戚亞偉，胡傳銀，陳紹紅，趙云濤，劉鈾

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科研究所，廣東 湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；3.廣東海洋大學(xué)現(xiàn)代生化中心，廣東 湛江 524088)

非酶糖基化終末產(chǎn)物介導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌中的作用

戚亞偉1，胡傳銀2，陳紹紅3，趙云濤3，劉鈾3

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科研究所，廣東 湛江 524001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；3.廣東海洋大學(xué)現(xiàn)代生化中心，廣東 湛江 524088)

目的探討非酶糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響及其潛在機(jī)制。方法首先，原代培養(yǎng)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，采用3β-HSD免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定；其次，MTT法測(cè)定不同濃度的AGEs(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)及200 μg/mL BSA作用Leydig細(xì)胞后的細(xì)胞活力；最后，用不同濃度的AGEs及200 μg/mL BSA預(yù)處理Leydig細(xì)胞12 h，之后更換含相應(yīng)濃度AGEs或BSA的培養(yǎng)基并加入終濃度為4 U/mL的hCG，其中對(duì)照組不含AGEs和BSA，ELISA法和Western blot分別檢測(cè)睪酮分泌量和p-ERK1/2的表達(dá)量。結(jié)果MTT法表明AGEs(≤200 μg/mL)對(duì)Leydig細(xì)胞的活力在本實(shí)驗(yàn)所研究的時(shí)間內(nèi)沒有影響；ELISA法和Western blot結(jié)果顯示，不同濃度AGEs處理后，hCG誘導(dǎo)的Leydig細(xì)胞睪酮合成量和ERK1/2蛋白的磷酸化都呈現(xiàn)濃度依賴性下降，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論AGEs通過抑制ERK1/2的磷酸化降低大鼠Leydig cells睪酮的分泌。

非酶糖基化終產(chǎn)物；睪丸間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；睪酮

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由多種病因引起的糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝紊亂的一種疾病。糖尿病(DM)損害男性的生殖健康，約有90%的糖尿病患者伴隨有性功能障礙，其中包括了性欲降低、陽(yáng)痿及不育等，研究人員已經(jīng)從結(jié)構(gòu)和生理功能上證明了糖尿病可以導(dǎo)致男性生殖系統(tǒng)紊亂[1-4]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)DM時(shí)持續(xù)的高糖環(huán)境造成的非酶糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的過量形成是引發(fā)糖尿病及其慢性并發(fā)癥的重要原因之一[5-6]。糖尿病可誘發(fā)睪酮分泌的下降[7]，但AGEs對(duì)睪丸間質(zhì)(Leydig)細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究將試圖探索AGEs對(duì)睪丸Leydig細(xì)胞分泌睪酮的影響及機(jī)制，以期揭示糖尿病引發(fā)生殖系統(tǒng)功能紊亂的部分機(jī)理。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8周齡SD雄性大鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 Ⅰ型膠原酶、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、多聚甲醛、脫氫表雄酮(DHEA)及牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司，Percoll(GE公司)，DMEM/F12、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，睪酮測(cè)定試劑盒(美國(guó)Cayman公司)，抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)抗體(Cell Signal公司)。

1.3 AGEs的制備[9]將終濃度為5 mg/mL的BSA與終濃度為50 mol/L的葡萄糖溶于10 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH 7.4)，置于37℃溫箱內(nèi)避光孵育。并向溶液中加入PMSF(1.5 mol/L)和EDTA (0.5 mol/L)的蛋白酶抑制劑和1%的雙抗，7周后，通過透析去除未結(jié)合的葡萄糖。其對(duì)照物BSA的制備和上述步驟相同，只是其中不加葡萄糖。根據(jù)AGEs自身特有的熒光特性，在370 nm激發(fā)波長(zhǎng)，440 nm發(fā)射波長(zhǎng)下，于熒光分光光度計(jì)(F-7000)上測(cè)定其熒光值(狹縫寬度5 nm)分別測(cè)定AGEs和BSA的熒光值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs的熒光值與BSA相比大幅度升高，約增加到了53倍。同時(shí)根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書說(shuō)明測(cè)定透析后AGEs和BSA的蛋白濃度AGEs的濃度為20.47 μg/mL，BSA的濃度為18.19 μg/mL。

1.4 Leydig細(xì)胞的分離、純化和鑒定 Leydig細(xì)胞的原代培養(yǎng)在參考Klinefelter等[9]和Chemes等[10]方法的基礎(chǔ)上做了一些改進(jìn)。具體如下：雄性SD大鼠通過CO2窒息處死，之后迅速的取出睪丸轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中，保持睪丸實(shí)質(zhì)完整，冰面上無(wú)菌剝離被膜及較大血管，使睪丸實(shí)質(zhì)保持完整。無(wú)菌PBS液清洗2～3遍，之后經(jīng)鑷子將睪丸實(shí)質(zhì)撥散，將睪丸置于0.05%的Ⅰ型膠原酶(PBS配置)中，34℃恒溫180 g消化30 min，使睪丸實(shí)質(zhì)散開，但生精小管未斷裂。用等體積的完全培養(yǎng)基(10%FBS的DMEM/F12)終止消化，經(jīng)消化后所得到的懸浮液體經(jīng)200目的篩網(wǎng)過濾，之后將濾液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 200 r/min離心5 min。之后用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮所得到的沉淀，所得到的細(xì)胞懸液加于4個(gè)不連續(xù)密度的Percoll梯度液上(從上到下：21%、26%、37%、60%)，離心(3 000 r/min、4℃)30 min，可看到有4條明顯的細(xì)胞帶，取37%與60%梯度之間(即第3條細(xì)胞帶)的細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL，置于34℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞活力經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)鑒定。由于Leydig特異的含有3β-HSD，故采用3β-HSD染色法鑒定Leydig細(xì)胞。貼壁24 h的Leydig細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，每次5 min，之后室溫下干燥1 h左右，接著加入新鮮配制的3β-HSD染色劑(染液由A和B組成。A液：1 mg NBT溶于0.6 mL含有1 mg/mL DHEA的DMSO中；B液：10 mg L DHE用溫暖的PBS溶解)染色90 min，之后經(jīng)超純水沖洗，4%的多聚甲醛固定，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 MTT法測(cè)定Leydig細(xì)胞活力 將分離純化的原代Leydig細(xì)胞接種于96孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組、AGEs組和BSA組，其中AGEs組設(shè)置四個(gè)濃度梯度，分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL及200 μg/mL，BSA組只一個(gè)濃度，為200 μg/mL，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，其中AGEs組和BSA組分別加入含相應(yīng)終濃度AGEs和BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基，對(duì)照組只用DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，棄去各孔中的培養(yǎng)基，PBS清洗2～3遍，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(50 mg MTT溶于10 mL的PBS中，0.22 μm濾膜過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配)，置于34℃培養(yǎng)箱中4 h，小心棄去溶液以免吸出孔中沉淀，之后每孔加入150 μL的DMSO，搖床上10 min，之后于490 nm處測(cè)定OD值。

1.6 AGEs對(duì)hCG刺激的大鼠Leydig細(xì)胞分泌睪酮的影響 將分離純化的原代Leydig細(xì)胞接種于6孔板中，將Leydig細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、hCG組、AGEs組和BSA組。其中AGEs組設(shè)置四個(gè)濃度梯度，分別為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL及200 μg/mL，BSA組只一個(gè)濃度，為200 μg/mL，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，不同濃度的AGEs組和BSA組分別加入含相應(yīng)終濃度的AGEs和BSA預(yù)處理12 h，對(duì)照組換DMEM/F12培養(yǎng)基，AGEs組和BSA組分別更換含相應(yīng)濃度的AGEs或BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基并加入終濃度為4 U/mL的hCG，hCG組換含終濃度為4 U/mL hCG的DMEM/ F12培養(yǎng)基，24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后，將上清液凍存于-80℃，待用于睪酮含量的測(cè)定。

1.7 睪酮的測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明操作測(cè)定睪酮的含量。

1.8 Western blot檢測(cè)磷酸化ERK1/2的表達(dá) 將原代分離的Leydig細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將Leydig細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、hCG組、AGEs組和BSA組。其中AGEs組設(shè)置三個(gè)濃度梯度，分別為50 μg/mL、100 μg/mL及200 μg/mL，BSA組只一個(gè)濃度，為200 μg/mL，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，不同濃度的AGEs組和BSA組分別加入含相應(yīng)終濃度的AGEs和BSA預(yù)處理Leydig 12 h之后，更換含相應(yīng)濃度AGEs或BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基并加入終濃度為4 U/mL的hCG，hCG組換只含4 U/mL的hCG DMEM/F12，對(duì)照組換DMEM/F12，處理48 h后，提取Leydig細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測(cè)ERK1/2磷酸化的情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用最小顯著差異法(LSD)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠Leydig細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 Percoll分離到的大鼠Leydig細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色法顯示，細(xì)胞存活率在95%以上。剛接種的Leydig細(xì)胞多呈圓形，未鋪展，12 h后細(xì)胞形狀呈圓形、多邊形或梭形，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胞體開始有細(xì)長(zhǎng)觸角伸出，24 h后長(zhǎng)梭形的細(xì)胞大量增殖、所占比例明顯增加，大多數(shù)細(xì)胞伸展開來(lái)，呈現(xiàn)拉絲狀或樹突狀，72 h后可觀察到細(xì)胞相互連接呈現(xiàn)典型的拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1)。接種24 h后的Leydig細(xì)胞經(jīng)3β-HSD特異性染色，由圖可見，大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)黑色，少數(shù)的細(xì)胞胞質(zhì)淡染，細(xì)胞純度達(dá)90%以上(圖2)。

圖1 大鼠Leydig細(xì)胞

圖2 大鼠睪丸Leydig細(xì)胞3β-HSD染色(標(biāo)尺為50 μm)

2.2 AGEs對(duì)Leydig細(xì)胞活力的影響 為了確定AGEs是否對(duì)大鼠睪丸Leydig細(xì)胞有毒性作用，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的活力，結(jié)果如圖3所示。將對(duì)照組Leydig細(xì)胞所測(cè)得的OD值定義為100%，各濃度AGEs組的OD值與BSA組和對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明AGEs處理48 h對(duì)Leydig細(xì)胞的活力沒有影響。

圖3 AGEs對(duì)大鼠Leydig細(xì)胞活力的影響

2.3 AGEs抑制睪酮的產(chǎn)生 經(jīng)試劑盒的測(cè)定，4 U/mL hCG誘導(dǎo)后的大鼠Leydig細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮的合成量大幅度增加，是對(duì)照組的2.73倍，差異達(dá)到極顯著(P＜0.01)。AGEs處理組中，隨著AGEs濃度的增加，hCG誘導(dǎo)的睪酮合成量開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中，與hCG處理組相比，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的AGEs處理組中睪酮合成量分別降低了26.2%、41.3%、51.4%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 不同濃度AGEs對(duì)hCG誘導(dǎo)的大鼠Leydig細(xì)胞睪酮分泌的影響

2.4 AGEs刺激睪丸Leydig細(xì)胞后p-ERK1/2蛋白水平的變化 由圖5可以看出，ERK有兩個(gè)異構(gòu)體，分別是ERK1和ERK2，分子質(zhì)量分別為42 kD、44 kD，對(duì)照組和BSA組不影響ERK1/2蛋白的活化，加入hCG后，ERK1/2的磷酸化明顯上調(diào)，是對(duì)照組的3.29倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。AGEs刺激后，隨著AGEs濃度的增加，與hCG組比較，ERK1/2蛋白的磷酸化下調(diào)越明顯，與hCG組比較，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的AGEs與對(duì)照組相比以劑量依賴性方式下降了6.32%、28.8%、61.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖5 AGEs對(duì)p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

AGEs是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等大分子的游離氨基與還原性單糖的醛基反應(yīng)所生成的穩(wěn)定的共價(jià)化合物。正常機(jī)體內(nèi)的AGEs水平維持在一個(gè)較為平衡的狀態(tài)，但在糖尿病、衰老等情況下，AGEs的生成會(huì)異常的增加，將會(huì)打破機(jī)體原有的平衡，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列的病理和生理的變化。高糖環(huán)境下必然會(huì)引發(fā)體內(nèi)AGEs的異常會(huì)增加，報(bào)道的有關(guān)數(shù)據(jù)表明，AGEs水平的高低與糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的程度呈明顯正相關(guān)[11-12]，目前普遍認(rèn)為，在持續(xù)高血糖的環(huán)境下，機(jī)體組織內(nèi)的多種重要蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化終末反應(yīng)是引發(fā)糖尿病及其慢性并發(fā)癥的重要原因之一[13-14]。

睪丸的主要功能即是合成睪酮和生成精子，是男性生殖系統(tǒng)的重要器官，Leydig細(xì)胞是成年的雄性動(dòng)物分泌雄激素(睪酮)的主要來(lái)源，睪酮產(chǎn)生后，其中一部分進(jìn)入血液，作用于遠(yuǎn)方的靶組織，參與行為的調(diào)節(jié)和雄性第二性征的維持；另一部分作用于生精上皮，參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)。黎英榮等[15]的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠陰莖組織中積累了大量的AGEs，目前，AGEs對(duì)睪丸Leydig細(xì)胞功能的作用尚不清楚。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)由ERK1和ERK2構(gòu)成，分子量大小為42 kD和44 kD，統(tǒng)稱為ERK1/2，是將信號(hào)從細(xì)胞表面的受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵酶，只有ERK1/2磷酸化了才具有活性，磷酸化的ERK1/2通過對(duì)一些轉(zhuǎn)錄因子(如ATF，Jun，EIk-l)活性的調(diào)節(jié)，引發(fā)特定蛋白的表達(dá)及活性的改變，最終調(diào)控細(xì)胞的功能和代謝，影響細(xì)胞的形態(tài)維持、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞的增殖和分化等特定的生物學(xué)反應(yīng)[16-17]。眾所周知，EKR1/2參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活，它在介導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中的角色一直備受爭(zhēng)議，既可以引起細(xì)胞的增殖，又可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，具有雙重作用，據(jù)報(bào)道，激活的EKR1/2可以造成DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[18]。

目前為止，ERK1/2參與類固醇激素的合成已經(jīng)得到了確定[19-20]，但是其具體角色和詳細(xì)機(jī)制仍然是模糊不清的。ERK1/2和類固醇激素的合成都要受到cAMP-PKA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，而且ERK1/2在cAMP的作用下發(fā)生活化促進(jìn)類固醇激素的合成。

本試驗(yàn)原代培養(yǎng)大鼠Leydig細(xì)胞，探討AGEs對(duì)Leydig細(xì)胞睪酮的分泌的作用，MTT結(jié)果表明，不同濃度的AGEs(25～200 μg/mL)對(duì)Leydig細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，AGEs顯著抑制睪丸Leydig細(xì)胞睪酮的產(chǎn)生，且在25～200 μg/mL的范圍內(nèi)呈濃度依賴性，緊接著研究AGEs是通過什么途徑來(lái)抑制睪酮的合成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs以劑量依賴性方式抑制ERK1/2的磷酸化，從而說(shuō)明AGEs可通過抑制ERK1/2信號(hào)通路以影響Leydig細(xì)胞睪酮的分泌。在2001年，Dewi等[21]發(fā)現(xiàn)在人類的黃體細(xì)胞中hCG刺激cAMP濃度升高，以劑量和時(shí)間依賴方式使ERK1/2激活，促進(jìn)類固醇激素的生成。Martinelle等[20]發(fā)現(xiàn)，在hCG刺激下的Leydig細(xì)胞中，ERK1/2在調(diào)節(jié)睪酮合成的關(guān)鍵蛋白StAR中扮演著十分重要的角色，ERK1/2可以上調(diào)StAR蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)膽固醇進(jìn)入線粒體內(nèi)，使睪酮的合成增加。2010年時(shí)張穩(wěn)等[22]的研究中得出結(jié)論，ERK1/2是通過影響3β-HSD的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠睪丸Leydig細(xì)胞睪酮合成的調(diào)節(jié)作用。hCG是通過激活腺苷酸環(huán)化酶來(lái)促進(jìn)ATP分解為cAMP，cAMP再通過激活蛋白激酶A(PKA)使ERK1/2磷酸化，磷酸化的ERK1/2通過對(duì)睪酮合成關(guān)鍵因子的調(diào)節(jié)作用來(lái)介導(dǎo)睪酮的分泌。本研究證明hCG激活了ERK1/2的活化，AGEs抑制了ERK1/2的磷酸化，使睪酮的合成量降低，從而影響到男性生殖。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs部分通過抑制ERK介導(dǎo)的信號(hào)抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，這為探討糖尿病引發(fā)生殖系統(tǒng)功能紊亂提供了一定理論依據(jù)。AGEs引發(fā)Leydig分泌睪酮量下降的原因及其他相關(guān)機(jī)制是十分復(fù)雜的，還有待于繼續(xù)深入研究。

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Role of ERK1/2 signaling pathway mediated by advanced glycation end products in testosterone secretion of rat Leydig cells.

QI Ya-wei1,HU Chuan-yin2,CHEN Shao-hong3,ZHAO Yun-tao3,LIU You3.1.Institute of Plastic Surgery,Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA;2.Department of Cell Biology,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524023,Guangdong,CHINA;3.Modern Biochemistry Center, Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of advanced glycation end products(AGEs)on testosterone production of rat Leydig cells and its underlying mechanism.MethodsFirst,the primary Leydig cells were isolated,purified and cultured in vitro.The stromal cells were identified by 3β-HSD immunocytochemistry.Second,the effects of various concentrations of AGEs(25 μg/mL,50 μg/mL,100 μg/mL and 200 μg/mL)and BSA(200 μg/mL)on Leydig cell viability were evaluated by MTT.Finally,Leydig cells were pre-incubated with various concentrations of AGEs and 200 μg/mL BSA for 12 h.Then,the culture medium was replaced with fresh medium containing human chorionic gonadotropin (hCG,4 U/mL)with or without the same concentrations AGEs and BSA.The control group did not contain AGEs and BSA.The secretion of testosterone induced by human chorionic gonadotropin(hCG)was determined by ELISA.The protein expression levels of ERK1/2 phosphorylationwere were measured by western blot.ResultsMTT data indicated that the viability of the Leydig cells treated with AGEs(concentrations≤200 μg/mL)was not significantly altered.ELISA and western blot showed that AGEs could remarkably suppress testosterone production and decrease the phosphorylation levels of p-ERK1/2 induced by hCG in a concentration-dependent manner in rat Leydig cells compared with the control group (P＜0.01).ConclusionAGEs decrease testosterone secretion in rat Leydig cells by inhibiting ERK1/2 phosphorylation.

Advanced glycation end products(AGEs);Leydig cell;Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2);Testosterone

R-332

A

1003—6350（2017）01—0001—05

2016-07-11)

趙云濤。E-mail：yuntaozhao@163.com；劉鈾。E-mail：liuy6254282@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.001