張 彥 青

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曙紅-蛋白質(zhì)體系吸收光譜的應(yīng)用

張 彥 青

(衡水學(xué)院 化工學(xué)院，河北 衡水 053000)

采用分光光度法，以曙紅染料為顯色劑，研究了在酸性介質(zhì)中曙紅與牛血清蛋白作用的吸收光譜并用于測定樣品中蛋白質(zhì)的含量．曙紅與蛋白質(zhì)作用構(gòu)成了曙紅－蛋白復(fù)合物，研究了影響該復(fù)合物穩(wěn)定和靈敏度的因素，確定了該實(shí)驗(yàn)的最佳條件．實(shí)驗(yàn)表明，曙紅-蛋白質(zhì)復(fù)合物最大吸收波長從515 nm紅移到531 nm．在最佳條件下，線性范圍為0.4×10-5~ 1.6×10-5mol/L，檢出限為0.09×10-5mol/L．

曙紅；牛血清蛋白；吸收光譜；分光光度法

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，在生物化學(xué)和其他生物學(xué)科、食品檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、疾病診斷、生物藥物分離提純和質(zhì)量檢驗(yàn)中蛋白質(zhì)的分離與定性、定量分析是最重要的工作[1]．蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中很重要的研究對象，化學(xué)家及生物學(xué)家對蛋白質(zhì)的分析研究極為關(guān)注．目前，蛋白質(zhì)測定方法有分光光度法、凱氏定氮法、熒光法、質(zhì)譜法等方法．其中分光光度法因操作簡便、快速、可測范圍廣、儀器價(jià)廉而得到廣泛的應(yīng)用，由此建立曙紅-蛋白質(zhì)體系吸收光譜的應(yīng)用分析．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PH-3C型精密酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FA2204B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)．牛血清蛋白(衛(wèi)生部上海生物制品研究所)標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 × 10-4mol/L，曙紅儲(chǔ)備液濃度1.0 × 10-4mol/L；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液：0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液與0.1 mol/L檸檬酸溶液按一定比例混合，配成不同pH的緩沖溶液，并用酸度計(jì)校正pH值．其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL比色管中，加入一定量的1.0 × 10-4mol/L牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，1.2 mL 1.0 × 10-4mol/L曙紅溶液，1.2 mL pH 2.50的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min后，以試劑的空白作參比，在531 nm處測定溶液的吸光度．

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液后，對曙紅與蛋白反應(yīng)體系進(jìn)行掃描，如圖1所示．由圖1可知：曙紅在紫外可見光區(qū)產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，最大吸收波長為515 nm，當(dāng)曙紅與蛋白反應(yīng)后生成復(fù)合物，最大吸收波長從原來的515 nm紅移到531 nm確定測定蛋白質(zhì)的最大吸收波長為531 nm．因此本實(shí)驗(yàn)選用波長為535 nm作為測定波長．

2.2 溶液酸度的影響

試驗(yàn)了混合酸-氫氧化鈉、鹽酸-乙酸鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液等多種緩沖溶液對實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果表明，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸后體系的靈敏度最高，故選用磷酸氫二鈉-檸檬酸作為緩沖溶液，試驗(yàn)結(jié)果見圖2表明：反應(yīng)體系在pH為2.5時(shí)，復(fù)合物的吸光度為最佳，反應(yīng)的靈敏度也較高．本試驗(yàn)選擇pH為2.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液控制體系酸度，緩沖溶液的用量以1.2 mL為宜．

2.3 曙紅溶液用量的影響

按實(shí)驗(yàn)方法操作表明只改變曙紅溶液的用量，且隨著曙紅濃度的增加，曙紅分子和蛋白分子之間結(jié)合程度不斷增大，復(fù)合物吸光度不斷增加．從現(xiàn)象上看，反應(yīng)體系顏色桃紅色逐漸加深．當(dāng)曙紅用量為1.0 × 10-5~2.0 × 10-5mol/L時(shí)，體系熒光強(qiáng)度增加最大．故實(shí)驗(yàn)選1.0 × 10-4mol/L曙紅溶液最佳用量為1.2 mL．

2.4 復(fù)合物的穩(wěn)定性

試驗(yàn)結(jié)果表明，曙紅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在室溫下，5 min后顯色較穩(wěn)定，穩(wěn)定時(shí)間至少在3ｈ以上．實(shí)驗(yàn)選在10 min后進(jìn)行．

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按實(shí)驗(yàn)方法操作，改變牛血清白蛋白用量，以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示．線性回歸方程為：= 0.977 32 + 0.1481 6，r = 0.998 2，線性范圍為0.4 × 10-5~ 1.6 × 10-5mol/L．利用3σ/K法11次平行測定得該方法的檢出限為0.9 × 10-6mol/L．

3 分析應(yīng)用

準(zhǔn)確移取4.5 mL市售牛奶于100 mL的容量瓶中，蒸餾水定容，混合均勻．取3.00 mL分析，對不同廠家牛奶中蛋白含量按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作并進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)測定，結(jié)果如表1所示．由此看出，該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于市售牛奶中蛋白質(zhì)含量的快速分析．

表1 牛奶中蛋白含量的測定(n = 6)

[1] CAO W G, JIAO Q C. Mechanism of the Interaction Between Coomassie Brilliant Blue and Bovine Serum Albumin[J]. Acta Laser Biology Sinica, 2008,17(1):32-37.

[2] 曹紅翠.紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)的含量[J].廣東化工,2007,34(8):93-94.

[3] 詹國慶,羅登柏,藍(lán)金貴,等.剛果紅分光光度法測定血清蛋白質(zhì)[J].分析化學(xué),2002,30(11):1399.

[4] 張國芝.凱氏(Kjeldahl)定氮法之實(shí)驗(yàn)總結(jié)[J].山東化工,2011,40(1):57-59.

[5] 陳鴻琪,夏閩.熒光染料吖啶紅測定蛋白質(zhì)的生物探針[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊,2001,37(2):53-55.

[6] 陳小萍,鄭玉聰,金玉玲.熒光分光光度法測定保健品中的微量蛋白[J].衛(wèi)生研究,2001,25(l):62-63.

[7] 黃珍玉,于雁靈,方彩云,等.質(zhì)譜鑒定磷酸化蛋白研究進(jìn)展[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2003,24(4):494-500.

Application of Absorption Spectrum of Eosine and Bovine Serum Albumin System

ZHANG Yanqing

(College of Chemistry, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

With spectrophotometry, under the acidic condition and with eosin dye as chromogenic agent, the absorption spectrum of interaction between eosine Y (EOSY) and bovine serum albumin (BSA) is studied. The total proteins in serum samples have been determined with the proposed method. Eosin interacts with bovine serum albumin (BSA) and forms a complex of EOSY-BSA and the factors influencing the complex’s stability and sensitivity has been studied. The best conditions of the experiment are determined. Experiments show that the maximum absorption wavelength of EOSY-BSA bathochromic-shifts from original 515 nm to 531 nm. Under the best condition, the linear range is 0.4×10-5~ 1.6×10-5mol/L and the detection limit is 0.09×10-5mol/L.

eosin; bovine serum albumin; absorption spectrum; spectrophotometry

10.3969/j.issn.1673-2065.2017.01.004

O657.32

A

1673-2065(2017)01-0013-03

2016-05-20

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(zc2016087)

張彥青(1982-)，女，河北衡水人，衡水學(xué)院化工學(xué)院講師．

(責(zé)任編校：李建明 英文校對：李玉玲)