（獲嘉縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南獲嘉453800）

奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

李鳳琴，王明武

（獲嘉縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南獲嘉453800）

奶牛乳房炎一直是奶牛場(chǎng)危害大、花費(fèi)高、防治難的重大疾病之一，不但造成牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降，影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)，乳房炎的存在也使乳品安全面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)。

奶牛乳房炎是指奶牛乳腺受到微生物、物理、化學(xué)等刺激所發(fā)生的一種炎性變化，其特點(diǎn)是乳汁發(fā)生理化性質(zhì)變化，特別是白細(xì)胞增加，以及乳腺組織發(fā)生病理學(xué)變化。根據(jù)其表現(xiàn)形式通常可以將乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎，隱性乳房炎是奶牛乳房炎中最常見(jiàn)的一種乳腺內(nèi)感染，乳房乳汁沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的異常，只有借助特殊的檢測(cè)方法才能檢測(cè)出乳汁的一些變化。臨床型乳房炎則有明顯的癥狀。許多隱性乳房炎直到轉(zhuǎn)變成臨床型乳房炎才被發(fā)現(xiàn)主要是因?yàn)槠渑R床癥狀不明顯而被忽視，故在奶牛群中此病存在較為廣泛，造成的損失也很大。近幾年，我國(guó)的一些地區(qū)進(jìn)行了關(guān)于奶牛乳房炎的普查，結(jié)果表明，北京奶牛乳區(qū)陽(yáng)性率為31%，浙江的奶牛乳區(qū)陽(yáng)性率36%～55%，上海的奶牛乳區(qū)陽(yáng)性率為38.5%～51.2%。

各種各樣的微生物分布在奶牛的生活環(huán)境中，其中導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原微生物大致可以分為兩類：一類是革蘭氏陽(yáng)性菌，包括葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌等；另一類是革蘭氏陰性菌，主要是大腸菌群。奶牛乳房炎的病原微生物的種類有很多，但是從文獻(xiàn)報(bào)道中可知，奶牛乳房炎的病原微生物大多是大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌。其中金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、牛支原體等是引起乳房炎最主要的傳染性病原菌，這些病原體通過(guò)很多途徑感染牛只。環(huán)境性病原菌有大腸桿菌、變形桿菌、肺炎克雷伯菌等，這些病原菌普遍存在于環(huán)境中，環(huán)境條件惡劣和乳頭損傷的條件下造成病原菌感染的機(jī)率最大。

此外，遺傳因素，環(huán)境因素，疾病繼發(fā)以及飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)榷喾矫嬉蛩匾矔?huì)引起致病菌擴(kuò)散從而引發(fā)奶牛乳房炎。楊章平報(bào)道了奶牛隱性乳房炎的發(fā)生與飼養(yǎng)管理的關(guān)系很大，發(fā)生率隨著季節(jié)不同而不同，在第三季度隱性乳房炎發(fā)生率是最高的。

該試驗(yàn)是在獲嘉縣某奶牛場(chǎng)采集材料，由于各方面的因素，該場(chǎng)奶牛乳房炎的發(fā)病情況也日益升高，多次治療不見(jiàn)好轉(zhuǎn)，再加上不按照規(guī)定使用抗生素，不少病原微生物產(chǎn)生不同程度的耐藥性，這給乳房炎的治療增加了不少難度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源

從獲嘉縣一奶牛場(chǎng)挑選8頭患有乳房炎的病牛，采集奶樣10份。采樣前先用清水清洗乳房，清洗消毒后用消毒紙巾擦干，棄去前3把奶，采集約15ml奶樣于滅菌瓶中，加蓋封緊并做好標(biāo)記，將采集好的奶樣迅速放入冰水中或冷藏，盡快檢測(cè)。

1.1.2 培養(yǎng)基

普通瓊脂培養(yǎng)基（上海哈靈生物有限公司），血瓊脂培養(yǎng)基（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，麥康凱培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司），伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司），M-H瓊脂培養(yǎng)基（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 主要儀器

試驗(yàn)用到的儀器主要有：冰箱（海爾），光學(xué)顯微鏡（北京光電儀器公司），生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），超凈工作臺(tái)（天津醫(yī)療設(shè)備儀器廠），高壓滅菌箱（香港安捷來(lái)國(guó)際股份公司），微量生化管（杭州天和微生物試劑有限公司）等。

1.1.4 藥敏紙片

頭孢三嗪、青霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、頭孢氨芐、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、磺胺甲噁唑、紅霉素、新霉素、呋喃唑酮、復(fù)方磺胺TMP、鏈霉素、頭孢唑啉，均購(gòu)于杭州微生物制劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純培養(yǎng)

將10份奶樣搖晃均勻，在超凈臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌接種環(huán)以劃線法接種到血瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃的生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，再挑取可疑菌落選擇性接種于麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板上進(jìn)一步培養(yǎng)。同時(shí)做好記錄。

1.2.2 涂片染色鏡檢

滴一滴生理鹽水于載玻片中央，用無(wú)菌接種環(huán)挑取平板上的單個(gè)菌落，與生理鹽水混勻，室溫下自然干燥后經(jīng)火焰固定。在干燥固定后的涂片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液進(jìn)行初染，1 min后水洗；滴加革蘭氏碘溶液于涂片上媒染，1 min后水洗；再加95%酒精進(jìn)行脫色，30 s后水洗；最后滴加石碳酸復(fù)紅進(jìn)行復(fù)染，約1 min后水洗，自然干燥。在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈粉紅色。

1.2.3 生化鑒定

依據(jù)以上試驗(yàn)的結(jié)果，分別對(duì)純化的各菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定：取疑似鏈球菌進(jìn)行CAMP試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)，七葉苷水解試驗(yàn)等；取疑似大腸桿菌進(jìn)行生化鑒定，包括MR、枸櫞酸鹽、VP、吲哚、糖發(fā)酵等試驗(yàn)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

紙片擴(kuò)散法：在無(wú)菌室超凈臺(tái)上，用無(wú)菌鑷子取出藥敏紙片并均勻地貼在涂有細(xì)菌的平皿培養(yǎng)基表層，用鑷子輕按幾下藥敏片，使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼。將準(zhǔn)備好的藥敏片按順序依次均勻平鋪在瓊脂平板上，做好標(biāo)記，放在生化培養(yǎng)箱里37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)皿測(cè)量抑菌圈直徑，記錄好藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑在0～10 mm的為不敏感；10～15 mm的為中度敏感；15～20 mm的為高度敏感；大于20 mm的為極度敏感。

1.2.5 藥物治療

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇高敏藥物復(fù)方阿莫西林和頭孢氨芐對(duì)患乳房炎的8頭奶牛分別進(jìn)行治療，每頭每次肌肉注射復(fù)方阿莫西林注射液（規(guī)格12 g）12 g和靜脈注射頭孢氨芐注射液（規(guī)格10 g）10 g，每天1次，連用3 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

在7份奶樣中共分離到8個(gè)菌株，其中A類細(xì)菌3株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上長(zhǎng)有灰白色、邊緣整齊、隆起、光滑濕潤(rùn)、圓形菌落，在麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂上分別形成紅色菌落和亮黑色菌落，在血瓊脂上不生長(zhǎng)；B類細(xì)菌5株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)狀況不好，在麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂上不能生長(zhǎng)，在血瓊脂平板上生長(zhǎng)淡灰色、黏稠、隆起的菌落，并溶血。

2.2 鏡檢結(jié)果

將分離培養(yǎng)的兩種細(xì)菌分別涂片染色鏡檢：A菌粉紅色，為革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓，中等大小細(xì)長(zhǎng)桿菌；B菌藍(lán)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈短鏈、長(zhǎng)鏈的球菌。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)，染色特性以及生化試驗(yàn)結(jié)果，可初步判定所分離菌中A為無(wú)乳鏈球菌，B為大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離菌株分別用15種藥物做藥敏試驗(yàn)，在這15種抗菌藥中青霉素、磺胺類藥物對(duì)其幾乎無(wú)抑菌作用；氨芐青霉素、新霉素和丁胺卡那霉素抑菌圈直徑在中敏范圍內(nèi)，說(shuō)明具有較好的抑菌效果；頭孢氨芐和復(fù)方阿莫西林的抑菌圈直徑最大，說(shuō)明它們對(duì)大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌最敏感。

2.5 藥物治療結(jié)果

用藥3 d后，觀察到8頭患病牛乳區(qū)紅腫消失，乳中無(wú)凝塊，乳色正常，7 d后再觀察8頭病牛沒(méi)有復(fù)發(fā)現(xiàn)象，治愈率100%。

3 討論

該試驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)病原菌的分離培養(yǎng)、生化特性、形態(tài)染色特性等鑒定，結(jié)果可以看出檢測(cè)的7份奶樣里分離出的8個(gè)菌株中有3個(gè)為大腸桿菌，5株是無(wú)乳鏈球菌，與國(guó)內(nèi)胡松華等報(bào)道基本上一致。該試驗(yàn)檢出的病原菌主要是無(wú)乳鏈球菌，與盧體康等報(bào)道有些許差異。此次試驗(yàn)的結(jié)果也有一些局限性，因?yàn)樵囼?yàn)樣品較少。藥敏試驗(yàn)結(jié)果中可優(yōu)先考慮復(fù)方阿莫西林和頭孢氨芐這些藥物做臨床上的治療，因大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌對(duì)其最敏感；對(duì)于丁胺卡那霉素、氨芐青霉素和新霉素也可以考慮配合使用，因?yàn)樗鼈冇辛己玫囊志Ч换前奉愃幬?、青霉素抑菌效果最差，幾乎無(wú)效，臨床治療用藥時(shí)這些藥物就可以不考慮。

引起乳房炎的因素有很多，除了與病原菌直接相關(guān)外，還與保健措施、奶牛健康狀況、飼養(yǎng)管理狀況、衛(wèi)生條件等多種因素有關(guān)。因此，要從根本上控制奶牛乳房炎，在進(jìn)行科學(xué)的藥物治療的同時(shí)，還必須有積極的綜合性防治辦法：①制定合理的擠奶制度：擠奶前可以用0.1%高錳酸鉀液，0.1%的新潔爾滅，2.5%～7.5%的碘液等消毒液清洗乳房和乳頭，藥浴乳頭可用1%碘伏溶液或其他藥浴液，藥浴10～20 s后擦干乳頭，在第一泌乳期和第二泌乳期的乳牛擠奶前藥浴乳頭效果最好。擠奶要把乳汁擠干凈，冬天乳頭可涂適量凡士林防干裂，夏天在擠完乳后用藥浴液浸泡乳頭，藥浴能有效減少致病菌的感染。②搞好環(huán)境衛(wèi)生：牛舍內(nèi)保持干燥通風(fēng)，糞便及時(shí)清理，投喂飼料時(shí)掉落的散料及時(shí)清理，糞便更要及時(shí)清理，尤其是夏季。③做好奶牛乳房炎的檢測(cè)診斷：盡可能做到早發(fā)現(xiàn)早治療以提高治愈率。不僅是在擠奶的時(shí)候，飼喂奶牛時(shí)也要多加注意奶牛乳房，一旦發(fā)現(xiàn)病牛要及時(shí)隔離，然后盡快治療，以免病原擴(kuò)散，感染其他牛只。④加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：制定科學(xué)的飼養(yǎng)管理辦法，用科學(xué)的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和制度養(yǎng)牛，對(duì)奶牛進(jìn)行全價(jià)飼養(yǎng)。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)共分離出8株細(xì)菌，無(wú)乳鏈球菌有5株，大腸桿菌有3株。用15種藥物對(duì)這8株細(xì)菌進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，復(fù)方阿莫西林和頭孢氨芐對(duì)大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌最敏感。該奶牛場(chǎng)選擇復(fù)方阿莫西林、頭孢氨芐為臨床治療場(chǎng)內(nèi)奶牛乳房炎的藥物，最終取得了良好的治療效果，有效控制了病情。□

S858.23＋6

B

1004-5090（2017）07-0045-02