張昊 王德宇 張慶軍 陳亮（吉林燃料乙醇有限公司，吉林 吉林 132101）

酒精酵母菌的高密度培養(yǎng)及其發(fā)酵性能的研究

張昊 王德宇 張慶軍 陳亮（吉林燃料乙醇有限公司，吉林 吉林 132101）

通過對酒精酵母的高密度培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)及其發(fā)酵性能的研究，提高酵母細(xì)胞的酒精耐力，降低它的產(chǎn)物，進(jìn)而提高酒精的生產(chǎn)效率，這是發(fā)酵工業(yè)近幾年重要的研究方向之一，它推動了國家綠色能源的發(fā)展，減少了環(huán)境的污染。實(shí)驗(yàn)通過三種方法研究對酒精酵母細(xì)胞生長的影響因素。通過分批培養(yǎng)、分批補(bǔ)料培養(yǎng)和連續(xù)流加培養(yǎng)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明第二種和第三種方法更加有利于酒精酵母菌的高密度生長。

酒精酵母菌;高密度培養(yǎng);發(fā)酵性能

酵母菌的快速生長是當(dāng)代工藝技術(shù)水平的特征指標(biāo)，也是工業(yè)酒精發(fā)酵的首選。酒精酵母的高密度培養(yǎng)和其發(fā)酵性能的研究成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。當(dāng)今社會上研究人員對酵母菌的研究并不少，但是對酵母菌高密度培養(yǎng)的報(bào)道卻不是很多。世界各國現(xiàn)在都在采用微生物發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行酵母菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，這是提高細(xì)胞密度的主要內(nèi)容，對減少環(huán)境的污染有重要意義。本文對酵母菌的高密度培養(yǎng)以及酒精酵母菌的發(fā)酵性能進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種：酒精酵母、木薯淀粉

培養(yǎng)基：葡萄糖、甘氨酸、蛋白、酵母浸膏

流加培養(yǎng)基：葡萄糖、甘氨酸、蛋白、酵母浸膏

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯淀粉水解液、甘氨酸、酵母浸膏

1.2 培養(yǎng)方法

搖瓶種子培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、分批補(bǔ)料流加培養(yǎng)、恒速流加培養(yǎng)、循環(huán)酒精發(fā)酵

1.3 分析方法

a.殘?zhí)菧y定法：DNS

b.乙醇濃度測定：采用FID檢測器

c.酵母細(xì)胞存活率測定：采用次甲基染色法和雪球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

d.酵母細(xì)胞濃度測定：采用干重法測定

2 結(jié)果與討論

2.1 初始糖濃度對酒精酵母菌生長的影響

分別取40g/L、60g/L、80g/L的濃度的葡萄糖藥瓶培養(yǎng)基，分別對酵母細(xì)胞的生長過程進(jìn)行跟蹤。從結(jié)果中可以看出來，培養(yǎng)基濃度在40g/L和60g/L時(shí)比80g/L濃度的生長更早的達(dá)到細(xì)胞生物量積累的最高點(diǎn)。而且葡萄糖的濃度為60g/L的時(shí)候細(xì)胞生物量的底物轉(zhuǎn)化效率最高。

2.2 甘氨酸對酒精酵母菌生長速度

通過研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)一定濃度的甘氨酸可以促使細(xì)胞生長。當(dāng)甘氨酸的用量達(dá)到3g/ml細(xì)胞生物量提高到了20g/ml。與不加甘氨酸相比較，細(xì)胞濃度比現(xiàn)在提高了86.88%。而且酒精酵母細(xì)胞的存活率非常的高。所以可以得出添加適當(dāng)?shù)馗拾彼峥梢詫凭湍讣?xì)胞的生長速度和密度積累有重要的幫助。

2.3 通氣量對酒精酵母的生長密度積累的影響

將三個(gè)發(fā)酵罐中的通氣量分別設(shè)定為不同的值。保持葡萄糖的濃度不變。在攪拌速度也不變的情況下分析酵母細(xì)胞的生長情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通氣量低的與高的相比較細(xì)胞生物量增加了82.233%。但通氣量為1.5vvm時(shí)，細(xì)胞的生長量提高了13.09%。所以適當(dāng)?shù)耐庥兄诰凭湍妇纳L和高密度培養(yǎng)。

2.4 分批培養(yǎng)對酒精酵母細(xì)胞的生長密度積累的影響

通過對酒精酵母細(xì)胞的生長和糖消耗的能量進(jìn)行定時(shí)的取樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)達(dá)到43小時(shí)后糖的消耗速率逐漸降低。細(xì)胞濃度也不在繼續(xù)升高，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中碳源的濃度太高，使溶液的滲透壓也升高抑制了酵母菌的生長。

2.5 分批補(bǔ)料培養(yǎng)對酒精酵母菌高密度培養(yǎng)的影響

細(xì)胞生長的量隨著糖的消耗逐漸增加的時(shí)候，細(xì)胞的生物量達(dá)到了71.33克每毫升。所以與分批培養(yǎng)相比較，培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度提高了156.77%。

2.6 連續(xù)恒速流加補(bǔ)料對酒精酵母細(xì)胞高密度培養(yǎng)的影響

葡萄糖流加12小時(shí)速率為0.159g/L，45小時(shí)以后細(xì)胞積累量為75.01g/L,在這個(gè)過程中，葡萄糖有一定的積累量。可以得出：流加培養(yǎng)過程中葡萄糖有過量累積，糖流加速率高于細(xì)胞吸收的速率。所以流加速率對酒精酵母菌生長是有一定影響的。速率如果過慢，不利于實(shí)現(xiàn)酒精酵母細(xì)胞密度的培養(yǎng)，并且，細(xì)胞快速生長的營養(yǎng)需求得到滿足。如果速率太快的話也會影響細(xì)胞對糖的吸收利用。葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)過度積累會引起細(xì)胞膜內(nèi)滲透壓升高，進(jìn)而影響酒精酵母菌的生長速率。所以要適當(dāng)?shù)目刂坪昧骷铀俾省?/p>

3 高密度培養(yǎng)的酒精酵母菌發(fā)酵性能研究

在發(fā)酵罐中，可以研究出高密度酒精酵母的發(fā)酵性能。發(fā)酵四十小時(shí)以后如果發(fā)酵液的糖濃度和酒精濃度并沒有明顯的上下波動，就把發(fā)酵液過濾從發(fā)酵罐中拿出。將新鮮的發(fā)酵底物溶液用泵打入，隨后跟蹤檢測其參數(shù)變化，多次重復(fù)的進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對酒精酵母高密度重復(fù)發(fā)酵生產(chǎn)酒精的能力進(jìn)行考察。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖濃度對高密度酵母酒精發(fā)酵性能有很大的影響。將高密度培養(yǎng)的酒精酵母液加入，每個(gè)瓶子中加入相同體積的酵母液，跟蹤檢測它的變化?？傻玫讲煌瑵舛染凭珜湍傅挠绊?，對細(xì)胞的正常呼吸和代謝有抑制性作用。高密度酵母可忍受12%濃度的酒精。這個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了酵母發(fā)酵時(shí)酒精的濃度只適合于在12%。高密度酵母發(fā)酵后，如果投入酒精生產(chǎn)過程的話可以重復(fù)使用。但如果重復(fù)到第七次的使用的時(shí)候會發(fā)現(xiàn)酒精濃度仍然很高。如果使用次數(shù)增加的話可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞產(chǎn)生酒精的能力和速度明顯的下降，第九次重復(fù)使用以后酒精濃度降低到10%。因此可以確定高濃度酒精酵母活化重復(fù)使用的次數(shù)為七次。

4 結(jié)語

高密度酒精酵母在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)可以使其濃度達(dá)到16.3%。普通的發(fā)酵時(shí)間可以縮短十二個(gè)小時(shí)。如果不經(jīng)過活化直接進(jìn)行循環(huán)讓酒精發(fā)酵的話，可以發(fā)現(xiàn)，前四次使用時(shí)濃度保持在14%以上。如果使用次數(shù)在四次以上的話能力就會下降。但經(jīng)過活化的高密度酒精酵母菌可以重復(fù)七次的循環(huán)使用并能達(dá)到13%以上。實(shí)驗(yàn)證明了酵母活化的重要性。活化的酵母菌可以展示它良好的性能，這也為可重復(fù)循環(huán)發(fā)酵能力的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]朱作華，嚴(yán)理，李智敏，耐高溫、高濃度酒精酵母高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化.《中國釀造》.2010.

[2]成少寧，許先猛，馬欣，廢糖液酒精發(fā)酵中酵母菌的分離、篩選和驗(yàn)證.《食品與發(fā)酵科技》.2016.