何 培，李正偉，許益娟，張若鵬

(1.大理大學臨床醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，云南大理 671000)

主動免疫療法對體外受精-胚胎移植反復著床失敗影響的研究*

何 培1，李正偉1，許益娟1，張若鵬2△

(1.大理大學臨床醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，云南大理 671000)

目的 探討臨床應用主動免疫療法治療體外受精-胚胎移植(IVF-ET)反復著床失敗患者再次行IVF-ET結局的影響。方法 在進入新的控制性卵巢刺激周期前，30對接受主動免疫治療的患者設為試驗組，64對拒絕免疫治療的患者為對照組，觀察兩組患者排卵期性激素水平、移植時內膜厚度和臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率。結果 體外受精-胚胎移植反復著床失敗的患者封閉抗體轉陽后，試驗組和對照組在新的治療周期中子宮內膜厚度、黃體生成素、黃體酮及雌二醇，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組流產率及異位妊娠率無明顯差異(P>0.05)；試驗組臨床妊娠率40.0%，顯示高于對照組(12.5%),差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。結論 淋巴細胞主動免疫治療對體外受精-胚胎移植反復著床失敗的患者有一定的臨床應用價值。

淋巴細胞主動免疫治療;性激素水平;移植時內膜厚度;臨床妊娠率;流產率;異位妊娠率

隨著現(xiàn)代社會環(huán)境污染嚴峻，人們生活方式的改變，以及婚育年齡普遍推遲等影響，人類的正常生活受到干擾，由此引起的生理-心理-社會醫(yī)學模式的不協(xié)調，不孕癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，成為僅次于腫瘤和心血管疾病之后的第三大疾病。體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技術成為治療不孕癥的有效方法。胚胎著床是妊娠成功的起始和關鍵的步驟。大規(guī)模的流行病學調查，近年來IVF-ET的著床率在20%～30%[1]。不同的生殖中心對反復胚胎著床失敗(repeated failure of embryo implantation，RIF)的定義并不相同，有學者建議將RIF的定義為：至少連續(xù)3個IVF-ET失敗，且每周期中有一個或兩個優(yōu)質胚胎[2]。RIF已成為困擾臨床醫(yī)生和不孕患者的一個難題[3]。淋巴細胞主動免疫療法現(xiàn)已廣泛應用于復發(fā)性流產患者中，并已取得良好的治療效果。基于這一理念，筆者嘗試將其應用于反復著床失敗的患者中，觀察其治療結局并進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標準：男女雙方年齡25～38歲，移植優(yōu)質胚胎不少于3次；既往抗梅毒螺旋體、弓形體抗體、單純性皰疹病毒抗體、巨細胞病毒抗體、風疹病毒抗體、封閉抗體檢測陰性，周期胚胎移植(ET)前日子宮內膜Salle評分大于或等于13分；夫婦雙方染色體檢查正常；乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒及梅毒血清學篩查陰性。排除標準：排除解剖異常、內分泌異常、生殖道感染、染色體異常、自身免疫疾病、輸卵管積水和卵巢低反應性及女方有煙、酒等不良嗜好。

將2010年8月至2015年3月于大理大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科就診，符合上述標準的94對患者作為研究對象。該研究符合人體試驗倫理學標準，并得到倫理委員會的批準。將淋巴細胞主動免疫治療的利弊、費用、可能存在的風險等告知每對夫婦，30對夫婦同意試行淋巴細胞主動免疫治療，作為試驗組；另64對夫婦拒絕接受免疫治療，為對照組。供血者選擇丈夫或第三方親屬。

1.2 方法

1.2.1 丈夫淋巴細胞主動免疫治療方法 人淋巴細胞分離液由天津市灝洋生物科技有限責任公司生產。常規(guī)消毒后，抽取供者上肢靜脈血15～20 mL，用適量肝素抗凝，37 ℃水浴30 min，加入0.9%氯化鈉6 mL混勻,將混勻液緩緩加入4個含有5 mL細胞分離液離心管中，每管約6 mL；1 100 r/min離心30 min，離心管中由上至下分為4層：第1層為血漿，第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細胞層。收集淋巴細胞置于 3 mL 0.9%氯化鈉中平衡，1 100 r/min離心10 min，去上清液，將淋巴細胞團置于0.9%氯化鈉1 mL中混勻，標記患者姓名備用。取少許混懸液，計數淋巴細胞，調密度達(40～70)×106/mL，于女方前臂內側等份皮內注射4～9個點，每2～4周為1次，行淋巴細胞免疫治療。封閉抗體由昆明金域醫(yī)學檢驗所檢測，轉為陽性后3～4次后再次胚胎移植，確定妊娠后再行2～4次上述治療。

1.2.2 再次行IVF-ET 再次IVF-ET控制性卵巢刺激方案，超聲引導下經陰道行卵泡穿刺法取卵，選擇優(yōu)質胚胎(卵裂球6～8細胞，第3天胚胎1～3枚)。選取卵后第3天后行胚胎移植，余下的胚胎養(yǎng)囊胚或直接胚胎冷凍保存。在第3天行胚胎移植后要給黃體酮和(或)HCG黃體支持療法。

1.3 妊娠診斷指標 胚胎移植14 d后查血清HCG>5 U/L，或留晨尿為陽性，診斷為生化妊娠，繼續(xù)用黃體支持，移植28 d后，B超下官腔內見到孕囊，診斷臨床妊娠。觀察內容包括：血HCG測定，尿妊娠HCG試驗，超聲查出孕囊位置及個數等，資料完整。 血HCG測定妊娠：診斷早期妊娠,孕后35～50 d HCG可升至2 500 U/L。60～70 d可達8×1011mU/L。血HCG定量免疫測定濃度大于25 U/L定為妊娠陽性；10～25 U/L之間可疑。尿-HCG(HCG半定量法)：非孕婦女小于25 U/L,孕40 d大于5 000 U/L,孕60～70 d大于(8～32)×104U/L(清晨尿HCG水平最高，接近血清水平)。

2 結 果

2.1 兩組女方平均年齡、不孕次數比較 對照組平均年齡(29.70±3.36)歲，不孕次數(3.55±0.83)次，試驗組平均年齡(29.83±2.82)歲，不孕次數(3.90±1.18)次，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 兩組子宮內膜厚度、LH、P、E2 比較 試驗組子宮內膜厚度、LH、P、E2略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

體外受精-胚胎移植反復著床失敗的患者封閉抗體轉陽后，試驗組和對照組在新的治療周期中子宮內膜厚度、黃體生成素(LH)、黃體酮(P)及雌二醇(E2)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。流產率及異位妊娠率無明顯差異(P>0.05)，兩組臨床妊娠率相比(P<0.05),試驗組較對照組有所提高。

表1 不同組別患者的子宮內膜厚度、LH、P及E2的比較

2.3 超聲檢查結果 根據B超檢查所示，體外受精-胚胎移植反復著床失敗的患者行主動免疫療法后可成功妊娠。見圖1、2。

超聲提示：子宮、雙附件區(qū)未見異常聲像。

圖1 不孕癥患者未行主動免疫療法超聲檢查結果

超聲提示：宮內單活胎，孕約10周聲像。

圖2 行主動免疫療法患者成功妊娠超聲檢查結果

2.4 兩組之間臨床結局分析 兩組臨床妊娠率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組異位妊娠率、流產率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同組別患者臨床結局的比較[%(n/n)]

3 討 論

分別對試驗組和對照組行助孕方案，患者一般情況(年齡、胚胎個數、胚胎質量、不孕次數)差異無統(tǒng)計學意義；兩組的子宮內膜厚度、LH、P、E2 差異無統(tǒng)計學意義，臨床妊娠率差異有統(tǒng)計學意義，這表明子宮內膜厚度、LH、P、E2 對臨床妊娠率的沒有影響。

研究顯示，子宮內膜容受性與子宮內膜厚度、移植窗胞飲突的數量、血流情況、內膜微環(huán)境中各種免疫細胞及其細胞因子構成比等諸多因素有關[4]。胚胎種植成功的關鍵因素是有良好的子宮環(huán)境和優(yōu)質的胚胎[5]。但是在IVF-ET患者中，常常發(fā)現(xiàn)許多患者胚胎質量佳，有正常的子宮內膜形態(tài)，卻在反復移植胚胎中無法成功妊娠。近些年來，許多臨床證據表明免疫因素的影響在胚胎反復種植失敗中起著重要的作用。

免疫學調查以為，妊娠是一種同種性質的物質移植現(xiàn)象，流產是異種移植排斥的結局[6]。在臨床妊娠正常過程中，胚胎是一種半同體抗原，但不受母體排斥而存在，這和蛻膜組織中有正常的免疫微環(huán)境有一定的相關性。胚胎源性抗原與母體的免疫系統(tǒng)形成免疫平衡狀態(tài)，這是胚胎得以存活的前提條件。一旦這種平衡被打破，導致母體與胚胎免疫失衡，將可能造成反復胚胎種植失敗或流產的發(fā)生，免疫學調控在胚胎種植過程中發(fā)揮重要的角色[7]。而淋巴細胞主動免疫治療可能促進細胞免疫介入免疫耐受，增強封閉抗體，引導母胎界面微環(huán)境相互適應，這為探索改善胚胎著床的治療方法以及闡釋RIF的發(fā)病機制提供了一定的理論依據[8]。

在胎母接觸面的免疫關系中，最具有代表性的是絨毛外細胞滋養(yǎng)葉與母體蛻膜面之間免疫[9]。蛻膜含有T淋巴細胞，多數報道在孕期蛻膜淋巴細胞以CD8細胞為主。在人孕期蛻膜T細胞培養(yǎng)上清液中TH1/TH2出現(xiàn)TH2傾斜。

國外有研究者發(fā)現(xiàn)，多次IVF-ET失敗婦女外周血中分泌白細胞介素(IL)-10的CD3+/CD8+T細胞明顯降低，而分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α的CD3+/CD4+T細胞增高[4]。由此推測Th1為主導的免疫反應增強，可能導致失敗的胚胎植入。因此認為，反復胚胎著床失敗的患者與習慣性流產的患者同樣存在免疫的功能失調。

近年來，國內外大量文獻表明淋巴細胞主動免疫對復發(fā)性流產有較好的效果，但是關于主動免疫治療反復胚胎種植失敗的報道很少。Coulam等[10]研究認為主動免疫治療只對那些有異常免疫風險的妊娠失敗的婦女有一定療效，旨在使其活產嬰兒的出生率提高。不明原因復發(fā)性流產的患者用淋巴細胞主動免疫治療法的主要原因是淋巴細胞能夠使患者免疫反應性增強，從而使得封閉抗體陽性，使得患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的數量提高[11-12]；同時可誘導患者體內TH1/TH2出現(xiàn)TH2傾斜，使母體免疫系統(tǒng)無法識別和殺傷胎兒父系抗原或胚胎，從而獲得免疫保護作用，有助于正常妊娠的維持。這個理論與林其德[9]研究相符。有專家意識到，RIF與復發(fā)性流產的病理機制或許存在一定部分的相關性。復發(fā)性流產與RIF可能是在同種發(fā)病機制不同階段的顯示。然而作者應用淋巴細胞對封閉抗體缺乏的反復種植失敗患者進行主動免疫治療，試驗組臨床妊娠率較對照組有提高，可獲得40%的臨床妊娠率，這表明淋巴細胞主動免疫治療對胚胎反復著床失敗的患者有一定臨床應用價值。根據國內外報道以及該研究，可嘗試在RIF患者中根據患者實際情況實施適度的主動免疫療法，提高反復不孕不育患者的臨床妊娠率。

此文章中試驗組和對照組的異位妊娠率、流產率相比，差異并無統(tǒng)計學意義，這表明，淋巴細胞主動免疫治療法對胚胎反復種植失敗患者的異位妊娠率、流產率的改善并未起到作用。相關文獻顯示主動免疫治療法可以相應降低復發(fā)性流產患者的流產率[13-14]。根據患者體內封閉抗體的變化情況衡量主動免疫治療的療效，可以預測并指導習慣性流產患者的妊娠及再一次妊娠的臨床結局[15]。

根據國內外的研究報道及本研究的調查，淋巴細胞主動免疫治療可適度的應用于反復胚胎著床失敗并封閉抗體陰性的患者。關于國內外淋巴細胞主動免疫治療對反復種植失敗治療的確切效果仍缺乏大量的前瞻性研究和循證醫(yī)學證據，仍有待進一步研究與探索。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.030

云南省教育廳基金(2013C172)；九三學社大理白族自治州委調研課題項目(16DJ04)；大理大學博士2016年度博士科研啟動費項目(KYBS201612)。 作者簡介：何培(1990-)，在讀碩士，主要從事輔助生殖實驗室技術的研究?！?/p>

，E-mail:zrp263000@163.com。

R459.2

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1671-8348(2017)05-0673-04

2016-06-27

2016-08-25)