張澤生，郭擎，高山，王春龍，孫艷偉，李銘

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300457）

不同提取方法對迷迭香提取及抗氧化效果的影響

張澤生1，2，郭擎1，高山1，王春龍1，孫艷偉1，李銘1

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300457）

為了進(jìn)一步優(yōu)化迷迭香抗氧化劑的提取方法，采用響應(yīng)面法分析回流提取和超聲輔助提取對迷迭香粗提物中總酚含量的影響，并通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)來評價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，回流法提取迷迭香的最佳工藝條件為：乙醇濃度80%，溫度80℃，時(shí)間1 h，料液比1∶10（g/mL），得到總酚含量為33.85mg/g。超聲輔助提取迷迭香的最佳工藝條件為：溫度50℃，時(shí)間40min，料液比1∶10（g/mL），乙醇濃度80%，得到總酚含量為36.58mg/g。超聲輔助提取物的抗氧化效果優(yōu)于回流提取物。

迷迭香；響應(yīng)面；抗氧化

長期以來，人們一直使用合成抗氧化劑進(jìn)行食品及油脂類的抗氧化和保鮮。研究表明，傳統(tǒng)合成抗氧化劑如叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等本身可能具有潛在毒性，對人體造成危害[1]。另外合成抗氧化劑在高溫時(shí)容易逸失[2]。所以具有安全性高、抗氧化能力強(qiáng)等特點(diǎn)的天然抗氧化劑日益受到重視。迷迭香是具有高效抗氧化效果的植物。在我國，對迷迭香的研究開展較晚，1992年常靜[3]等通過研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物具有高效的抗氧化效果且強(qiáng)于合成抗氧化劑BHT。目前，迷迭香的主要提取方法有回流法、超聲輔助提取法以及超臨界萃取法[4-6]。但是在以往的提取研究中往往只針對某一種有效成分。除鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚外，迷迭香提取物中還有其他酚類成分，并且各抗氧化成分之間存在協(xié)同作用，因此不能就某一種成分的含量來簡單的判斷抗氧化劑的優(yōu)劣，迷迭香抗氧化劑的提取方法有必要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。本文旨在研究不同提取方法對迷迭香提取物的總酚含量以及抗氧化效果的影響。為尋找高效、經(jīng)濟(jì)、快速的迷迭香提取方法提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料

迷迭香葉：安徽勝豪中藥材銷售有限公司；福林酚試劑、TPTZ、DPPH、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%）：鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.SY11-Ni2電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；SB25-12DTDN超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；SP-2102UV紫外分光光度計(jì)：日本島津有限公司。

2 方法

2.1 Folin-Ciocalteu法測定總酚含量

精確稱取10mg沒食子酸標(biāo)品，置于10mL容量瓶中，加95%乙醇適量，溶解后定容至刻度，搖勻，即得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

精確量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，分別置于10mL容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，即得沒食子酸工作液，濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/mL。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確量取1mL不同濃度的沒食子酸工作液，加入5 mL 10%的福林酚溶液，搖勻，靜置5 min，再加入4mL 7.5%的Na2CO3溶液，搖勻，靜置60min。以相應(yīng)的試劑為空白，在765 nm波長處測定其吸光度值。以沒食子酸工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.2 樣品中總酚含量的測定

精確稱量提取液濃縮至干后所得提取物，用乙醇溶解定容至10mL的容量瓶中，稀釋至合適的濃度，測定條件和方法同“2.1.1”項(xiàng)下。

2.2 提取工藝條件優(yōu)選

2.2.1 回流法提取

2.2.1.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為自變量，以總酚含量為響應(yīng)值，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 回流法響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table1 Independent variables and their levels used in the response surface design of reflux method

2.2.1.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取5 g除去精油的迷迭香粉末，以一定體積的乙醇在一定溫度下進(jìn)行回流提取2次，過濾，合并濾液，濃縮至干，測定其中總酚含量。

2.2.2 超聲波輔助提取

2.2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為自變量，以總酚含量為響應(yīng)值，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表2。

表2 超聲輔助提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table2 Independent variables and their levels used in the response surface design of ultrasonic assisted method

2.2.2.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取5 g除去精油的迷迭香粉末，以一定體積的乙醇在一定溫度下進(jìn)行超聲波輔助提取2次，過濾，合并濾液，濃縮至干，測定其中總酚含量。

2.3 不同提取方法所得抗氧化劑的的抗氧化性測定

通過響應(yīng)面試驗(yàn)可得到回流法提取和超聲輔助提取的較優(yōu)提取工藝，在較優(yōu)工藝條件下提取迷迭香并進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)。

2.3.1 DPPH自由基清除率的測定

精確稱量5mg DPPH溶于200mL 80%乙醇中得DPPH乙醇溶液，加樣后立即用漩渦振蕩器混勻，暗反應(yīng)30min后于517 nm下測定吸光度。按照下面公式計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為1mLDPPH溶液+0.2mL樣品溶劑的吸光度值；Ai為1mLDPPH溶液+0.2mL樣液的吸光度值；Aj為1mL無水乙醇+0.2mL樣液的吸光度值。

2.3.2 ABTS+自由基清除率的測定

用pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液和7mmol/L ABTS溶液；將過硫酸鉀溶液和ABTS溶液按體積比1∶1的比例混合，即為ABTS儲備液，室溫下保存12 h～16 h，備用，將ABTS+·儲備液用乙醇稀釋至吸光度值為0.700±0.02。精確量取100μL不同濃度樣品溶液，加入900μL稀釋后的ABTS+·溶液，以乙醇代替樣品為空白，室溫下反應(yīng)1 min，在734 nm處測定吸光度，分別記為A樣和A空，按下式計(jì)算清除率。

2.3.3 迷迭香提取物總還原力測定

精確量取200μL不同濃度的樣品溶液，依次加入500μL磷酸鹽緩沖液（pH值為6.6，0.2 mol/mL）及500μL 1%的K3Fe（CN）6溶液，于50∶的水浴中反應(yīng)20min后冷卻至室溫，加入500μL 10%的三氯乙酸溶液，充分反應(yīng)后，精確量取500μL反應(yīng)液，并加入500μL蒸餾水和100μL 0.1%的FeCl3溶液，混勻后反應(yīng)10min，在700 nm處測定吸光度。

2.3.4 FRAP法測定迷迭香提取物總抗氧化能力

2.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3溶液和0.3mol/L醋酸鈉溶液按體積比1∶1∶10的比例混合，即為TPTZ工作液。精確量取100μL不同濃度的FeSO4溶液，加入900μL提前預(yù)熱至37℃的TPTZ工作液，混勻后反應(yīng)10min，在593nm處測定吸光度。以FeSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.4.2 樣品總抗氧化能力的測定

精確量取100μL不同濃度的樣品，測定方法和條件同“2.3.4.1”項(xiàng)下，結(jié)果以FeSO4濃度表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=18.171x-0.009 3，R2=0.999 0。表明沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of GallicAcid

3.2 回流法響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 回流法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 RSM design and total phenolic compounds of reflux method

利用Design-Expert8.0.6軟件對表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程：Y=33.39-1.75A-0.55B+3.87C+0.79D-2.33AB-0.27AC-0.22AD-0.28BC-0.59BD+0.28CD-7.43A2-3.32B2-6.07C2-3.03D2。

各因素方差分析見表4。

從表4中可以看出，該回歸模型極顯著（P＜0.0001）。失擬項(xiàng)P=0.8101，不顯著，說明該模型可用于檢測。修正R2為96.52%，說明總變異種僅有3.48%不能用該模型解釋。R2=98.26%，表明迷迭香提取物中總酚含量的預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較好的擬合度。因此該模型可用于預(yù)測、分析迷迭香提取物中總酚的實(shí)際含量。

表4 回流法提取回歸模型的方差分析Table4 Analysis of variance of regression equation by reflux method

另外從表4中還可以看出，4個因素中只有溫度對總酚含量影響不明顯，其余3個因素對提取物中的含量都有顯著影響。乙醇濃度和溫度（AB）對總酚含量的交互影響顯著，而其余幾個交互作用不顯著。

經(jīng)響應(yīng)面分析得到，回流法提取的優(yōu)化工藝條件為乙醇濃度78.85%、溫度79.29℃、時(shí)間1.16 h、料液比1∶10.32（g/mL），預(yù)測總酚含量為34.21mg/g。實(shí)際操作中修正后條件為乙醇濃度80%、溫度80℃、時(shí)間1 h、料液比1∶10（g/mL），得到總酚含量為33.85mg/g。與預(yù)測值基本一致，表明經(jīng)過響應(yīng)面得到的提取條件可行。

3.3 超聲輔助提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 超聲輔助提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table5 RSM design and total phenolic compounds of ultrasonic assisted method

續(xù)表5 超聲輔助提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table5 RSM design and total phenolic compounds of ultrasonic assisted method

利用Design-Expert8.0.6軟件對表5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程：

各因素方差分析見表6。

表6 超聲輔助提取回歸模型的方差分析Table6 Analysis of variance of regression equation by ultrasonic assisted method

續(xù)表6 超聲輔助提取回歸模型的方差分析Continue table6 Analysis of variance of regression equation by ultrasonic assisted method

從表6中可以看出，該回歸模型極顯著（P＜0.0001）。失擬項(xiàng)P=0.8125，不顯著，說明該模型可用于檢測。修正R2為91.51%，說明總變異種僅有8.49%不能用該模型解釋。R2=95.75%，表明迷迭香提取物中總酚含量的預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較好的擬合度。因此該模型可用于預(yù)測、分析迷迭香提取物中總酚的實(shí)際含量。

另外從表6中還可以看出，幾個因素間的交互作用對總酚含量影響均不顯著。

經(jīng)響應(yīng)面分析得到，超聲輔助提取的優(yōu)化工藝條件為溫度49.09℃、時(shí)間40.87min、料液比1∶10.22（g/ mL）、乙醇濃度79.39%，預(yù)測總酚含量為36.04mg/g。實(shí)際操作中修正后條件為溫度50℃、時(shí)間40min、料液比1∶10（g/mL）、乙醇濃度80%，得到總酚含量為36.58mg/g。與預(yù)測值基本一致，表明經(jīng)過響應(yīng)面得到的提取條件可行。

3.4 抗氧化活性結(jié)果與分析

不同提取方法得到迷迭香提取物的體外抗氧化活性如圖2所示。

圖2 迷迭香提取物抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of rosemary extract

圖2 中可以看出，通過超聲輔助提取和回流法提取得到的迷迭香提取物都有明顯的抗氧化效果，且與濃度呈正相關(guān)，但在濃度較低時(shí)均不如VC。在DPPH自由基清除試驗(yàn)中超聲輔助提取物的IC50值為95.96μg/mL，回流提取物的IC50值為128.06μg/mL，VC的IC50值為10.30μg/mL。在ABTS+自由基清除試驗(yàn)中超聲輔助提取物的IC50值為66.75μg/mL，回流提取物的IC50值為91.06μg/mL，VC的IC50值為26.04μg/mL?？偟膩碚f，超聲輔助提取得到的迷迭香提取物抗氧化效果優(yōu)于回流法提取得到的迷迭香提取物。這是因?yàn)槌曒o助提取溫度較低，且超聲可以使細(xì)胞壁破碎，使最終得到的提取物中總酚含量較高?；亓魈崛t溫度較高，雖同樣可以使細(xì)胞壁破碎，但在提取過程中一些酚類物質(zhì)會發(fā)生分解及轉(zhuǎn)化，使提取物中總酚含量下降，從而不能達(dá)到預(yù)期的抗氧化效果。

4 結(jié)論

回流法提取迷迭香的最佳工藝條件為：乙醇濃度80%，溫度80℃，時(shí)間1 h，料液比1∶10（g/mL），得到總酚含量為33.85mg/g。超聲輔助提取迷迭香的最佳工藝條件為：溫度50℃，時(shí)間40min，料液比1∶10（g/ mL），乙醇濃度80%，得到總酚含量為36.58mg/g。超聲輔助提取較回流法提取，提取溫度更低，時(shí)間更短，提取物中總酚含量更高。

體外抗氧化試驗(yàn)表明，超聲輔助提取物與回流提取物的DPPH·、ABTS+·清除能力，總抗氧化能力以及還原力均與濃度呈正相關(guān)。超聲輔助提取物的抗氧化效果優(yōu)于回流提取物。因此，超聲輔助提取法更適用于迷迭香提取，超聲輔助提取得到的迷迭香提取物也可作為新型天然抗氧化劑。

[1]秦天蒼,于新華,葛寧,等.天然抗氧化劑在食用油中應(yīng)用價(jià)值探討[J].食品加工,2009,5(1):34-36

[2]Chang SS,Ostric-Matijasevic B,Hsieh OAL,et al.Natural antioxidants from rosemary and sage[J].Journal of Food Science,1977,42 (4):1102-1106

[3]常靜,肖緒玲,王奪元.我國引種的迷迭香抗氧化成份的分離和抗氧化性能研究[J].化學(xué)通報(bào),1992,3(7):30-35

[4]董文賓,田家樂,謝金玉,等.迷迭香天然食用抗氧化劑提取工藝研究[J].西北輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,9(2):47-51

[5]楊海麟,魯時(shí)瑛,楊勝利,等.迷迭香抗氧化劑的提取方法研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002,14(4):20-23

[6]黃紀(jì)念,屠鵬飛,蔡同一.迷迭香天然抗氧化劑的超臨界流體萃取工藝研究[J].食品添加劑,2003,24(10):131-132

Effects of Different Extraction Methods on the Extraction and Antioxidation of Rosemary

ZHANG Ze-sheng1，2，GUO Qing1，GAO Shan1，WANG Chun-long1，SUN Yan-wei1，LI Ming1
（1.School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Food Safety and Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center，Tianjin 300457，China）

In order to optimize the method for extracting rosemary antioxidant，response surface methodology was used to analyze the effect of reflux extraction and ultrasonic assisted extraction on the content of total phenolic compounds in crude extract of rosemary.The antioxidant activities of the crude extraction were evaluated in vitro antioxidant experiment.The results indicated that the highest extraction yield of total phenolic compounds using the reflux extraction could obtain up to 33.85mg/g under the following conditions：ethanol concentration of 80%as solvent，liquid to solid ratio of 1∶10（g/mL），extraction for 1h at the temperature of 80℃.The highest extraction yield of total phenolic compounds using the ultrasound-assisted extraction could obtain up to 36.58mg/g under the following conditions：ethanol concentration of 80%as solvent，liquid to solid ratio of 1∶10（g/mL），extraction for 40 min at the temperature of 50℃.The antioxidant effect of ultrasonic-assisted extraction was better than that of reflux extraction.

Rosemary；response surface；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.013

2016-05-05

張澤生（1956—），男（漢），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。