葡萄糖含量線性范圍：40μg～120μg）結果見圖2。

圖2 蒽酮-硫酸葡萄糖標準曲線圖Fig.2 Standard curve of glucose determination by anthronesulfuric acid method

2.3.2 蒽酮-硫酸法測定多糖含量

精密量取供試品溶液1mL定容至50mL容量瓶，定容得待測樣品液。精密量取樣品液2mL，加0.1%蒽酮-硫酸試劑6mL，迅速搖勻，沸水浴反應15min后冰水浴15min終止反應，以水為空白同法顯色為空白對照。

2.3.3 檢測波長的確定

以水空白為對照，對葡萄糖對照品溶液和樣品溶液顯色后在400 nm～800 nm波長范圍進行掃描測定。結果表明兩者在625 nm有最大吸收，故確定625 nm為檢測波長。

2.3.4 重復性試驗

取同一批固態(tài)紅曲粉末6份，樣品按照2.1項下供試品制備的方法同時制備6份供試品溶液，照2.3.2項顯色后分別測定其吸光度A，結果為：0.179、0.181、0.178、0.180、0.177、0.179，重復性RSD值為0.79%。本方法重復性良好。

2.3.5 精密度試驗

取一份供試品溶液，照2.2.2項顯色后連續(xù)測定其吸光度值6次。結果為：0.179、0.179、0.18、0.178、0.178、0.178結果精密度RSD值為0.46%。儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

取一份供試品溶液，照2.2.2項顯色后分別在每隔10min測定其吸光度。在1 h之內結果：0.179、0.179、0.177、0.176、0.175、0.174，RSD值為1.17%。結果表明，供試品溶液在1 h內吸光度值基本穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗

取同一批樣品6份，依2.1項下方法制備供試品溶液，照2.3.2項下顯色測定供試品溶液多糖含量。然后取已知含量的供試品溶液加入相當含量的葡萄糖標準液，再同法測定多糖含量，計算回收率?；厥章式Y果如表2所示。

表2 蒽酮-硫酸法加樣回收率測定結果Table2 Sample recovery determination results of anthronesulfuric acid method

2.4 樣品中多糖含量測定結果

取同一批樣品3份按2.1項制備供試品溶液，分別按照2.2.2項下苯酚-硫酸法和2.3.2項下蒽酮-硫酸法顯色測定吸光度，根據(jù)標準曲線，按照式（1）計算紅曲多糖含量，結果見表3。苯酚-硫酸法測定紅曲多糖含量平均值為2.51%，蒽酮-硫酸法的平均值為2.52%，兩者的測定結果接近。

式中：B為根據(jù)標準曲線計算樣品中葡萄糖的質量，μg；D為稀釋倍數(shù)；f為單位換算因子；m為樣品取樣量，g。

表3 紅曲多糖含量測定結果Table3 Results of the determination of the polysaccharide content of red yeast rice

3 討論

固態(tài)發(fā)酵紅曲以大米為發(fā)酵基質，其本身含大量的淀粉，在前期預試驗中發(fā)現(xiàn)在提取多糖的同時也提取出了大量的淀粉，而淀粉在多糖含量測定時同樣會被濃硫酸水解成單糖類物質而顯色，極大影響測定結果的準確性。因此本研究采用α-淀粉酶去除提取液中的淀粉，并用Sevag法去除提取液中的蛋白質，盡量排除干擾，提高了含量測定結果的準確度。

本試驗同時利用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定固態(tài)發(fā)酵紅曲多糖含量，兩種方法線性關系、精密度、穩(wěn)定性、重復性均較好（RSD＜2%），加樣回收率在95%～105%之間，同一批次紅曲樣品中苯酚-硫酸法測得紅曲多糖平均含量為2.51%（n=3），蒽酮-硫酸法測定平均含量為2.52%（n=3），兩種方法測定結果接近且無差異性，表明兩種方法均能用于固態(tài)發(fā)酵紅曲多糖的含量測定。

[1]李時珍.本草綱目[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1975:1547

[2]Pengrong Wang,Danfeng Chen,Donghua Jiang,et al.Alkali extraction and in vitro antioxidant activity of Monascus mycelium polysaccharides[J].Journal of Food Science and Technology,2014,51(7): 1251-1259

[3]成曉霞,陳澤雄.紅曲抗腫瘤活性研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥, 2011,13(3):43-45

[4]Chen Hung-Hui,Chen Yu-Yawn,Yeh Jay-Z,et al.Immune-stimulated antitumor effect of different molecular weight polysaccharides from Monascus purpureus on human leukemic U937 cells[J].CyTAJournal of Food,2014,12(2):134-140

[5]楊秀英,王書林.蒽酮-硫酸比色法測定枇杷葉中可溶性多糖的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2008,4(8):26-27

Compare Study on Quantity Determine Method of Polysaccharide of Red Yeast Rice

LUO Jia1，YAN Min-jia1，LI Xiao-fang1，HE Zu-xin2，WU Chun-jie1，*
（1.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，Sichuan，China；2.Sichuan Sino-Dandard Pharmaceutical Co.，Ltd.，Mianyang612000，Sichuan，China）

The establishment of quantity determine method of polysaccharide of red yeast rice by phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method was developed，and then two methods were compared.The polysaccharide was obtained with the water extraction from red yeast rice.The starch was removed from polysaccharide extracts by amylase，while the protein removed by Sevag reagent.Then the polysaccharide was obtained by ethanol precipitation.And then the study was taking on the linearity，repeatability，stability，precision and recovery index of phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method.The linearity of the phenol-sulphuric acid method（R2=0.998 1）was 30μg-70μg，and the anthrone-sulphuric acid method（R2=0.999 7）was40μg-120μg.The results of the two methods were good，and the determination of the polysaccharide content of red yeast rice by the two methods was 2.51% and 2.52%.The results of the two methods were similar. The phenol-sulfuric acid method and anthrone-sulfuric acid method can be used for the determination of the polysaccharide content of red yeast rice.

red yeast rice；polysaccharide；quantity determine；phenol-sulfuric acid method；anthronesulfuric acid method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.028

2016-11-08

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項（201507004）；四川省科技廳苗子工程項目（2016RZ0037）

羅佳（1985—），女（漢），講師，在讀博士研究生，研究方向：中藥炮制制劑。

*通信作者：吳純潔，研究員，博士生導師，研究方向：中藥炮制制劑。