張 雪，蘭 東，寧淑華，冉立偉，賈紅俠，于思思，王曉軍

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院皮膚與醫(yī)療美容科，北京 100043；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院美容外科，北京 100730)

A型肉毒毒素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制*

張 雪1，蘭 東1，寧淑華1，冉立偉1，賈紅俠1，于思思1，王曉軍2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院皮膚與醫(yī)療美容科，北京 100043；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院美容外科，北京 100730)

目的 探討A型肉毒毒素(BTXA)對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。方法 0(對照組)、0.2、0.4、0.8 U/mL的BTXA作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活力，Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，免疫印跡法分析細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的激活狀況。結(jié)果 與對照組(0.75±0.07)比較，0.2、0.4、0.8 U/mL的BTXA(0.59±0.06、0.43±0.04、0.34±0.03)可明顯降低增生性成纖維細(xì)胞活力；與對照組[(2.38±0.24)%]比較，可顯著提高細(xì)胞凋亡率[(15.79±1.54)%、(27.32±2.69)%、(38.46±3.90)%]；下調(diào)Cyclin D1及PCNA表達(dá)，降低PI3K表達(dá)及AKT磷酸化水平，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 BTXA可通過阻斷PI3K/AKT信號通路及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制增生性細(xì)胞增殖。

肉毒毒素類；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞周期；增生性瘢痕；磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B信號通路

創(chuàng)面愈合的同時會導(dǎo)致瘢痕的產(chǎn)生，使患者在燒傷或者創(chuàng)面愈合時產(chǎn)生高低不平，形狀不規(guī)則，局部潮紅并伴有灼痛感及瘙癢感的增生性瘢痕。而且當(dāng)增生性瘢痕發(fā)生在面部、關(guān)節(jié)、手時，會導(dǎo)致攣縮的產(chǎn)生，產(chǎn)生嚴(yán)重的功能障礙，影響美觀，給患者帶來巨大的生理心理負(fù)擔(dān)，是整形科及燒傷科亟待解決的難題之一[1-2]。研究已顯示，成纖維細(xì)胞在瘢痕形成過程中起重要作用，細(xì)胞數(shù)目的增加，凋亡的不足，進(jìn)而大量分泌膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，是增生性瘢痕形成的機(jī)制之一[3-4]。A型肉毒毒素(BTXA)是20世紀(jì)90年代初開始用于美容整形外科的一種生物制劑，臨床上主要用于去除魚尾紋、眉間紋、抬頭紋等，或者用于面部輪廓的重塑，安全有效[5]。近些年臨床及動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，BTAX對增生性瘢痕具有顯著療效[6-8]。此外國內(nèi)外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，BTXA不僅能抑制膠原蛋白生成，還能顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，但是具體作用機(jī)制未知。所以本研究將探討B(tài)TXA對于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用及具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 BTXA購于蘭州生物制品研究所。兔細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)抗體購自美國Epitmics公司；兔磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Gibco公司；Hoechst染色試劑盒，細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；FACSAria?Fusion型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一儀器廠，TS100倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3 瘢痕組織標(biāo)本來源 10份標(biāo)本取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院同期住院并進(jìn)行手術(shù)的臨床燒傷患者所切除的瘢痕組織，患者男7例，女3例，年齡11～47歲，平均年齡29歲，病程3個月至2年?；颊唏：劢M織紅、癢、痛癥狀明顯，說明瘢痕處于增生期，另外取材前所有患者皆無用藥史，且知情并簽署了同意書。

1.4 方法

1.4.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的制備[9]在手術(shù)過程中獲得的增生性瘢痕組織，置于無菌操作臺中，用手術(shù)剪將皮下組織徹底去除，保留帶表皮的瘢痕組織，并將瘢痕組織切成1 mm×1 mm的小組織塊，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈后，加入0.25 g/LⅡ型中性酶，4 ℃過夜后，再加入3倍體積的2%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃培養(yǎng)2 h，即可獲得單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心10 min，并將細(xì)胞溶解于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。7 d后首次換液，往后每隔3 d換液1次，大約15 d細(xì)胞基本融合成片，以1∶2的比例進(jìn)行傳代，實驗取2～4代。

1.4.2 MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基后。加入濃度為0、0.2、0.4、0.8 U/mL的BTXA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入終濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將上清液棄去，并加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩搖勻，在酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度(A)值。

1.4.3 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基后。加入濃度為0、0.2、0.4、0.8 U/mL的BTXA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，染色、固定并于顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.4.4 細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基后。加入濃度為0、0.2、0.4、0.8 U/mL的BTXA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。按細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.4.5 Western blot 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基后。加入濃度為(0、0.2、0.4、0.8 U/mL)的BTXA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，于4 ℃，10 000 r/min離心10 min，獲得蛋白樣品。二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白煮沸變性，并上樣，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉凝膠電泳1～2 h后，濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min，5%脫脂奶粉封閉1 h后，于一抗溶液4 ℃過夜孵育，次日二抗溶液室溫孵育1 h，最后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。并用Quantity one軟件分析各蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的影響 與對照組(0.75±0.07)比較，0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA(0.59±0.06、0.43±0.04、0.34±0.03)可明顯抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡情況的影響 與對照組[(2.38±0.24)%]比較，0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA可明顯提高增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力，其凋亡率分別為[(15.79±1.54)%、(27.32±2.69)%、(38.46±3.90)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡情況的影響(×200)

組別G1(%)S(%)G2(%)對照組48.36±4.8432.87±3.2920.16±2.070.2U/mL55.28±5.53a24.56±2.46a18.77±1.88a0.4U/mL63.49±6.50a21.59±2.16a14.92±1.49a0.8U/mL72.29±7.30a19.01±2.00a8.70±0.82a

a:P<0.05，與對照組比較。

2.3 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 與對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA能使G1期細(xì)胞數(shù)目明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少，G2期細(xì)胞數(shù)目也明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從而說明BTXA可使增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期停滯在G1期。見表1。

2.4 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白的影響 與對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA皆能明顯下調(diào)Cyclin D1及PCNA表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

a:P<0.01，與對照組比較。

圖2 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白的影響

2.5 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞 PI3K/AKT信號通路的影響 與對照組比較，0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA可明顯抑制PI3K表達(dá)，并降低AKT磷酸化水平，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

a:P<0.01，與對照組比較。

圖3 BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響

3 討 論

BTXA是目前用于神經(jīng)毒理作用并且研究較為透徹的生物制劑，近年來發(fā)現(xiàn)其在整形美容中也具有一定的治療作用，其應(yīng)用領(lǐng)域也不斷拓寬，成為許多臨床手術(shù)的輔助手段或者一線治療方法。臨床研究表明，BTXA能減輕早期增生性瘢痕所引起的痛癢，能夠促進(jìn)瘢痕軟化及萎縮，減輕攣縮，并使瘢痕顏色變淡，變平整，彈性更好[7-8]。而且國內(nèi)學(xué)者的研究不僅證實了不同濃度的BTXA不僅能夠抑制膠原蛋白的表達(dá)，還能顯著地抑制人增生性瘢痕成纖維增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[10-11]。Jeong等[12]研究表明BTXA能顯著抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分化及腫瘤壞死因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)。Xiao等[13]研究也表明BTXA通過降低結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)，從而抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的生長及增殖。從而說明BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，所以本研究將在此基礎(chǔ)上探討B(tài)TXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖抑制作用、凋亡誘導(dǎo)作用的具體機(jī)制。

本研究首先結(jié)合已報道文獻(xiàn)[10]及MTT預(yù)試驗獲得0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA對增生性成纖維細(xì)胞活力具有顯著的抑制作用，接著采用Hoechst染色法證實此劑量BTXA還能顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞的增殖受細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞周期的紊亂可能是成纖維細(xì)胞過度增殖的原因之一[14]。所以本研究繼續(xù)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BTXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明0.2、0.4、0.8 U/mL BTXA能顯著地延長G1期，而縮短S期及G2期，說明BTXA使細(xì)胞周期阻滯在G1期，導(dǎo)致細(xì)胞DNA復(fù)制和有絲分裂產(chǎn)生障礙，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期的調(diào)控由細(xì)胞周期蛋白調(diào)控，其中Cyclin D1與G1期密切相關(guān)，其表達(dá)量的增加說明了細(xì)胞加快進(jìn)入了S期。另外PCNA是細(xì)胞核內(nèi)DNA聚合酶輔助蛋白，其表達(dá)量與S期密切相關(guān)，并在S期表達(dá)量達(dá)到頂峰，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的有效指標(biāo)。本研究顯示，BTXA能顯著下調(diào)Cyclin D1及PCNA表達(dá)，從而說明BTXA通過抑制G1期及S期相關(guān)蛋白表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，并最終抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞的增殖與凋亡受多種信號通路調(diào)控，其中PI3K/AKT信號通路最為常見，并具有抗凋亡通路之稱，此通路與細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、分化周期密切相關(guān)。具體表現(xiàn)為PI3K接受到上游刺激信號后，被激活，從而促使4-二磷酸脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸脂酰肌醇，并磷酸化AKT，AKT轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)下游基因(Cyclin D1及PCNA)的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究顯示增生性瘢痕中PI3K/AKT信號通路被激活[15]。所以本研究繼續(xù)探討B(tài)TXA對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中PI3K/AKT激活情況的影響。Western blot結(jié)果表明，BTXA能顯著抑制PI3K表達(dá)，并降低AKT磷酸化水平，從而說明BTXA通過抑制PI3K/AKT信號通路，下調(diào)Cyclin D1及PCNA表達(dá)，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，最終抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Study of mechanism and inhibition of botulinum toxin type A on hypertrohic scar fibroblasts*

ZhangXue1，LanDong1，NingShuhua1，RanLiwei1，JiaHongxia1，YuSisi1，WangXiaojun2

(1.DepartmentofDermatologyandPlasticSurgery，theAffiliatedChaoyangHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100043，China;2.DepartmentofCosmeticSurgery,theAffiliatedBeijingUnionHospitalofChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China)

Objective To explore the mechanism and inhibition of botulinum toxin type A (BTXA)on hypertrohic scar fibroblasts.Methods The cells were treated by 0 (control),0.2,0.4,0.8 U/ml BTXA for 48 h.Cell viability was detected by MTT assay.Cell apoptosis was detected by Hoechst staining.Cell cycle was detected by flow cytometry.The level of cell cycle related protein D1 (Cyclin D1),proliferation nuclear antigen (PCNA)and activation of phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/ protein kinase B (AKT)signaling pathway were assayed by western blot.Results Compared with control group(0.75±0.07),0.2,0.4,0.8 U/mL BTXA(0.59±0.06,0.43±0.04,0.34±0.03)inhibited hypertrohic scar fibroblasts cell viability,increased cell apoptotic rate[control group(2.38±0.24)%;BTXA(15.79±1.54)%,(27.32±2.69)%,(38.46±3.90)%],down-regulated the expression of Cyclin D1(control group 1.57±0.18;BTXA 0.93±0.07,0.42±0.04,0.35±0.03)and PCNA(control group 1.46±0.16；BTXA 0.50±0.05,0.59±0.05,0.37±0.03),inhibited the expression of PI3K(control group 0.98±0.06；BTXA 0.49±0.04,0.50±0.04,0.39±0.03)and the phosphorylation of AKT(control group 1.38±0.08；BTXA 0.97±0.06,0.60±0.04,0.29±0.02),made cell cycle arrested in G1phase,The difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion These results suggested BTXA inhibit proliferation via blocking the activation of PI3K/AKT signal pathway and down-stream related cell cycle related protein.

botulinum toxins;fibroblasts;cell cycle;hypertrohic scar;phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signal pathway

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81071571)。 作者簡介：張雪(1981-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事創(chuàng)面修復(fù)、瘢痕治療方面的研究。

R619+6

A

1671-8348(2017)05-0580-03

2016-06-19

2016-08-17)