蔣德生張曉麗祝濤王能昆李劍

(1云南瑞寶生物科技股份有限公司，云南 昆明 651701)

(2云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 651701)

注射用三七提取物的純化方法優(yōu)選

蔣德生1張曉麗2祝濤1王能昆1李劍1

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(2云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 651701)

本實(shí)驗(yàn)的主要目的是為了對(duì)三七提取物的純化方法進(jìn)行優(yōu)選，從而提高三七提取物的純度。其中需要采用明膠沉淀法、澄清劑法、石硫醇法、堿性醇沉法和大孔吸附樹(shù)脂法五種方法對(duì)于三七提取物進(jìn)行處理，同時(shí)根據(jù)三七總皂苷的轉(zhuǎn)移率、質(zhì)量分?jǐn)?shù)、雜質(zhì)的清除效果和復(fù)溶性的相關(guān)數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五種試驗(yàn)方法各有利弊，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中揚(yáng)長(zhǎng)避短。

三七；注射用三七提取物；純化；堿性醇沉法；大孔吸附樹(shù)脂法

實(shí)驗(yàn)小組人員通過(guò)對(duì)于純化實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，五種純化方法在單獨(dú)使用時(shí)不能實(shí)現(xiàn)最佳的實(shí)驗(yàn)效果。同時(shí)參考國(guó)內(nèi)外的先進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)后，采用堿性醇沉法和大孔吸附樹(shù)脂法相結(jié)合的方式以提純?nèi)咛崛∥铩?shí)驗(yàn)結(jié)果表明三七總皂苷的轉(zhuǎn)移率、質(zhì)量分?jǐn)?shù)、雜質(zhì)的清除效果和復(fù)溶性都出現(xiàn)一定程度的增長(zhǎng)，雜質(zhì)的清除效果較之前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較好復(fù)溶性較好。因此本文采用五種實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)于三七提取物進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行對(duì)比分析。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

隨著社會(huì)的發(fā)展及人們生活水平的提高，越來(lái)越多的患者受心腦血管疾病的折磨，對(duì)三七、其主要有效成分PNS及其制劑的需求日益劇增。其相關(guān)研究也越來(lái)越深入、透徹。與西醫(yī)的藥劑制作過(guò)程不同，中醫(yī)在藥劑的制作過(guò)程中格外重視中藥提取物的純化過(guò)程，如使用明膠沉淀法、澄清劑法、石硫醇法、堿性醇沉法和大孔吸附樹(shù)脂法五種方法來(lái)進(jìn)行三七提取物的純化。同時(shí)，在進(jìn)行實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)這五種提純方法各有利弊，在實(shí)際的應(yīng)用中，應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況、藥材用量等來(lái)確定采用合適的純化方法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。與此同時(shí)做好記錄工作，通過(guò)對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)方法從而選擇最有效、實(shí)驗(yàn)效果最佳的純化方法及流程，從而提高三七提取物的質(zhì)量以及達(dá)到國(guó)家相關(guān)的質(zhì)量要求標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀，用于藥劑的蒸發(fā)、提純過(guò)程；循環(huán)水式多用真空泵；PH值或酸度計(jì)；ZT?Cl+1天然澄清劑；HPD300型大孔吸附樹(shù)脂。

實(shí)驗(yàn)藥劑：五加科植物三七的干燥根莖；人參皂普Re對(duì)照品；α-萘酚；香草醛；冰醋酸；無(wú)水乙醇。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：首先，取適量三七藥材加入13倍量30%的無(wú)水乙醇在70℃條件下進(jìn)行加熱回流，持續(xù)加熱40分鐘，以上步驟重復(fù)兩次。同時(shí)將三七溶解液進(jìn)行過(guò)濾處理后，取適量的三七提取液，加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液、0.8mL高氯酸溶液并將試管密封緊塞后搖勻，在60℃水浴條件下進(jìn)行恒溫加熱15min后立即取出冷卻。在向溶解液內(nèi)加入5mL冰醋酸搖勻,記錄吸光、分光度值。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)純化后的總皂苷質(zhì)量是純化前的1.33倍，并且這兩者之比相當(dāng)于三七總皂苷的轉(zhuǎn)移率；并且純化后的三七總皂苷固體物的總量為純凈度。根據(jù)相關(guān)理論說(shuō)明將純化后干燥冷卻的固體物1mg加水10mL振搖溶解，同時(shí)加入檢驗(yàn)鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)和樹(shù)脂在震蕩后置燈檢箱下觀察是否澄清。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 明膠沉淀法

明膠沉淀法主要是利用明膠可以包裹大顆粒物質(zhì)進(jìn)行沉淀的特性進(jìn)行三七提取液的純化實(shí)驗(yàn)，因此分別取藥量為1.0、2.0、3.0g∕mL三七提取液，用鹽酸調(diào)整pH值之后加入5%明膠溶液，攪拌至不再產(chǎn)生沉淀為止。冷藏12小時(shí)之后過(guò)濾并加入95%無(wú)水乙醇，調(diào)醇體積分?jǐn)?shù)至75%,再次冷藏12小時(shí)，過(guò)濾、定容后檢查各項(xiàng)指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，隨著藥材中三七的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸上升，三七總皂苷的轉(zhuǎn)移率明顯降低，然而三七總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在逐漸上升。

2.2 ZTC1+1天然澄清劑法

與上述實(shí)驗(yàn)方法相似，取含藥物含量為0.10、0.15、0.20g∕mL三七提取液，按照提取液質(zhì)量濃度不同分別分為A、B兩組。A組分的量為1×三七濃縮液體積×1%；B組分的量為2×三七濃縮液體積×1%，兩組均加入1%澄清劑，冷卻后進(jìn)行過(guò)濾、定容以及檢查。通過(guò)比較相關(guān)數(shù)據(jù)可知，生藥藥材質(zhì)量濃度為0.20g∕mL時(shí)，三七提取物的轉(zhuǎn)移率最高，此時(shí)的鞣質(zhì)蛋白質(zhì)檢查均呈陰性，因此在考慮提取液的質(zhì)量濃度條件的情況下，選定藥材提取液中的含藥量、質(zhì)量濃度等。

2.3 石硫醇法

同上，取含三七提取液的質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4g∕mL溶液,并加入25%石灰乳調(diào)從而使其pH值調(diào)整為11.5左右,攪勻,靜至2小時(shí)，再用20%硫酸回調(diào)pH值至6.0，經(jīng)過(guò)攪拌、過(guò)濾、冷卻加入95%乙醇調(diào)整提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，后經(jīng)過(guò)冷藏12小時(shí)。再經(jīng)過(guò)過(guò)濾、定容等步驟，得出相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由此可知，為提高三七總皂苷的轉(zhuǎn)移率、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的問(wèn)題時(shí)，應(yīng)該講溶液提取濃度控制在0.3～0.4g∕mL之間，同時(shí)考慮到濃縮的問(wèn)題，由于在質(zhì)量濃度為0.4g∕mL時(shí)比0.3g∕mL更費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此應(yīng)該采用質(zhì)量濃度為0.3g∕mL的三七提取液。

2.4 實(shí)驗(yàn)分析

不同的實(shí)驗(yàn)提純方法各有其優(yōu)弊端，如明膠沉淀法可以有效的去除三七提取液中的大分子雜質(zhì)，然而利用明膠進(jìn)行沉淀也向溶液中引入了明膠這種不可自然降解的物質(zhì)，從某種程度上來(lái)說(shuō)，它也相當(dāng)于引入另一種雜質(zhì)，而且明膠中含有蛋白質(zhì)成分導(dǎo)致溶液檢驗(yàn)時(shí)呈陽(yáng)性。除此之外，一旦藥材提取液的質(zhì)量濃度過(guò)高，就會(huì)使得溶液內(nèi)的有效物質(zhì)進(jìn)行聚集而被明膠當(dāng)成分子物質(zhì)進(jìn)行包裹，導(dǎo)致許多有效成分藏在明膠和蹂質(zhì)沉淀物中，從而導(dǎo)致提純后的三七提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，使得其損失率上升。與此同時(shí)，利用明膠進(jìn)行試驗(yàn)后的提純?nèi)芤翰荒軡M足相關(guān)的質(zhì)量要求，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)也無(wú)法滿足重要注射劑中的技術(shù)要求。

3 結(jié)語(yǔ)

在進(jìn)行三七提取物的純化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不僅需要考慮提取物的最終轉(zhuǎn)化率、質(zhì)量分?jǐn)?shù)等問(wèn)題，還要考慮溶液的復(fù)溶率以及溶液進(jìn)行注射方面的要求。

[1]胡稀,謝珍珍,梁潔.壯藥姜葉三七醇提取物抗炎作用的研究[J].大眾科技,2017(1).