陳爽，朱顯峰

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封475004）

兩種酵素產(chǎn)品抗氧化活性分析

陳爽，朱顯峰*

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封475004）

試驗通過復(fù)合酵素對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力以及還原力的大小的測定，來評價、比較兩種酵素產(chǎn)品的體外抗氧化能力。結(jié)果表明：試驗范圍內(nèi)，酵素產(chǎn)品在體外的抗氧化性良好，抗氧化能力總體上與0.1g/L抗壞血酸相當(dāng)；其中，產(chǎn)品A的抗氧化性能優(yōu)于產(chǎn)品B，產(chǎn)品A的總酚含量可達280mg/mL。

酵素；自由基；還原力；總酚

酵素與人類的生活息息相關(guān)，近些年來，研究者越來越多的關(guān)注酵素的研究。酵素有個正式的名字--酶，它的產(chǎn)生類似堆肥的原理。它是以一種或多種水果、蔬菜為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而成[1]，這種經(jīng)復(fù)合發(fā)酵得到的棕色液體稱為混合發(fā)酵液。這種混合發(fā)酵液中除了含有酵素原材料中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)之外，還含有發(fā)酵過程中產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)，如各種酶、有機酸、酚類、氨基酸等。酵素在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有很廣泛的應(yīng)用，酵素也可預(yù)防現(xiàn)代文明病、解酒護肝、美容，并且其在女性的健康中也有著不可或缺的作用[2-5]。

傳統(tǒng)上，物質(zhì)與氧結(jié)合生成氧化物的過程稱為氧化，人體內(nèi)的氧化是一種生物化學(xué)過程。體內(nèi)的氧化伴隨著新陳代謝時時刻刻都在進行，氧化的結(jié)果會生成許多自由基，自由基或氧化劑會將細胞和組織分解，影響新陳代謝并加速衰老，進而引發(fā)各種健康問題。據(jù)文獻記載，衰老或許多疾病被證實與活性氧和自由基有關(guān)聯(lián)[6-8]。因此，若能夠消除過多的自由基，將會預(yù)防許多自由基引起的衰老及相關(guān)疾病?？寡趸瘎┑目寡趸钚灾饕憩F(xiàn)在抑制脂質(zhì)氧化降解、清除活性氧、清除自由基、螯合過渡金屬和還原能力等幾方面。酵素產(chǎn)品的抗氧化活性對活性氧與幾種自由基有顯著的清除作用，例如其中的超氧化物歧化酶（SOD）體內(nèi)活性氧的清除作用[9]。生物體內(nèi)對活性氧和自由基的清除作用，使其在生命研究領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

酚類物質(zhì)是很好的抗氧化劑[10]，如兒茶素能清除體內(nèi)的自由基，使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子狀態(tài)，阻斷其傳遞電子，阻止機體的氧化損傷；此外，兒茶素對Fe3+的還原能力，是VC相對還原能力的11.76%[11]。

酵素發(fā)酵液對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力，它對物質(zhì)的還原能力，以及其中含有的大量酚類物質(zhì)，賦予這種復(fù)合酵素在體外的抗氧化能力。酵素抗氧化活性對機體代謝有積極的影響，人體含有的酵素越多，人就越健康。實驗室將購于市場上的新鮮水果或蔬菜按一定比例，裝入5 L發(fā)酵罐中，密封，常溫常壓發(fā)酵半年，得到復(fù)合發(fā)酵液——以下統(tǒng)稱酵素產(chǎn)品，來進行體外抗氧化實驗。通過對酵素產(chǎn)品抗氧化活性的研究可以為酵素產(chǎn)品在醫(yī)藥健康等領(lǐng)域的進一步發(fā)展提供參考，提高人們的生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

將市售新鮮的富士蘋果、碭山梨、海南香蕉、巨峰葡萄以及白心火龍果作為A組，本地西紅柿、白蘿卜、芹菜、白菜、黃瓜作為B組，洗凈晾干，按照一定的質(zhì)量比，在超凈工作臺中加入適量的無菌白砂糖，均勻平鋪于5 L玻璃罐中，補水至刻度，密封，并定期釋放產(chǎn)生的氣體，避免染菌。利用各種水果自身攜帶的微生物，使晝夜溫差保持在10℃，常壓密閉發(fā)酵半年，得到兩種酵素產(chǎn)品。

1.1.2 試驗試劑

Tris、鄰苯三酚、鹽酸、30%雙氧水、FeSO4、水楊酸、無水乙醇、DPPH、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、Folin-酚、碳酸鈉、焦性沒食子酸、抗壞血酸，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf5810R臺式高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司；PHB-1型便攜式酸度計：杭州真立龍儀器有限公司；CP213電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；FA124電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；INESA 752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；玻璃儀器氣流烘干器C型：河南省予華儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超氧陰離子自由基（O2－·）清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[11-12]。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2－·，生成黃色的中間產(chǎn)物，在325 nm處測定溶液的吸光度。利用抗壞血酸作為對照組。用石英比色皿于325 nm處測其OD值。

1.3.2 羥自由基（·OH）清除能力測定

H2O2與Fe2+混合反應(yīng)會產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。參照徐建東[12]的方法，利用此原理對酵素的羥基自由基清除能力進行測定?？箟难嶙鳛閷φ战M存在；用玻璃比色皿于510 nm處測其OD值。

1.3.3 DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定

DPPH自由基是較穩(wěn)定的有機自由基，其在甲醇溶液中呈紫色，在517 nm處有較強吸收峰，在有自由基清除劑存在時，DPPH醇溶液有褪色情況出現(xiàn)，其褪色程度與DPPH自由基被清除量有關(guān)，可用比色法進行定量[11]?？箟难嶙鳛閷φ战M存在；用玻璃比色皿于517 nm處測其OD值。

1.3.4 還原力與總酚含量的關(guān)系試驗

分別取兩種酵素產(chǎn)品額梯度稀釋液進行試驗，以蒸餾水作為空白對照，用玻璃比色皿于760 nm處測其OD值，根據(jù)線性方程A=0.018 4C+0.004 6，R2=0.999 7來計算總酚含量，其中：A為吸光度，C為樣品濃度（mg/mL）[12]。還原力的測定參照程德竹[13]的方法，以蒸餾水代替樣品作為空白對照；用玻璃比色皿于700 nm處分別測其OD值。以對應(yīng)濃度測得還原力的大小為橫坐標，總酚含量為縱坐標進行線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 對自由基清除能力及總酚含量的測定

按照公式：清除率/%=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100，計算酵素產(chǎn)品對自由基的清除率。其中：Ai是樣品測得的吸光度值，A0為水代替待測液時測得的吸光度值；Aj為水代替反應(yīng)試劑時待測液不同濃度下測得的吸光度值。

對自由基的清除能力見圖1。

圖1 對自由基的清除能力Fig.1 Free radicals scavenging ability

由圖1可以看出，兩種酵素產(chǎn)品對羥基自由基、超氧陰離子與DPPH自由基均有一定的清除能力，其中對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均在85%以上，而對羥基自由基的清除能力略低。就兩種酵素產(chǎn)品而言，產(chǎn)品A的整體清除能力較產(chǎn)品B高5%左右，且二者對超氧陰離子自由基的清除能力都高達90%以上；與0.1 g/L抗壞血酸相比，兩種酵素產(chǎn)品對超氧陰離子自由基的清除能力較高，而清除DPPH自由基的能力與抗壞血酸基本持平，羥基自由基的清除能力明顯低于抗壞血酸。

2.2 還原力與總酚含量的關(guān)系分析

隨酵素產(chǎn)品濃度的增加，其酚類物質(zhì)隨之增加，還原力水平也越來越高，并且還原力的增加與總酚濃度表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，產(chǎn)品A的總酚含量高于產(chǎn)品B，如圖2。兩種產(chǎn)品還原力與總酚含量的相關(guān)性R均可達到0.99。

圖2 還原力與總酚含量的相關(guān)性Fig.2 The correlation between reducing capacity and total phenol content

3 結(jié)論

本試驗通過兩種酵素產(chǎn)品對超氧陰離子自由基，羥自由基、DPPH自由基的清除能力以及還原力的大小的測定，發(fā)現(xiàn)酵素產(chǎn)品在體外的抗氧化性良好，抗氧化能力總體上與0.1 g/L抗壞血酸相當(dāng)；其中，產(chǎn)品A對自由基的清除能力與總酚含量均高于產(chǎn)品B，說產(chǎn)品A的抗氧化性能優(yōu)于產(chǎn)品B。由于酵素產(chǎn)品中含有具有抗氧化活性的酚類物質(zhì)，使其還原力非常高。產(chǎn)品A的總酚含量也高于產(chǎn)品B，可達280mg/mL。兩種酵素產(chǎn)品還原力與總酚含量的線性相關(guān)R均可達0.99，而酚類物質(zhì)是具有抗氧化活性的主要原因，其與抗氧化活性的線性相關(guān)可達0.97[15]，由此可知，表明還原能力與多種抗氧化機制有關(guān)。

酵素產(chǎn)品良好的抗氧化性能及其還原力與抗氧化機制的關(guān)系，引發(fā)以后對水果與蔬菜的綜合作用，來發(fā)酵更高質(zhì)量的酵素產(chǎn)品，為以后酵素產(chǎn)品的全面開發(fā)與應(yīng)用做好一定的鋪墊，將會推動果蔬復(fù)合酵素未來在人類健康方面的發(fā)展與應(yīng)用。

[1]毛建衛(wèi),吳元峰,方晟.微生物酵素研究進展[J].發(fā)酵科技通訊, 2010,39(3):42-44

[2]梁捷.生物酵素產(chǎn)業(yè)誕生記[N].光明日報,2015-05-19(008)

[3]劉麗華,張艷梅,王景芳,等.“動物酵素營養(yǎng)液”在家禽飼養(yǎng)上應(yīng)用效果[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問,2014(11):294-295

[4]李景松,姜忠麗.糙米酵素提取物抗氧化活性作用研究[J].農(nóng)業(yè)科技與設(shè)備,2015,6(6):60-64

[5]楊麗華.馬尾松松針抗氧化活性研究及其抗氧化功能飲料研制[D].廣州:廣州醫(yī)科大學(xué),2014

[6]蔣增良.天然微生物酵素發(fā)酵機理、代謝過程及生物活性研究[D].杭州:浙江理工大學(xué),2012

[7]Rattan S IS.Theories of biological aging:Genes,proteins,and free radicals[J].Free Radical Research,2006,40(12):1230-1238

[8]Chen H Y,Yen GC.Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of extracts from guava(Psidiumguajava L.)leaves[J]. Food Chemistry,2007,101(2):686-694

[9]張怡,路鐵剛.植物中的活性氧研究概述[J].生物技術(shù)進展, 2011,1(4):242-248

[10]李思荻.高抗氧化能力豆類的篩選及其黃酮類物質(zhì)消化吸收效果的評價[D].大慶:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2010

[11]趙文紅,鄧澤元,范亞葦,等.兒茶素體外抗氧化作用的研究[J].食品科技,2009(12):278-282

[12]徐建東.槲皮素衍生物的合成及其抗氧化活性研究[D].濟南:山東師范大學(xué),2013

[13]程德竹,杜愛玲,李成帥,等.生姜提取物對鄰苯三酚自氧化生成超氧自由基的清除[J].中國調(diào)味品,2014,39(11):35-39

[14]董銀卯,何聰芬,王領(lǐng),等.火龍果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技,2009(3):192-196

[15]陸健,樊偉,孔維寶,等.大麥總多酚不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008,27(1):57-61

[16]朱曉慶,陳義倫,張亞偉,等.紅茶菌發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化規(guī)律[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(11):111-114

Analysis on Antioxidant Activity of Two Natural-ferments

CHEN Shuang，ZHU Xian-feng*
（Institute of Bioengineering，College of Life Science，Henan University，Kaifeng475004，Henan，China）

In this experiment，the scavenging effect evaluated the antioxidant activity of two miciobial natural-ferments on·OH，O2－·，DPPH·and reducing capacity.The results showed that the two ferments both had well performance in vitro antioxidant activity and as excellent as ascorbic acid（0.1 g/L）.Ferments A was quite significant than B，its total phenol content was 280mg/mL.

natural-ferments；radical；reducing capacity；total phehol

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.008

2016-05-22

陳爽（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)專業(yè)，生物物質(zhì)分離方向。

*通信作者