鄭雙鳳，譚石勇，譚武貴，羅志威，徐滔明，張冬雪，豐 來

（農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與生物肥料重點實驗室，湖南泰谷生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410205）

生防芽孢桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)研究進展

鄭雙鳳，譚石勇，譚武貴，羅志威，徐滔明，張冬雪，豐 來

（農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與生物肥料重點實驗室，湖南泰谷生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410205）

低成本、高效率的高密度培養(yǎng)工藝和技術(shù)是近年來研究芽孢桿菌菌劑工業(yè)化生產(chǎn)的熱點。影響高密度發(fā)酵的因素非常多，包括菌種、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等。對影響芽孢桿菌高密度發(fā)酵主要因素的研究進展進行了綜述，旨在為芽孢桿菌的高密度發(fā)酵提供相關(guān)理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。

芽孢桿菌；高密度培養(yǎng)；研究進展

高 細 胞 密 度 發(fā) 酵（high cell density fermentation，HCDF）是指在一定的培養(yǎng)條件和體系內(nèi)，在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)上，盡可能多的積累生物量。工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)就是要以最低的生產(chǎn)成本獲取最高的細胞或代謝產(chǎn)物收益，因此低成本、高效率的高密度培養(yǎng)工藝和技術(shù)逐漸成為國內(nèi)外發(fā)酵研究工作者關(guān)注的焦點。影響高密度發(fā)酵的因素很多，如菌種的選擇、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等。

芽孢桿菌是廣泛存在于土壤和自然界中的優(yōu)勢菌株，由于其大多數(shù)無毒、對人畜無害、能夠分泌抗菌蛋白、抗生素、酶、多肽或脂類[1]等活性物質(zhì)，促進植物生長，防治植物病害，且具有繁殖速度快、抗逆性強、易定植于植物根際等優(yōu)點，成為目前研究最多的植物促生細菌與植病生防細菌[2-3]?；罹鷶?shù)與芽孢率是影響芽孢桿菌菌劑生防效果的關(guān)鍵因素，且芽孢具有耐酸、耐堿、耐熱、抗干燥、便于運輸與使用等優(yōu)勢[4-5]，因此應(yīng)用高密度發(fā)酵技術(shù)提高芽孢桿菌有效活菌數(shù)與芽孢率是近年來研究的熱點。筆者就影響芽孢桿菌高密度發(fā)酵主要因素的研究進展進行綜述，旨在為芽孢桿菌的高密度發(fā)酵提供理論與技術(shù)指導(dǎo)。

1 菌種選育

芽孢桿菌種類多，不同芽孢桿菌的生長與代謝存在較大差異，目前在生物防治領(lǐng)域研究較多的 有 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）[6]、 地 衣 芽 孢桿 菌（Bacillus licheniformis）[7]、 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌（Bacillusamyloliquefaciens）、 膠 質(zhì) 芽 孢 桿 菌（Bacillus mucilaginous）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等。為了能夠盡量縮減成本，增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，提高效益，需要對發(fā)酵菌種進行選育，常用的選育方法有自然選育、誘變選育、遺傳改造等。經(jīng)過選育的芽孢桿菌需具有安全無毒、生長迅速、生物量高、良好的產(chǎn)芽孢能力或者高產(chǎn)功能產(chǎn)物等性能[8]。

1.1 野生型菌株自然選育

自然選育野生型菌株的關(guān)鍵在于根據(jù)所需菌種特性建立方便、快捷、有效的篩菌模型。李姝江等[8]以腐皮鐮刀菌 [Fusarium solani（Mart） Sacc.]為供試病原菌，采用點菌法與打孔法從花椒根際土中分離篩選得到一株編號為B3的芽孢桿菌對花椒根腐病具有較強的拮抗效果。武志江等[9]以強致病力的百合尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為靶菌，采用平板對峙法最終篩選得到一株具有較強拮抗活性的拮抗細菌，解淀粉芽孢桿菌 11B91。Huang 等[10]結(jié)合平板與盆栽試驗，得到了一株對番茄細菌性枯萎病病原具有較強拮抗效果的解淀粉芽孢桿菌 WF02。郭榮君[11]等利用營養(yǎng)競爭平板篩選法獲得了拮抗大豆根腐病菌 Fusarium oxysporum 和 F. solani的 枯 草 芽 孢 桿 菌 菌 株 B006 和B010，通過田間小區(qū)試驗證明，其對大豆根腐病的防治效果分別為 74.6% 和 63.5%，并具有增產(chǎn)效果。

1.2 誘變選育

從自然界分離的野生菌菌株其生防效果通常不理想，而人工誘變選育操作簡單、快速，不僅可以提高野生型菌株產(chǎn)量，還能改造其生長代謝活動，是實驗室與工業(yè)生產(chǎn)上較常用的菌種選育方法之一。根據(jù)誘變劑的不同可分為物理誘變與化學(xué)誘變。閆冬等[12]采用亞硝基胍（NTG）誘變，篩選得到兩株高產(chǎn) LI-F類抗菌酯肽的多粘類芽孢桿菌突變株 N1-37 和 N2-27。李娜等[13]采用 UV 和 NTG 復(fù)合誘變的方法，獲得了2株傳代穩(wěn)定、毒力強、抗逆性好、對一品紅灰霉病的相對防效可達 85% 以上的枯草芽孢桿菌 Bs-a的突變菌株 D17 和 W03。

1.3 遺傳改造

通過基因工程手段對生防芽孢桿菌進行改造或?qū)ζ洚a(chǎn)物進行改良是獲得高效生防芽孢桿菌的重要途徑。近年來在這一方面，我國已取得顯著成果。胡曉璐等[14]建立了短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus DX01）菌株的 Tn5 轉(zhuǎn)座突變株抑稻瘟病活性的高效篩選體系，利用 Tn5 轉(zhuǎn)座子插入突變獲得大量突變株，最后篩選出6株與對照株抑制稻瘟病菌活性顯著變化的突變株，其中突變株 Tn5-901 對真菌孢子萌發(fā)的抑制率為 96%，遠高于對照 DX01 36% 的抑制率。劉麗霞等[15]運用同源重組的方法將外源有活性的 sfp 基因整合入芽孢桿菌 B. subtilis168 菌株中，將其改造為產(chǎn)surfacrin 的菌株。朱震等[16]根據(jù)脂肽類 物質(zhì)合成編碼基因（sfp、ituD 和 lpa-14 基因）設(shè)計引物，結(jié)合PCR 的方法，篩選到一株具廣譜抗菌活性且含有 sfp、ituD 和 lpa-14 這 3 個關(guān)鍵基因的解淀粉芽孢桿菌 XZ-173，該菌對立枯絲核菌和青枯菌具有出很好的拮抗活性，對根結(jié)線蟲也有很好的抑制作用。

2 培養(yǎng)基組成

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分如碳源、氮源、無機鹽和生長因子等是細胞生長與繁殖所必需的。高密度培養(yǎng)時，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分組成及比例要恰當(dāng)，尤其是碳氮比（C/ N），如 C/N 過低，發(fā)酵起始階段菌體大量繁殖，導(dǎo)致菌體提前自溶，不利于芽孢的形成 ；而 C/N 過高，則菌體繁殖減少，發(fā)酵后期活菌及芽孢總量偏低。因此單純增加營養(yǎng)物質(zhì)用量的方法并不能實現(xiàn)高密度發(fā)酵，在芽孢桿菌高密度培養(yǎng)時，應(yīng)根據(jù)菌種及所需產(chǎn)物特點，優(yōu)選來源容易、價格低廉、利于生長且芽孢產(chǎn)率高的培養(yǎng)基成分用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.1 碳 源

碳源既是構(gòu)成細胞及代謝產(chǎn)物必不可少的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，又是維持細菌生長代謝所需能源的原料。發(fā)酵過程中，不同芽孢桿菌的生理特性存在差異，因此高密度發(fā)酵過程中，所需碳源種類與濃度亦不完全相同。芽孢桿菌高密度發(fā)酵中，最常用碳源為葡萄糖、蔗糖。Posada 等[17]在研究培養(yǎng)基組分與培養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌 EA-CB0575 活菌數(shù)與芽孢產(chǎn)率影響時發(fā)現(xiàn)，葡萄糖為最佳碳源，在含葡萄糖與 MgSO4·7H2O的培養(yǎng)基中，芽孢數(shù)達 8.78×109CFU/mL，芽孢率高達 94.2 %。為減少生產(chǎn)成本，麩皮、玉米淀粉、糖蜜等廉價碳源越來越多被采用，且這些天然培養(yǎng)基中的某些成分能夠促進芽孢的形成，如玉米漿中的維生素 B1 已被證明對芽孢形成有促進作用[18-19]。Chen等[20]利用玉米粉、豆粉及酵母粉發(fā)酵枯草芽孢桿菌WHK-Z12 可得到較高的芽孢產(chǎn)量。林戎斌等[21]對地衣芽孢桿菌CHB6的液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行篩選優(yōu)化，結(jié)果表明，碳氮源對結(jié)果的影響最大，其最適碳源為 1.5% 的糖蜜，其余組分分別為 0.5% 大豆蛋白胨、0.15%K2HPO4·3H2O、1.5%NaCl，此時 CHB6 活菌數(shù)最高可達 4.8×109CFU/mL。

2.2 氮 源氮素是構(gòu)成芽孢桿菌細胞及其代謝產(chǎn)物的另一重要營養(yǎng)物質(zhì)，因此氮源成為影響芽孢桿菌高密度發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。氮源分為有機氮源與無機氮源兩類。研究表明，無機氮源比有機氮源更易被菌體直接吸收利用，而有機氮源則會對菌體增殖和芽孢形成產(chǎn)生明顯的促進作用，因此目前芽孢桿菌高密度發(fā)酵多使 用 復(fù) 合 氮 源。 李 達 等[22]利 用 酵 母 粉 3%、 黃 豆 粉

2%、NH4Cl 3% 作為枯草芽孢桿菌 NKY 1145 的氮源，最 大 活 菌 數(shù) 達 6.3×109CFU/mL。 解 順 昌 等[23]將 蛋白胨 1.5%、豆粕 1%、酵母粉 0.5% 作為地衣芽孢桿菌 YTDY-01 的氮源，成孢率約為 96.2%，芽孢數(shù)量達到 78.3±6.4×108CFU/mL。Rao 等[24]在優(yōu)化 Bacillus amyloliquefaciens B128 培 養(yǎng) 基 時 得 出 最 適 的 氮 源 為0.18%（NH4）2SO4、0.8% 蛋 白 胨， 發(fā) 酵 后 芽 孢 數(shù) 為5.93×108CFU/mL。

2.3 無機鹽及其他

培養(yǎng)基中無機鹽與微量元素對芽孢桿菌高密度發(fā)酵也有較大影響，一般常用的無機鹽包括鈣鹽、鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、磷酸鹽、鐵鹽等。林成強等[25]對CHB6產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進行了研究，結(jié)果顯示無機鹽離子對 CHB6 的菌體量及其芽孢形成均具有影響，其中 Mn2+離子的影響最大。Díaz-García 等[26]利用硝酸鐵與鹽等處理解淀粉芽孢桿菌 BS006，使其芽孢數(shù)由起始的1×108CFU/mL 升高到 1.05×1010CFU/mL，芽孢率達88.7%。臧超群等[27]發(fā)現(xiàn) NaCl對生防菌 S286 的菌體生長有促進作用。王西詳?shù)萚28]對枯草芽孢桿菌 NS178發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得出（NH4）2SO4、K2HPO4對菌體生產(chǎn)影響較大，優(yōu)化后 NS178 發(fā)酵液菌落數(shù)為34.50×108CFU/mL，培養(yǎng) 72 h 時芽孢率達到 75.8%。還有研究表明，Ca2+能夠提高芽孢產(chǎn)量[29-31]；添加芽孢桿菌核糖核酸酶會促進菌體生長與芽孢萌發(fā)[32]，提高發(fā)酵活菌數(shù)與芽孢率。

3 培養(yǎng)條件

在芽孢桿菌高密度發(fā)酵過程中，除了需要適宜的營養(yǎng)條件外，培養(yǎng)條件也至關(guān)重要，要得到高密度的活菌或芽孢，要求發(fā)酵保持在適宜的環(huán)境條件下進行，其條件主要包括 pH 值、溶氧、溫度、種齡與接種量等。

3.1 pH 值

pH值是芽孢桿菌高密度發(fā)酵極為重要的一個條件因子，發(fā)酵過程中需要充分考慮對象芽孢桿菌的最適 pH 值范圍，并在發(fā)酵過程中維持穩(wěn)定的 pH 值，避免pH值急劇變化，對細胞生長和代謝造成不利影響。芽孢桿菌發(fā)酵過程中，pH值一般呈先降后升趨勢，培養(yǎng)基配制時應(yīng)充分考慮其代謝對培養(yǎng)體系pH值緩沖體系的貢獻，定時補料加入酸或堿[33]。芽孢桿菌發(fā)酵的 pH 值一般控制在 6.0～7.5 之間。胡秀芳等[34]通過添加碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液的 pH 值，從而防止菌體自溶和促進芽孢形成。

3.2 溶 氧

溶解氧濃度是限制芽孢桿菌高密度發(fā)酵的又一關(guān)鍵因素。各種微生物對發(fā)酵液中溶氧濃度有一個最低的要求，這一溶氧濃度叫做臨界氧濃度（C臨界），每一種微生物都有自己特定的C臨界，而細菌的C臨界一般為 3%～10%，如枯草芽孢桿菌 CS27 的發(fā)酵罐最適攪拌速度為 180 r/min，其 C 臨界約為 10%[35]，一些好氧菌的最適溶氧可高達 30%。發(fā)酵過程中一般通過控制發(fā)酵罐的通氣量與攪拌速度來維持最適需氧量。Kupriyanova 等[36]研究球形芽孢桿菌芽孢形成與溶解氧的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，隨著溶解氧濃度升高，芽孢形成率也隨之提高。鐘蔚[37]發(fā)現(xiàn)通過提高通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，可以有效促進枯草芽孢桿菌 BS1 的生長繁殖，提高菌體生成量與芽孢數(shù)。但同時也有一些相反的研究結(jié)論，這可能與不同菌體的遺傳差異與芽孢形成條件不同有關(guān)。

3.3 溫 度

培養(yǎng)溫度是影響細胞生長與代謝的重要因素，高密度發(fā)酵應(yīng)維持在菌體生長繁殖和生物合成所需的最適溫度。不同的芽孢桿菌，其最適生長溫度存在差異，一般控制在 25～40℃。

3.4 種齡與接種量

種子液種齡與接種量對發(fā)酵也有較大影響，應(yīng)選擇處于對數(shù)生長中后期的菌體作為種子，并根據(jù)實際情況確定接種量。種子太年輕或接種量太少都會出現(xiàn)前期生長緩慢、發(fā)酵周期延長的情況；而接種過老的種子，菌體會過早衰退，接種量過大則易使菌體生長過快，均不利于后期生長。芽孢桿菌發(fā)酵接種量大多數(shù)控制在 4%～10%。吳大華[35]對枯草芽孢桿菌 CS27的發(fā)酵條件進行研究，確定最佳工藝條件為種齡 12 h、接種量 10%、培養(yǎng)時間 21 h、攪拌速度 180 r/min、 pH值 6.5、溶氧量 10% ；在此條件下，所獲得的枯草芽孢桿菌 CS27 菌體生物量約為 1.45 ×1010CFU/mL。

4 高密度培養(yǎng)方式

高密度發(fā)酵培養(yǎng)方式較多，其中補料分批培養(yǎng)、細胞循環(huán)培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)較為成熟完善。而芽孢桿菌高密度發(fā)酵一般采用補料分批發(fā)酵。

4.1 補料分批發(fā)酵

補料分批發(fā)酵具有操作靈活，染菌、退化概率小、可獲得高的轉(zhuǎn)化率、對發(fā)酵過程可實現(xiàn)控制等優(yōu)點，通過流加高濃度的營養(yǎng)或前體物質(zhì)，培養(yǎng)液中細胞濃度可以達到非常高的程度，同時可解除阻遏作用，提高產(chǎn)物得率[38]。

Monteiro 等[39]在枯草芽孢桿菌發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，通過在對數(shù)后期補加葡萄糖，使其濃度維持在 3.5 g/L，既可以解除葡萄糖的阻遏效應(yīng)，又可以避免在芽孢形成階段葡萄糖濃度過低的限制，提高活菌與芽孢產(chǎn)量。張艷軍[40]對枯草芽孢桿菌 B579 搖瓶發(fā)酵補料策略進行了優(yōu)化，結(jié)果表明葡萄糖反饋補料是最佳補料策略，在發(fā)酵過程中控制葡萄糖濃度在 3.0～6.0 g/L 范圍內(nèi)，菌體濃度可達 9.5×109CFU/mL。Monteiro 等[41]在枯草芽孢桿菌發(fā)酵對數(shù)生長期中后期補加含葡萄糖與鈣的溶液，芽孢產(chǎn)量增加了 5 倍。付維來等[42]通過補加新鮮培養(yǎng)基，延長了地衣芽孢桿菌 M109 的生長周期，提高了發(fā)酵水平，菌體濃度由最初的 1.0×109CFU/mL 提高到 1.2×1010CFU/mL。張峰等[43]利用溶氧反饋補料策略進行高密度枯草芽孢桿菌工程菌培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中維持 20%～50% 的溶解氧，最終細菌干質(zhì)量濃度達到 48.1 g/L。

4.2 其 他

芽孢桿菌高密度培養(yǎng)過程中，某些菌會出現(xiàn)代謝阻遏現(xiàn)象，這是可采用過濾培養(yǎng)方式解決這一問題。過濾培養(yǎng)屬于固定化培養(yǎng)的一種。戚薇等[44]利用中空纖維超濾裝置進行 TQ33 高密度培養(yǎng)，在對數(shù)后期，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度達到 15 g/L 時，開始過濾培養(yǎng)。過濾培養(yǎng)的 6 h 中平均過濾速率和培養(yǎng)基的流入速率為 1 L/h，平均稀釋率為 0.4 L/h ；最終菌體和芽孢濃度分別達到 1.6×1010和 1.2×1010CFU/mL，是分批培養(yǎng)的21倍和37 倍。

5 結(jié)論與展望

低成本、高效率的高密度培養(yǎng)是實現(xiàn)芽孢桿菌產(chǎn)品大范圍推廣應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)，現(xiàn)己成為芽孢桿菌菌劑工業(yè)化生產(chǎn)的重要研究領(lǐng)域。探索芽孢桿菌高密度發(fā)酵的影響因素，提高菌體及芽孢密度以達到高生產(chǎn)率與高效率是該技術(shù)研究的主要目標(biāo)。在芽孢桿菌高密度發(fā)酵過程中，不僅需選取最適的發(fā)酵菌種，最優(yōu)的營養(yǎng)成分配比，最佳的培養(yǎng)條件，還需對培養(yǎng)方式做進一步的研究與優(yōu)化。

近年來，我國芽孢桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)在生產(chǎn)上已得到廣泛應(yīng)用，并取得了一定成果，但是也存在一些需要解決完善的問題。高密度發(fā)酵策略的優(yōu)化是完善高密度培養(yǎng)技術(shù)的首要問題。同時，需要改進發(fā)酵設(shè)備、加強對在線檢測設(shè)備的研發(fā)，為發(fā)酵調(diào)控提供實時、準(zhǔn)確的依據(jù)，最終實現(xiàn)芽孢桿菌高密度發(fā)酵。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Research Progress of High Cell Density Fermentation Technology in Biocontrol of Bacillus spp.

ZHENG Shuang-feng，TAN Shi-yong，TAN Wu-gui，LUO Zhi-wei，XU Tao-ming，ZHANG Dong-xue，F(xiàn)ENG Lai

（Key Laboratory of Plant Nutrition and Biological Fertilizer Ministry of Agriculture, Hunan Taigu Bio-Tech Co. Ltd, Changsha 410205, PRC）

In recent years, high cell density fermentation(HCDF) with advantage of low cost and high effi ciency has been a hot spot in industrial production of Bacillus spp.. The factors, including bacteria, composition of culture medium, culture conditions, training modes, etc. could infl uence on the high cell density fermentation. Research progress of factors that affecting HCDF of Bacillus spp. were summarized in this paper, which provided theoretical basis and technical guidance for the HCDF of Bacillus spp.

Bacillus spp.; high density fermentation; research progress

Q815

A

1006-060X（2017）03-0120-05

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.034

2016-11-25

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0300904-2）；湖南省重點研發(fā)計劃項目（2016NK2016）

鄭雙鳳（1989-），女，湖南衡陽市人，助理工程師，主要從事農(nóng)用有益微生物篩選與發(fā)酵過程優(yōu)化與控制工作。

豐 來