阮姝琴，黃 偉，楊志祥，韋 鳳，唐 敏

(重慶市人民醫(yī)院：1.腫瘤血液科；2.胸外科 400013)

新型雌激素受體GPR30在非小細(xì)胞肺癌增殖中的作用研究*

阮姝琴1，黃 偉2△，楊志祥1，韋 鳳1，唐 敏1

(重慶市人民醫(yī)院：1.腫瘤血液科；2.胸外科 400013)

目的 研究G蛋白耦聯(lián)受體30(GPR30)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及其與臨床主要病理特征的關(guān)系，并分析GPR30和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性，探討雌激素通過激活GPR30受體信號(hào)途徑調(diào)節(jié)NSCLC增殖的分子機(jī)制。方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)80例術(shù)后非小細(xì)胞肺癌組織樣本中GPR30和Ki-67的表達(dá)。加入17-β-雌二醇或G-1后，計(jì)數(shù)H1299細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，最后通過Western blot方法檢測(cè)G-1作用后ERK1/2的激活狀態(tài)以及cyclin D1和P16蛋白的表達(dá)。結(jié)果 GPR30更多表達(dá)在腺癌、低分化、Ⅲ期NSCLC腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； GPR30表達(dá)和Ki-67呈中度相關(guān)性(r=0.502，P=0.000)。E2(或G-1)促進(jìn)H1299細(xì)胞增殖，并且更多的細(xì)胞進(jìn)入S期；加入G-1后，磷酸化ERK1/2以及cyclin D1表達(dá)增加，而p16蛋白表達(dá)減少，以上效應(yīng)能被G-15或U0126預(yù)處理2 h阻斷。結(jié)論 雌激素通過激活GPR30-EGFR-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)H1299增殖。阻斷GPR30信號(hào)途徑可能成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)。

癌，非小細(xì)胞肺；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖；G蛋白耦聯(lián)受體30；ki-67

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占全部肺癌的80%，其發(fā)病及病理特點(diǎn)有明顯的性別差異，不論是否吸煙，女性更易發(fā)展為肺腺癌，雌激素信號(hào)途徑的激活可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展[1]。G蛋白耦聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)是新發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，已被證實(shí)參與乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制[2]。但在肺癌尤其是NSCLC中關(guān)于GPR30的研究鮮見報(bào)道。本研究擬在NSCLC術(shù)后組織中研究GPR30和Ki-67的表達(dá)及其與臨床主要病理特征的關(guān)系，并以人肺腺癌細(xì)胞株H1299為模型，探討雌激素通過激活GPR30受體信號(hào)途徑調(diào)節(jié)NSCLC增殖的分子機(jī)制，為研究NSCLC尤其是女性肺癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的肺癌腫瘤標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 NSCLC術(shù)后石蠟組織樣本隨機(jī)選取自本院2008年1月至2014年5月收治的80例NSCLC患者，術(shù)前均未接受過化放療，年齡43～78歲，平均67歲，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。H1299細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫，使用添加10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于含5%CO2飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，適時(shí)傳代。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 G-1和G-15購自德國Merck Chemicals，17β-雌二醇購自美國Sigma,U0126購自美國CST，ERK1 (pT202/)/ERK2 (pT185)Phospho單克隆抗體、Anti-ERK1單克隆抗體、cyclin D1單克隆抗體、p16單克隆抗體、Ki-67單克隆抗體，α-tublin單克隆抗體、GPR30 多克隆抗體購自英國ABCAM。M-PER哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒和BCA蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific，EZ-ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(ECL A液+ECL B液)購自以色列Bioind。

1.2.2 增殖實(shí)驗(yàn)分組 取第三代生長狀態(tài)良好的H1299細(xì)胞，先根據(jù)實(shí)驗(yàn)第3天加入的不同處理藥物分為溶劑、E2、G-1 3組，再根據(jù)處理藥物加入前2 h加入的抑制劑分別分為3組，共9組：溶劑、溶劑(G-15)、溶劑(U0126)，E2、E2(G-15)、E2(U0126)，G-1、G-1(G-15)、G-1(U0126)，括號(hào)內(nèi)為抑制劑。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)Elivision Plus法檢測(cè)組織中GPR30和Ki-67的表達(dá)，用已知的陽性切片作陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) H1299細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板。用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換為無酚紅的只含有2% 活性炭處理過的胎牛血清的培養(yǎng)基，并加入不同的處理藥物，每兩天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。細(xì)胞分別在處理后第3天用胰酶消化后收集起來，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞用胰酶消化制成細(xì)胞懸液(濃度為5×105/mL)，平鋪于6孔板中，每孔加入2 mL，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，按不同分組進(jìn)行藥物處理。24 h后消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次，殘留50 μL PBS，輕輕彈擊離心管底部，適當(dāng)分散細(xì)胞，加入1 mL冰浴預(yù)冷的70% 乙醇輕輕吹打混勻，-20 ℃冰箱固定過夜，離心去除固定液，預(yù)冷PBS洗滌1次，加入500 μL配制好的碘化丙啶染色液37 ℃避光溫育30 min，300目(孔徑40～50 μm)尼龍網(wǎng)過濾，BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析周期分布。

1.2.6 Western blot法 Western blot法檢測(cè)cyclin D1、p16、磷酸化ERK1/2、Anti-ERK1蛋白在H1299細(xì)胞株中的表達(dá)。按說明書提取各細(xì)胞株總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒操作說明測(cè)定蛋白濃度，樣品均定量為5 g/L，每條泳道上樣60 μg蛋白，經(jīng)12% 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓80 V經(jīng)80 min電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5% 脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗，4℃ 孵育過夜。TBST洗膜后，用二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗，ECL發(fā)光并以凝膠顯像儀顯像。

1.2.7 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲法觀察，對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽性染色為棕黃色顆粒，GPR30表達(dá)在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)；Ki-67表達(dá)在細(xì)胞核。綜合染色強(qiáng)度和分布范圍進(jìn)行評(píng)分，陰性為0分；染色弱或細(xì)胞質(zhì)染色的細(xì)胞數(shù)小于10%為1分；染色清晰或染色強(qiáng)者細(xì)胞數(shù)10%～50% 為2分，染色強(qiáng)者細(xì)胞數(shù)大于50% 為3分。0～1分為陰性，2分及以上者為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析用Spearman法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果用mean±SD表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPR30表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 GPR30表達(dá)在腺癌、低分化、Ⅲ期腫瘤表達(dá)率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；盡管和性別以及腫瘤大小的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在女性以及直徑大于5 cm的腫瘤表達(dá)率更高；GPR30表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)，見圖1及表1。

A：NSCLC組織陰性對(duì)照；B：GPR30在NSCLC組織中的表達(dá)；C：Ki-67在NSCLC組織中的表達(dá)。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)GPR30和Ki-67在NSCLC組織中的表達(dá)(SP×400)

a：腺癌與鱗癌相比較。

2.2 GPR30表達(dá)在NSCLC組織樣本中與Ki-67表達(dá)具有相關(guān)性 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示GPR30的陽性表達(dá)率為46.25%(37/80)，Ki-67為60.00%(48/80),兩者經(jīng)Spearman相關(guān)性分析呈正相關(guān)(r=0.502，P=0.000)，見圖1及表2。

表2 NSCLC 組織中GPR30與Ki-67的相關(guān)性

2.3 激活GPR30促進(jìn)了H1299細(xì)胞增殖 GPR30作為新的雌激素受體能與E2相結(jié)合，從而改變細(xì)胞的生物學(xué)功能。H1299細(xì)胞雖然不表達(dá)經(jīng)典的雌激素受體ER，但GPR30表達(dá)陽性，因而能與E2結(jié)合。發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)第3天，加入E2或GPR30特異性激動(dòng)劑G-1，H1299細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(P<0.01，圖2)。

a:P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖2 E2或G-1促進(jìn)H1299細(xì)胞增殖

2.4 激活GPR30對(duì)H1299細(xì)胞周期的影響 以G-1作為GPR30的刺激因素觀察GPR30對(duì)H1299細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入G-1后第3天，更多的細(xì)胞進(jìn)入了S期(25.17%)，見圖3。

圖3 經(jīng)過不同藥物處理H1299細(xì)胞3 d后周期的分布

圖4 不同作用時(shí)間的G-1在H1299細(xì)胞引起cyclin D1和 p16蛋白表達(dá)

2.5 GPR30促增殖作用與EGFR-MAPKs信號(hào)途徑相關(guān) 在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中也觀察到在加入E2(或G-1)前用GPR30特異性拮抗劑G-15或MEK1/2 抑制劑U0126預(yù)處理2 h后，E2(或G-1)的促增殖作用被抑制(P<0.01)。見圖2。類似的，在細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用G-15或U0126預(yù)處理后，細(xì)胞被阻滯在了G1期(69.44%，79.17%)，見圖3。進(jìn)一步用Western blot方法檢測(cè)了EGFR-MAPKs途徑的重要信號(hào)分子ERK1/2的激活狀態(tài)以及下游的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1和p16蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在加入G-1后，磷酸化ERK1/2以及cyclin D1表達(dá)增加，而p16蛋白表達(dá)減少；而用G-15或U0126預(yù)處理2 h后，則變化相反(圖4、5)。

圖5 G-1在H1299細(xì)胞通過EGFR-MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)cyclin D1和 p16蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來在激素相關(guān)的惡性腫瘤組織，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等中發(fā)現(xiàn)GPR30存在表達(dá)增加[2]。GPR30在大鼠肺部腫瘤也被檢測(cè)到高水平表達(dá)，可能與雌激素引起的擴(kuò)增信號(hào)應(yīng)答有關(guān)[3]。GPR30在人類肺癌中的表達(dá)鮮見報(bào)道，國外2012年發(fā)表的一項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，相較于正常肺組織和正常肺支氣管上皮細(xì)胞，GPR30的表達(dá)在NSCLC組織及細(xì)胞系明顯增高[4]。Ki-67是一種增殖細(xì)胞核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)GPR30在女性以及直徑大于5 cm的NSCLC組織腫瘤表達(dá)率更高，與Ki-67的表達(dá)也呈正相關(guān)，提示GPR30在NSCLC的增殖中可能發(fā)揮作用。

GPR30不僅能通過其他信號(hào)途徑間接調(diào)節(jié)雌激素的功能，也能直接與內(nèi)源性雌激素、環(huán)境雌激素、三苯氧胺、特異性激動(dòng)劑G-1等結(jié)合影響下游的快速(非基因組)/慢速(基因組)效應(yīng)[2]。大量的研究已經(jīng)證明，雌激素能促進(jìn)表達(dá)經(jīng)典雌激素受體ERα和ERβ的NSCLC細(xì)胞株增殖[5]。NSCLC細(xì)胞株H1299表達(dá)GPR30，但不表達(dá)經(jīng)典的雌激素受體ER，可作為較好的研究GPR30的模型。本研究選用E2以及G-1作為GPR30的激活因素,發(fā)現(xiàn)兩者均能促進(jìn)H1299細(xì)胞株增殖，加入GPR30特異性拮抗劑G-15后能抑制其促增殖效應(yīng)，提示E2或G-1是通過激活GPR30受體促進(jìn)增殖。

GPR30屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，與其他GPCRs家族成員類似，雌激素或其他配體與GPR30結(jié)合后，GPR30活化其偶聯(lián)G蛋白，解離出αβγ亞基進(jìn)而激活Src相關(guān)酪氨酸激酶，接著活化基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)促使肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)釋放，后者反式激活表皮生長因子受體EGFR，隨后活化下游多條信號(hào)途徑，繼而參與細(xì)胞的增殖、遷徙和分化等，其中以EGFR-MAPKs途徑最為重要。在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、甲狀腺癌和頭頸部鱗癌等多種不同來源的腫瘤細(xì)胞系中都存在GPR30被配體激活后通過反式激活EGFR-MAPKs途徑而促進(jìn)增殖的現(xiàn)象[6]。對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)可能是GPR30影響增殖的重要機(jī)制，如c-fos，c-jun，cyclin D1、D2，p21,p53等與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的一些重要分子位于GPR30-EGFR-MAPKs信號(hào)途徑的下游[7]。細(xì)胞周期蛋白cyclin D1是原癌基因，其編碼的蛋白產(chǎn)物與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4或CDK6在細(xì)胞G1期，通過抑制CDK4的活性在細(xì)胞周期G1-S檢查點(diǎn)中發(fā)揮正性調(diào)控作用，啟動(dòng)細(xì)胞周期并促進(jìn)DNA合成，加速細(xì)胞增殖。p16基因作為腫瘤抑制基因，該基因編碼的蛋白可與cyclin D1蛋白競(jìng)爭調(diào)控CDK4/CDK6的活性，有效阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。大多數(shù)惡性腫瘤存在p16蛋白表達(dá)下調(diào),在NSCLC組織中也檢測(cè)到p16、cyclin D1蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[8]。在甲狀腺癌細(xì)胞系，GPR30的激活通過上調(diào)cyclin D1表達(dá)而促進(jìn)增殖[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，更多的H1299細(xì)胞在G-1作用后進(jìn)入了S期，且EGFR-MAPKs信號(hào)途徑的關(guān)鍵分子ERK1/2活化增加，下游的細(xì)胞周期蛋白cyclin D1增加，p16蛋白表達(dá)下調(diào)，以后效應(yīng)均能被G-15以及MEK1/2 抑制劑U0126阻斷，提示EGFR-MAPKs途徑參與了GPR30被激活后促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖作用。

本研究結(jié)果證實(shí)了雌激素能通過GPR30-EGFR-MAPKs途徑促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖，為探討NSCLC發(fā)病特點(diǎn)的性別差異提供新的思路，對(duì)其分子機(jī)制的進(jìn)一步研究將有助于尋找新的治療靶點(diǎn)和制定新的治療策略。

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Study on the role of GPR30 in the proliferation of Non-small cell lung cancer*

RuanShuqin1,HuangWei2△,YangZhixiang1,WeiFeng1,TangMin1

(1.DepartmentofOncologyandHematology;2.DepartmentofThoracicSurgery,ChongqingGeneralHospital,Chongqing400013,China)

Objective To evaluate the expression of GPR30 and Ki-67 in Non-small cell lung cancer(NSCLC)and the relationship between them.The clinicopathological features of GPR30 in NSCLC were also analyzed.The molecular mechanism that estrogen mediated the proliferation of H1299 by activating GPR30 was further studied.Methods The expression of GPR30 and Ki-67 in 80 cases of specimens of NSCLC after surgery was examined using immunohistochemistry method.After 17-β-estradiol(E2)or G-1 added,H1299 cells were counted and the cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry.Finally,the activated ERK1/2 and the expression of cyclin D1 and p16 after G-1 treatment in H1299 cells were examined through western blotting.Results Expressions of GPR30 was more in stage Ⅲ or low differentiation tissues or adenocarcinoma (P<0．05).A positive correlation between GPR30 and Ki-67 was further disclosed (r=0.502，P=0.000).The proliferation of H1299 cells was promoted and more cells entered S-phase after E2or G-1 treatment for 3 days,which could be inhibited after G-15 or U0126 pre-treatment for 2 hours.We further discovered that the activated ERK1/2 and cyclin D1 expression increased after G-1 treatment,which was blocked after G-15 or U0126 pre-treatment for 2 hours.The change of p16 was on the opposite.Conclusion A positive correlation existed between GPR30 and Ki-67.GPR30-EGFR-MAPKs signaling transduction pathway was involved in the estrogen-induced proliferation of NSCLC cells.Blocking GPR30 signaling pathway may be a promising new strategy for NSCLC treatments.

carcinoma,non-small-cell lung；cell cycle;cell proliferation；G protein-coupled receptor 30；ki-67

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.013

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2013-2-111)；重慶市渝中區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20130144)。 作者簡介：阮姝琴，博士，副主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤綜合治療及研究工作?！?/p>

，E-mail:jiangjj26@163.com。

R734.2

A

1671-8348(2017)05-0615-04

2016-07-21

2016-09-19)