何 培，李正偉，許益娟，張若鵬

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南大理 671000)

主動(dòng)免疫療法對(duì)體外受精-胚胎移植反復(fù)著床失敗影響的研究*

何 培1，李正偉1，許益娟1，張若鵬2△

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南大理 671000)

目的 探討臨床應(yīng)用主動(dòng)免疫療法治療體外受精-胚胎移植(IVF-ET)反復(fù)著床失敗患者再次行IVF-ET結(jié)局的影響。方法 在進(jìn)入新的控制性卵巢刺激周期前，30對(duì)接受主動(dòng)免疫治療的患者設(shè)為試驗(yàn)組，64對(duì)拒絕免疫治療的患者為對(duì)照組，觀察兩組患者排卵期性激素水平、移植時(shí)內(nèi)膜厚度和臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率。結(jié)果 體外受精-胚胎移植反復(fù)著床失敗的患者封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后，試驗(yàn)組和對(duì)照組在新的治療周期中子宮內(nèi)膜厚度、黃體生成素、黃體酮及雌二醇，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組流產(chǎn)率及異位妊娠率無(wú)明顯差異(P>0.05)；試驗(yàn)組臨床妊娠率40.0%，顯示高于對(duì)照組(12.5%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)論 淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對(duì)體外受精-胚胎移植反復(fù)著床失敗的患者有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療;性激素水平;移植時(shí)內(nèi)膜厚度;臨床妊娠率;流產(chǎn)率;異位妊娠率

隨著現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境污染嚴(yán)峻，人們生活方式的改變，以及婚育年齡普遍推遲等影響，人類的正常生活受到干擾，由此引起的生理-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的不協(xié)調(diào)，不孕癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，成為僅次于腫瘤和心血管疾病之后的第三大疾病。體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技術(shù)成為治療不孕癥的有效方法。胚胎著床是妊娠成功的起始和關(guān)鍵的步驟。大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，近年來(lái)IVF-ET的著床率在20%～30%[1]。不同的生殖中心對(duì)反復(fù)胚胎著床失敗(repeated failure of embryo implantation，RIF)的定義并不相同，有學(xué)者建議將RIF的定義為：至少連續(xù)3個(gè)IVF-ET失敗，且每周期中有一個(gè)或兩個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎[2]。RIF已成為困擾臨床醫(yī)生和不孕患者的一個(gè)難題[3]。淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中，并已取得良好的治療效果。基于這一理念，筆者嘗試將其應(yīng)用于反復(fù)著床失敗的患者中，觀察其治療結(jié)局并進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：男女雙方年齡25～38歲，移植優(yōu)質(zhì)胚胎不少于3次；既往抗梅毒螺旋體、弓形體抗體、單純性皰疹病毒抗體、巨細(xì)胞病毒抗體、風(fēng)疹病毒抗體、封閉抗體檢測(cè)陰性，周期胚胎移植(ET)前日子宮內(nèi)膜Salle評(píng)分大于或等于13分；夫婦雙方染色體檢查正常；乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒及梅毒血清學(xué)篩查陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除解剖異常、內(nèi)分泌異常、生殖道感染、染色體異常、自身免疫疾病、輸卵管積水和卵巢低反應(yīng)性及女方有煙、酒等不良嗜好。

將2010年8月至2015年3月于大理大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診，符合上述標(biāo)準(zhǔn)的94對(duì)患者作為研究對(duì)象。該研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。將淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的利弊、費(fèi)用、可能存在的風(fēng)險(xiǎn)等告知每對(duì)夫婦，30對(duì)夫婦同意試行淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療，作為試驗(yàn)組；另64對(duì)夫婦拒絕接受免疫治療，為對(duì)照組。供血者選擇丈夫或第三方親屬。

1.2 方法

1.2.1 丈夫淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療方法 人淋巴細(xì)胞分離液由天津市灝洋生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)。常規(guī)消毒后，抽取供者上肢靜脈血15～20 mL，用適量肝素抗凝，37 ℃水浴30 min，加入0.9%氯化鈉6 mL混勻,將混勻液緩緩加入4個(gè)含有5 mL細(xì)胞分離液離心管中，每管約6 mL；1 100 r/min離心30 min，離心管中由上至下分為4層：第1層為血漿，第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細(xì)胞層。收集淋巴細(xì)胞置于 3 mL 0.9%氯化鈉中平衡，1 100 r/min離心10 min，去上清液，將淋巴細(xì)胞團(tuán)置于0.9%氯化鈉1 mL中混勻，標(biāo)記患者姓名備用。取少許混懸液，計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞，調(diào)密度達(dá)(40～70)×106/mL，于女方前臂內(nèi)側(cè)等份皮內(nèi)注射4～9個(gè)點(diǎn)，每2～4周為1次，行淋巴細(xì)胞免疫治療。封閉抗體由昆明金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測(cè)，轉(zhuǎn)為陽(yáng)性后3～4次后再次胚胎移植，確定妊娠后再行2～4次上述治療。

1.2.2 再次行IVF-ET 再次IVF-ET控制性卵巢刺激方案，超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道行卵泡穿刺法取卵，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎(卵裂球6～8細(xì)胞，第3天胚胎1～3枚)。選取卵后第3天后行胚胎移植，余下的胚胎養(yǎng)囊胚或直接胚胎冷凍保存。在第3天行胚胎移植后要給黃體酮和(或)HCG黃體支持療法。

1.3 妊娠診斷指標(biāo) 胚胎移植14 d后查血清HCG>5 U/L，或留晨尿?yàn)殛?yáng)性，診斷為生化妊娠，繼續(xù)用黃體支持，移植28 d后，B超下官腔內(nèi)見(jiàn)到孕囊，診斷臨床妊娠。觀察內(nèi)容包括：血HCG測(cè)定，尿妊娠HCG試驗(yàn)，超聲查出孕囊位置及個(gè)數(shù)等，資料完整。 血HCG測(cè)定妊娠：診斷早期妊娠,孕后35～50 d HCG可升至2 500 U/L。60～70 d可達(dá)8×1011mU/L。血HCG定量免疫測(cè)定濃度大于25 U/L定為妊娠陽(yáng)性；10～25 U/L之間可疑。尿-HCG(HCG半定量法)：非孕婦女小于25 U/L,孕40 d大于5 000 U/L,孕60～70 d大于(8～32)×104U/L(清晨尿HCG水平最高，接近血清水平)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組女方平均年齡、不孕次數(shù)比較 對(duì)照組平均年齡(29.70±3.36)歲，不孕次數(shù)(3.55±0.83)次，試驗(yàn)組平均年齡(29.83±2.82)歲，不孕次數(shù)(3.90±1.18)次，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組子宮內(nèi)膜厚度、LH、P、E2 比較 試驗(yàn)組子宮內(nèi)膜厚度、LH、P、E2略高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

體外受精-胚胎移植反復(fù)著床失敗的患者封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后，試驗(yàn)組和對(duì)照組在新的治療周期中子宮內(nèi)膜厚度、黃體生成素(LH)、黃體酮(P)及雌二醇(E2)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。流產(chǎn)率及異位妊娠率無(wú)明顯差異(P>0.05)，兩組臨床妊娠率相比(P<0.05),試驗(yàn)組較對(duì)照組有所提高。

表1 不同組別患者的子宮內(nèi)膜厚度、LH、P及E2的比較

2.3 超聲檢查結(jié)果 根據(jù)B超檢查所示，體外受精-胚胎移植反復(fù)著床失敗的患者行主動(dòng)免疫療法后可成功妊娠。見(jiàn)圖1、2。

超聲提示：子宮、雙附件區(qū)未見(jiàn)異常聲像。

圖1 不孕癥患者未行主動(dòng)免疫療法超聲檢查結(jié)果

超聲提示：宮內(nèi)單活胎，孕約10周聲像。

圖2 行主動(dòng)免疫療法患者成功妊娠超聲檢查結(jié)果

2.4 兩組之間臨床結(jié)局分析 兩組臨床妊娠率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組異位妊娠率、流產(chǎn)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同組別患者臨床結(jié)局的比較[%(n/n)]

3 討 論

分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組行助孕方案，患者一般情況(年齡、胚胎個(gè)數(shù)、胚胎質(zhì)量、不孕次數(shù))差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組的子宮內(nèi)膜厚度、LH、P、E2 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明子宮內(nèi)膜厚度、LH、P、E2 對(duì)臨床妊娠率的沒(méi)有影響。

研究顯示，子宮內(nèi)膜容受性與子宮內(nèi)膜厚度、移植窗胞飲突的數(shù)量、血流情況、內(nèi)膜微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞及其細(xì)胞因子構(gòu)成比等諸多因素有關(guān)[4]。胚胎種植成功的關(guān)鍵因素是有良好的子宮環(huán)境和優(yōu)質(zhì)的胚胎[5]。但是在IVF-ET患者中，常常發(fā)現(xiàn)許多患者胚胎質(zhì)量佳，有正常的子宮內(nèi)膜形態(tài)，卻在反復(fù)移植胚胎中無(wú)法成功妊娠。近些年來(lái)，許多臨床證據(jù)表明免疫因素的影響在胚胎反復(fù)種植失敗中起著重要的作用。

免疫學(xué)調(diào)查以為，妊娠是一種同種性質(zhì)的物質(zhì)移植現(xiàn)象，流產(chǎn)是異種移植排斥的結(jié)局[6]。在臨床妊娠正常過(guò)程中，胚胎是一種半同體抗原，但不受母體排斥而存在，這和蛻膜組織中有正常的免疫微環(huán)境有一定的相關(guān)性。胚胎源性抗原與母體的免疫系統(tǒng)形成免疫平衡狀態(tài)，這是胚胎得以存活的前提條件。一旦這種平衡被打破，導(dǎo)致母體與胚胎免疫失衡，將可能造成反復(fù)胚胎種植失敗或流產(chǎn)的發(fā)生，免疫學(xué)調(diào)控在胚胎種植過(guò)程中發(fā)揮重要的角色[7]。而淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療可能促進(jìn)細(xì)胞免疫介入免疫耐受，增強(qiáng)封閉抗體，引導(dǎo)母胎界面微環(huán)境相互適應(yīng)，這為探索改善胚胎著床的治療方法以及闡釋RIF的發(fā)病機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)[8]。

在胎母接觸面的免疫關(guān)系中，最具有代表性的是絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)葉與母體蛻膜面之間免疫[9]。蛻膜含有T淋巴細(xì)胞，多數(shù)報(bào)道在孕期蛻膜淋巴細(xì)胞以CD8細(xì)胞為主。在人孕期蛻膜T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TH1/TH2出現(xiàn)TH2傾斜。

國(guó)外有研究者發(fā)現(xiàn)，多次IVF-ET失敗婦女外周血中分泌白細(xì)胞介素(IL)-10的CD3+/CD8+T細(xì)胞明顯降低，而分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α的CD3+/CD4+T細(xì)胞增高[4]。由此推測(cè)Th1為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，可能導(dǎo)致失敗的胚胎植入。因此認(rèn)為，反復(fù)胚胎著床失敗的患者與習(xí)慣性流產(chǎn)的患者同樣存在免疫的功能失調(diào)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)表明淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有較好的效果，但是關(guān)于主動(dòng)免疫治療反復(fù)胚胎種植失敗的報(bào)道很少。Coulam等[10]研究認(rèn)為主動(dòng)免疫治療只對(duì)那些有異常免疫風(fēng)險(xiǎn)的妊娠失敗的婦女有一定療效，旨在使其活產(chǎn)嬰兒的出生率提高。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者用淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療法的主要原因是淋巴細(xì)胞能夠使患者免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，從而使得封閉抗體陽(yáng)性，使得患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量提高[11-12]；同時(shí)可誘導(dǎo)患者體內(nèi)TH1/TH2出現(xiàn)TH2傾斜，使母體免疫系統(tǒng)無(wú)法識(shí)別和殺傷胎兒父系抗原或胚胎，從而獲得免疫保護(hù)作用，有助于正常妊娠的維持。這個(gè)理論與林其德[9]研究相符。有專家意識(shí)到，RIF與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病理機(jī)制或許存在一定部分的相關(guān)性。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與RIF可能是在同種發(fā)病機(jī)制不同階段的顯示。然而作者應(yīng)用淋巴細(xì)胞對(duì)封閉抗體缺乏的反復(fù)種植失敗患者進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，試驗(yàn)組臨床妊娠率較對(duì)照組有提高，可獲得40%的臨床妊娠率，這表明淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對(duì)胚胎反復(fù)著床失敗的患者有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道以及該研究，可嘗試在RIF患者中根據(jù)患者實(shí)際情況實(shí)施適度的主動(dòng)免疫療法，提高反復(fù)不孕不育患者的臨床妊娠率。

此文章中試驗(yàn)組和對(duì)照組的異位妊娠率、流產(chǎn)率相比，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明，淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療法對(duì)胚胎反復(fù)種植失敗患者的異位妊娠率、流產(chǎn)率的改善并未起到作用。相關(guān)文獻(xiàn)顯示主動(dòng)免疫治療法可以相應(yīng)降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的流產(chǎn)率[13-14]。根據(jù)患者體內(nèi)封閉抗體的變化情況衡量主動(dòng)免疫治療的療效，可以預(yù)測(cè)并指導(dǎo)習(xí)慣性流產(chǎn)患者的妊娠及再一次妊娠的臨床結(jié)局[15]。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道及本研究的調(diào)查，淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療可適度的應(yīng)用于反復(fù)胚胎著床失敗并封閉抗體陰性的患者。關(guān)于國(guó)內(nèi)外淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對(duì)反復(fù)種植失敗治療的確切效果仍缺乏大量的前瞻性研究和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，仍有待進(jìn)一步研究與探索。

[1]張波,顏軍昊.胚胎反復(fù)著床失敗的病因及處理措施[J].生殖與避孕,2014,34(7):564-570.

[2]Simon A,Laufer N.Repeated implantation failure:clinical approach[J].Fertil,Steril,2012,97(5):1039-1043.

[3]Potdar 6fN,Gelbaya T,Nardo LG.Endometrial injury to overcome recurrent embryo implantation failure:a systematic review and meta-analysis.Reprod Biomed Online,2012,25(6):561-571.

[4]Scjookraft WB,Surrey ES,Miajarez DA,et al.Management of poor responders:can outcomes keimprovod hormne antagonistlletrozole protocol?[J].Fertil Steril,2008,89(1):151-156.

[5]Simon A,Laufer N.Repeated implantation failure:clinical approach[J].Fertil Steril,2012,97(19):2475-2477.

[6]Schoolcraft WB,surrey ES,Minjare DA,et al.Management of poor reaponders;can outcomes be improved with a novel gonndotropin relasing.hormone antagonist letrozole protocol[J].Fetril Steril,2008,89(1):151-156.

[7]Makrigiannakis A,Petsas G,Toth B,et al.Recent advances in understanding immunology of reproduetive failure[J].Reprod Immunol,2011,90(1):96-104.

[8]Fan X,Wang Z,Ji P,et al.rgpA DNA vaccine induces antibody response and prevents alveolar bone loss in experimental peri-implantitis[J].J Periodontol,2013,84(6):850-856.

[9]林其德.現(xiàn)代生殖免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006：112-113.

[10]Coulam CB,A cacio B.Does immunotherapy for treatment of reproductive failure enhance live births?[J].Am J Reprod Immunol,2012,67(4):296-304.

[11]邱麗華，林其德.調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2004,39(12):816-818.

[12]Yang H,Qiu L,Chen G,et al.Proportional change of CD4+CD25+ regulatory T cells after recurrent spontaneous abortion patients[J].Fertil Steril,2009,92(1):301-305.

[13]鄒琳,彭彩玲,許麗華,等.321例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者采用丈夫或無(wú)關(guān)個(gè)體淋巴細(xì)胞免疫治療的臨床分析[J].中國(guó)婦幼保健,2014,29(24):3951-3952.

[14]余宏,胡艷秋,呂芳,等.復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的臨床分析[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志,2014,10(5):98-101.

[15]黃華英,孫鴻燕,廖運(yùn)梅.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對(duì)反復(fù)自然流產(chǎn)的療效分析及其護(hù)理策略[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志,2012,8(3):255-257.

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.030

云南省教育廳基金(2013C172)；九三學(xué)社大理白族自治州委調(diào)研課題項(xiàng)目(16DJ04)；大理大學(xué)博士2016年度博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目(KYBS201612)。 作者簡(jiǎn)介：何培(1990-)，在讀碩士，主要從事輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的研究?！?/p>

，E-mail:zrp263000@163.com。

R459.2

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1671-8348(2017)05-0673-04

2016-06-27

2016-08-25)