姚丹丹，王婧怡，周倩，湯前，趙國琦，鄔彩霞

(揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009)

香豆素對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長化感作用的機理研究

姚丹丹，王婧怡，周倩，湯前，趙國琦，鄔彩霞*

(揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009)

為探明化感物質(zhì)香豆素的化感抑草作用機理,采用實驗室培養(yǎng)皿生物監(jiān)測法研究香豆素對多花黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生長過程中主要生長和生理生化指標的影響，觀察了種子和幼苗莖稈的超微組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明,與對照相比，香豆素顯著降低了多花黑麥草種子的發(fā)芽勢、根長、根干重、莖長和莖葉干重等生長指標(P<0.05)；香豆素處理顯著降低了吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性和葉綠素含量(P<0.05)，同時顯著提高了可溶性糖含量(P<0.05)，以及4和6 d種子的蛋白質(zhì)濃度(P<0.05)；且在前期促進了多花黑麥草幼苗的過氧化氫酶(CAT)活性、抑制了過氧化物酶(POD)活性，而后CAT降低,POD先升高后降低(P<0.05)，淀粉含量升高。100 μg/mL的香豆素水溶液只能在多花黑麥草種子發(fā)芽和幼苗生長初期可以很大限度的起到抑制作用，但不足以使其致死。香豆素抑制種子胚乳養(yǎng)分的分解與供應(yīng)，破壞胚乳細胞的細胞膜、細胞壁，同時可能使細胞失水而導致質(zhì)壁分離。

香豆素；多花黑麥草；化感；機理；透射電鏡

化感作用是指化感物質(zhì)包括植物根系的分泌物[1-2]以及地上莖葉淋溶、揮發(fā)釋放[3]的物質(zhì)和作物本身腐解產(chǎn)生的物質(zhì)，對自身或周圍其他植物的生長發(fā)育產(chǎn)生有利或不利影響[4-5]?；形镔|(zhì)對受體植物具有顯著的細胞毒性，影響受體植物根邊緣細胞的形成過程和活性，改變受體植物細胞壁和細胞膜的特性，破壞受體植物細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，干擾受體植物細胞有絲分裂過程和基因表達模式，化感脅迫誘導的氧化脅迫可能是引起受體植物細胞凋亡的原因之一[6]。近年來，植物化感作用及其化感物質(zhì)的研究已成為生態(tài)學的研究熱點之一[7]。

黃花草木樨(Melilotus)有很強的化感作用，其水浸提液對很多雜草的種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著抑制作用[8]，在雜草的生物控制方面有很好的應(yīng)用前景。研究表明，香豆素為黃花草木樨的主效化感物質(zhì)[9-10]，其水溶液能顯著抑制多花黑麥草(Loliummultiflorum)[8]、生菜(Lactucasativa)[11]、銅綠微囊藻(Aeruginosa)[12]和水稻(Oryzasativa)[13]等植物的種子萌發(fā)和幼苗生長，香豆素在40 μg/mL時能顯著抑制多花黑麥草的種子萌發(fā)和幼苗生長，香豆素濃度在 80 μg/mL時，對黑麥草的種子萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)為完全抑制。黃花草木樨水浸提液中香豆素的含量為46.78 μg/mL，對多花黑麥草具有很強的化感抑制作用[8]。最新的研究表明，香豆素非常有潛力被開發(fā)成為新型生物除草劑[10]。然而，到目前為止，黃花草木樨及其化感物質(zhì)對植物的化感抑制作用機理方面的研究仍停留在化感物質(zhì)在黃花草木樨中的含量以及可受抑制的受體植物種類等方面[7,9-10,14]，對抑制受體植物種子萌發(fā)的作用機理仍然不甚明確，且關(guān)于其對受體植物細胞形態(tài)及胞內(nèi)組織的影響也未有研究報道。因此，為闡明香豆素的化感抑制作用機理,本研究用香豆素的水溶液處理了多花黑麥草，對其種子萌發(fā)和幼苗生長過程中的重要生理生化指標進行了測定分析，并利用透射電鏡比較了香豆素處理后其細胞結(jié)構(gòu)的變化，為香豆素的生物除草開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以香豆素為施體藥品，固體香豆素購于SIGMA公司。多花黑麥草為受體植物。多花黑麥草種子購于百綠集團。

1.2 實驗時間

2015年2月1日將黑麥草種子播種于培養(yǎng)皿中，2月4日和7日測定萌發(fā)率、根長、苗長、根干物質(zhì)重和苗干物質(zhì)重，2月5日、7日和9日采樣并測定各種酶的活性以及植物組織的電鏡透射實驗。實驗周期為8天。

1.3 香豆素水溶液制備及多花黑麥草培養(yǎng)

香豆素水溶液的制備：配制100 mg/L的香豆素水溶液，稱取100 mg香豆素固體藥品，加水定容到1 L，充分溶解后得到100 mg/L的香豆素水溶液,于4 ℃冷藏備用。

多花黑麥草的培養(yǎng)：采用培養(yǎng)皿砂培法，在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入70 g洗凈并烘干的石英砂,每皿均勻播入經(jīng)1%次氯酸鈉消毒的多花黑麥草種子100粒，試驗組每個培養(yǎng)皿加15 mL 100 mg/L的香豆素水溶液，對照組加等量蒸餾水，培養(yǎng)皿使用封口膜將口封嚴，25 ℃光照培養(yǎng)(光照時間12 h/d,光照強度4000 lx, 智能光照培養(yǎng)箱ZGX-300C,杭州錢江儀器設(shè)備有限公司),試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計,3次重復。

透射電鏡樣品前處理：選取播種處理后第4、6和8天多花黑麥草的發(fā)芽種子及幼苗和未發(fā)芽的種子，切割長1 mm×1 mm×1 mm左右的樣品片段用于透射電鏡的觀察。切割后的樣品立即放入戊二醛固定液中(磷酸鹽緩沖液配方：加3 g多聚甲醛于50 mL蒸餾水中70 ℃水浴溶解，加50 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加4 g蔗糖和0.4 mL 25%戊二醛，整個操作在通風廚里操作)放在冰箱里4 ℃固定24 h以上。后倒掉戊二醛固定液，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗3次， 15 min/次，然后使用1%鋨酸固定4 h，再使用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗3次， 15 min/次，乙醇梯度脫水[50%、70%(過夜，以上過程均在4 ℃冰箱)，80%、90%、95%、100%，各15 min]，進行常規(guī)樹脂包埋,在超薄切片機上用鉆石刀切片,再經(jīng)醋酸鈾和枸椽酸鉛雙重染色,在Phillips Tecnai 12 TEM (荷蘭)透射電鏡下觀察,照相。

1.4 測定項目及方法

萌發(fā)率:播種3和6 d后計算所有發(fā)芽種子的百分率為萌發(fā)率。

苗長與根長:播種6 d后從每個培養(yǎng)皿中隨機取10株多花黑麥草測定其根長及苗長,取平均值。發(fā)芽數(shù)低于10株的只取發(fā)芽的幼苗測苗長和根長，并取該相應(yīng)幼苗的平均值。

莖葉干物質(zhì)重與根干物質(zhì)重:播種6 d后從每個培養(yǎng)皿中隨機取10株多花黑麥草,將幼苗的地上部分和地下部分分離,分別在105 ℃殺青3 h，然后烘干至恒重,稱重并計算苗干重(g/株)和根干重(g/株)。

植物全株過氧化氫酶(CAT)活性: 播種4，6和8 d后采樣,使用南京建成生物有限公司提供的試劑盒。

植物全株過氧化物酶(POD)活性: 播種4，6和8 d后采樣,使用南京建成生物有限公司提供的試劑盒。

植物全株吲哚乙酸氧化酶(IAAO)酶聯(lián)免疫分析: 播種4，6和8 d后采樣,使用南京建成生物有限公司提供的試劑盒。

植物全株可溶性糖(soluble sugar)含量:播種4，6和8 d后采樣,采用蒽酮比色法，使用南京建成生物有限公司提供的試劑盒。

植物全株淀粉(starch)含量:播種4，6和8 d后采樣,采用蒽酮比色法。

植物全株葉綠素含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量：播種4，6和8 d后采樣,采用分光光度法。

蛋白濃度：播種4，6和8 d后采樣，采用考馬斯亮藍法，使用南京建成生物有限公司提供的試劑盒。

1.5 統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)先用Excel進行初步處理后用 SPSS 軟件(SPSS Ver. 17.0 for Windows) 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析[15]，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤表示，P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素水溶液對多花黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生長過程中生長指標的影響

2.1.1 對多花黑麥草種子第3天萌發(fā)率和第6天萌發(fā)率的影響 如表1，香豆素水溶液處理的多花黑麥草處理后第3天和處理后第6天發(fā)芽率顯著低于對照組(P<0.05)，且處理后第3天處理組為零發(fā)芽率，從實驗結(jié)果看，香豆素水溶液有抑制多花黑麥草種子發(fā)芽的效果。

2.1.2 對多花黑麥草幼苗根長、根干重、莖長和莖葉干重的影響 如表1，香豆素水溶液處理的多花黑麥草處理后第6天根長、根干重、莖長和莖葉干重均顯著低于對照組(P<0.05)，從實驗結(jié)果看，香豆素水溶液有抑制多花黑麥草種子發(fā)芽和幼苗生長的效果。

表1 香豆素水溶液對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長過程中生長指標的影響Table 1 Coumarin solution influence of Italian ryegrass growth indexes on seed germination and growth of seedlings

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。

Note: Values with the different letter in a column are significantly different at the 0.05 probability level determined by LSD multiple range test (P<0.05).

2.2 香豆素水溶液處理對多花黑麥草幼苗生長的化感作用機理

2.2.1 對過氧化氫酶(CAT)活性的影響 如圖1(A)，處理后第4天香豆素處理的多花黑麥草CAT活性顯著高于對照(P<0.05)，處理后第6和8天的則顯著低于對照(P<0.05)。香豆素處理的多花黑麥草CAT活性在第6天最低，顯著低于第4天、第8天和第0天的(P<0.05)，第8天的又顯著低于第4天和第0天的(P<0.05)。除第0天外，對照的多花黑麥草CAT活性幾個測定時間點之間無明顯差異(P>0.05)。

圖1 香豆素水溶液對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長過程中過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、可溶性糖、淀粉含量和蛋白濃度的影響Fig.1 Coumarin solution influence of Italian ryegrass 6 physiological indexes on CAT, POD, IAAO, soluble sugar, starch, protein concentration CK，對照組；CS，香豆素水溶液。不同大寫字母表示同一時間不同處理之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。CK，control；CS，coumarin solution. Values with different upper case letter show significant differences between different treatments at P<0.05 level. Values with different lower case letters show significant differences between different times at P<0.05 level. CAT：Catalase：POD：Peroxidase；IAAO：Indole acetic acid oxidase.

2.2.2 對過氧化物酶(POD)活性的影響 如圖1(B)，除第0天外，香豆素處理的與對照相比差異顯著(P<0.05)，香豆素處理的和對照第4,6和8天POD活性顯著低于第0天(P<0.05)，對照第6天顯著低于第0,4和8天，而香豆素處理的第6天與第4天和第8天之間無顯著差異(P>0.05)。除第0天外，香豆素處理的與對照差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 對吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性的影響 如圖1(C)，除第0天外，香豆素處理的顯著低于對照(P<0.05)。香豆素處理的第8天顯著低于第0天(P<0.05)。

2.2.4 對可溶性糖(soluble sugar)含量的影響 如圖1(D)，除第0天外，香豆素處理的與對照相比差異顯著(P<0.05)，對照各時間點之間可溶性糖含量差異顯著(P<0.05)。除第0天外，香豆素處理的可溶性糖含量顯著高于對照(P<0.05)，處理后第6天可溶性糖含量顯著低于第4天和第8天(P<0.05)。

2.2.5 對淀粉(starch)含量的影響 如圖1(E)，除第0天外，香豆素處理的顯著高于對照(P<0.05)。對照第4天、第6天和第8天隨播種時間延長淀粉含量顯著降低(P<0.05)，香豆素處理的第8天反而升高。

2.2.6 對可溶性蛋白(protein concentration)含量的影響 如圖1(F)，處理后第4天、第6天和第8天香豆素處理的均高于對照，第8天兩組之間差異不顯著(P>0.05)。處理后第4天和第6天香豆素處理的顯著高于對照(P<0.05)。

2.2.7 對葉綠素含量的影響 如表2，香豆素處理的葉綠素含量均顯著低于對照(P<0.05)，香豆素處理的第4天和第6天顯著低于處理后第8天(P<0.05)。

1)對葉綠素a含量的影響:如表2，香豆素處理的葉綠素a含量均顯著低于對照(P<0.05)，尤以處理后第4天和第6天的抑制效果最明顯。且依生長天數(shù)增加葉綠素a含量依次升高。

2)對葉綠素b含量的影響:如表2，試驗組的葉綠素b含量顯著低于對照(P<0.05)，對照其他兩個時期均顯著高于處理后第4天(P<0.05)，表明多花黑麥草幼苗生長良好。處理后第4天和處理后第6天的CS顯著低于處理后第8天(P<0.05)，且以處理后第6天最低。

表2 香豆素水溶液和黃花草木樨水浸提液對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長中葉綠素含量的影響Table 2 Coumarin solution and yellow sweet clover water extract influence of Italian ryegrass chlorophyll content on seed germination and growth of seedlings

注：同一列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示同一時間不同處理之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。

Note: Values with different upper case letter show significant differences between different treatments atP<0.05 level, values with different lower case letters show significant differences between different times atP<0.05 level.

2.3 透射電鏡下的多花黑麥草種子(胚乳部分)和幼苗莖稈組織結(jié)構(gòu)

圖2為處理后第4天、第6天和第8天透射電鏡下多花黑麥草種子(胚乳部分)和幼苗莖稈的組織結(jié)構(gòu)。對照組多花黑麥草種子和幼苗組織結(jié)構(gòu)完整；種子細胞間距較大，內(nèi)有完整大液泡，且液泡外有明顯淀粉類似物堆積(圖2A、圖2B、圖2C、圖2F、圖2G、圖2H)；幼苗莖稈葉綠體結(jié)構(gòu)清晰可見，細胞形狀正常(圖2F、圖2G、圖2H)。香豆素水溶液處理組多花黑麥草種子細胞大液泡被分割成若干小液泡，小液泡外有明顯淀粉類似物堆積，小液泡內(nèi)也有少量明顯淀粉類似物堆積(圖2D)；處理后第6天的多花黑麥草幼苗莖稈葉綠體較多，細胞形狀異常，呈橢圓形，細胞膜與細胞壁部分分離，大液泡被堆積物分割成若干小液泡(圖2I)，但處理后第8天的幼苗莖稈結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差別(圖2J)。香豆素水溶液處理后第8天沒有發(fā)芽的多花黑麥草種子部分細胞與細胞間界限不明顯，無顯著細胞器(圖2E)。結(jié)果顯示，對照組生命力旺盛，香豆素水溶液處理組與對照組相比多項指標異常，且有細胞膜與細胞壁分離的現(xiàn)象，沒有發(fā)芽的多花黑麥草種子更是有細胞與細胞間界限不明顯的現(xiàn)象，但經(jīng)香豆素水溶液處理后第8天的幼苗莖稈組織細胞結(jié)構(gòu)與對照組幼苗莖稈組織細胞無明顯差別。由此證明，香豆素不僅可影響種子胚乳養(yǎng)分的分解與供應(yīng)，也可破壞胚乳細胞的細胞膜，并且還可破壞幼苗莖細胞的細胞壁或是因為細胞失水導致質(zhì)壁分離。但隨著處理時間的延長黑麥草會通過自身的機制抵抗抑制，逐漸恢復生命力。

3 討論

3.1 香豆素水溶液對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的生理生化指標影響

當種子遭受到不良因子的影響，細胞內(nèi)便會產(chǎn)生大量的影響種子內(nèi)部生理生化代謝的活性氧。為維持細胞的正常功能，種子細胞內(nèi)也存在著多種抗氧化物酶和非酶促反應(yīng)的抗氧化物質(zhì)來參與清除活性氧及有毒產(chǎn)物[16]。CAT和POD是細胞內(nèi)清除活性氧的主要保護酶， 細胞對脅迫的抗性主要取決于活性氧保護酶對活性氧

圖2 處理后第4天、第6天和第8天透射電鏡下的多花黑麥草種子(胚乳部分)和幼苗莖稈組織結(jié)構(gòu)Fig.2 4 days, 6 days and 8 days of the structure of ryegrass seed (endosperm part) and seedling stems observed under transmission electron microscope A：處理后第4天發(fā)芽的多花黑麥草種子(對照組)；B：處理后第6天發(fā)芽的多花黑麥草種子(對照組)；C：處理后第8天發(fā)芽的多花黑麥草種子(對照組)；D：處理后第6天發(fā)芽的多花黑麥草種子(香豆素水溶液處理組)；E：處理后第8天沒有發(fā)芽的多花黑麥草種子(香豆素水溶液處理組)；F：處理后第4天發(fā)芽的多花黑麥草幼苗莖稈(對照組)；G：處理后第6天發(fā)芽的多花黑麥草幼苗莖稈(對照組)；H：處理后第8天發(fā)芽的多花黑麥草幼苗莖稈(對照組)；I：處理后第6天發(fā)芽的多花黑麥草幼苗莖稈(香豆素水溶液處理組)；J：處理后第8天發(fā)芽的多花黑麥草幼苗莖稈(香豆素水溶液處理組)。CW、V、P、RD 分別代表細胞壁、液泡、葉綠素和核糖體。A:4 days of Italian ryegrass germinated seeds (control group); B:6 days of Italian ryegrass germinated seeds (control group); C: 8 days of Italian ryegrass germinated seeds (control group); D: 6 days of Italian ryegrass germinated seeds (coumarin solution group); E: 8 days of no germination ryegrass seeds (coumarin solution group); F: 4 days of Italian ryegrass germinated seedling stems (control group); G: 6 days of Italian ryegrass germinated seedling stems (control group); H: 8 days of Italian ryegrass germinated seedling stems (control group); I: 6 days of Italian ryegrass germinated seedling stems (coumarin solution group); J: 8 days of Italian ryegrass germinated seedling stems (coumarin solution group). CW, V, P, RD represent cell wall, vacuoles, plastid and ribosomal density, respectively.

的清除能力[17-18]。 整個保護酶系統(tǒng)的防御能力和保護酶之間彼此協(xié)調(diào)的綜合結(jié)果有關(guān),CAT和POD一起維持植物組織過氧化氫的平衡[19-20]。本實驗研究表明，經(jīng)過香豆素水溶液處理后, 處理后第6天的CS組CAT活性抑制效果最明顯，處理后第8天的試驗組POD活性顯著降低。表現(xiàn)為前期可促進多花黑麥草種子CAT活性、抑制POD活性以協(xié)調(diào)保護機制，而后CS組的CAT降低，POD先升高后降低以協(xié)調(diào)各種酶之間的活性。

目前關(guān)于吲哚乙酸氧化酶(IAAO)方面的研究都是IAAO影響植物體內(nèi)吲哚乙酸(IAA)含量使植物機體產(chǎn)生一系列的變化, 直接或間接地對植物生長產(chǎn)生調(diào)控作用[21]，在植物的芽、根等器官的形態(tài)建成、生化代謝中起調(diào)節(jié)作用[22]。受高壓靜電場處理的苜蓿(Medicago)愈傷組織和受機械振蕩處理的獼猴桃(Actinidiachinensis)愈傷組織,生長速率會明顯加快,同時其IAAO活性明顯比對照低[23-24]。張東東[25]研究表明,經(jīng)過西芹(Apiumgraveolens)鮮根和根際區(qū)物質(zhì)不同溶劑的浸提液處理后,顯著減緩了黃瓜(Cucumissativus)幼苗葉片的IAAO活性的升高,從而使黃瓜幼苗貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和能量供應(yīng)增加,細胞分裂加速, IAA水平升高,表現(xiàn)為黃瓜生長速度加快和生長勢增強,黃瓜的抗病性增強。本實驗研究表明，經(jīng)過香豆素水溶液處理后,顯著降低了多花黑麥草種子和幼苗的IAAO活性。

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多是參與各種代謝的酶類， 在受到干旱脅迫時會發(fā)生變化， 可以通過測定其含量變化了解植物抗逆性[26]。李妮亞等[27]認為，在多種逆境脅迫下，植物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成常會受到抑制，同時會有一些被誘導出的新蛋白出現(xiàn)或原有蛋白質(zhì)含量明顯增加。低溫脅迫會增加可溶性蛋白的含量[28-29]。本實驗研究表明，經(jīng)過香豆素水溶液處理后,在受到脅迫后第4天和第6天蛋白質(zhì)含量明顯升高，可能是植物體為了自我保護，脅迫誘導多種酶產(chǎn)生以抵制脅迫。

可溶性糖為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，滲透調(diào)節(jié)能力是植物適應(yīng)環(huán)境，提高抗逆性的基礎(chǔ)，植物體可通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化適應(yīng)脅迫環(huán)境[30]。有研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下植物生長受抑制，導致糖利用減少，可溶性糖含量增加[31]。同時，段瑞軍等[32]研究表示鎘脅迫下可溶性糖含量增加。本實驗研究表明，在受到脅迫后第4天、第6天和第8天香豆素處理的可溶性糖含量顯著高于對照，研究結(jié)果與前人一致。

植物種子萌發(fā)最初階段所需的物質(zhì)和能量需要從胚乳中儲藏養(yǎng)料的分解中獲取，其中主要儲存物質(zhì)為淀粉[33]。本研究中，與對照相比，香豆素處理的淀粉含量顯著高于對照，很明顯香豆素的脅迫阻止了淀粉的水解。

葉綠素是植物光合作用的主要色素,含量的高低對幼苗生長速度影響很大[34]。Patterson[35]和Hejl等[36]均發(fā)現(xiàn),化感物質(zhì)對植物光合作用的影響主要表現(xiàn)為葉綠素含量和光合速率的下降。本實驗研究表明，經(jīng)過香豆素水溶液處理后,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量都有顯著降低(P<0.05)，植物生長緩慢抑制了葉綠素的產(chǎn)生，葉綠素產(chǎn)生的抑制從很大程度上降低了光合作用，從而形成惡性循環(huán)，導致植物生長受到抑制。香豆素處理組第8天含量都有所升高的原因可能是香豆素對葉綠素的抑制存在時效性。

3.2 香豆素處理對多花黑麥草種子和幼苗細胞組織的影響

黑麥草屬單子葉植物，完整的有生命活性的種子是由種皮、胚和胚乳組成，胚乳的貯藏物質(zhì)主要是碳水化合物、蛋白質(zhì)、半纖維素、脂肪和油脂。碳水化合物的基本貯藏形式為淀粉。在黑麥草種子中，淀粉是胚乳的主要貯藏物質(zhì)。抑制種子萌發(fā)可通過抑制胚的分化或者抑制胚乳養(yǎng)分的分解和供應(yīng)來實現(xiàn)，后者共同抑制胚和胚乳。圖1D結(jié)果表明試驗組淀粉含量顯著高于對照組(P<0.05)，表示試驗組多花黑麥草種子內(nèi)有大量淀粉堆積。圖2通過觀察對比胚乳細胞的變化，判斷香豆素在抑制黑麥草種子發(fā)芽方面是否和胚乳養(yǎng)分供應(yīng)有關(guān)。張秋菊等[37]認為化感物質(zhì)對細胞膜的傷害可能是化感效應(yīng)的起始點，是化感作用的靶位點。本實驗也可得出該結(jié)論，且不僅是對細胞膜的直接傷害，甚至對細胞壁也有傷害，失水引起大液泡縮小，甚至被分割成若干小液泡，導致細胞膜的形態(tài)發(fā)生變化。劉蘇嬌等[7]認為豆科牧草的化感物質(zhì)可能主要通過抑制多花黑麥草種子胚乳養(yǎng)分的分解和供應(yīng)來抑制種子萌發(fā)及幼苗生長,豆科牧草的化感物質(zhì)對多花黑麥草幼苗細胞膜亦有一定的損傷作用。本實驗種子細胞內(nèi)淀粉的堆積即可證明香豆素的脅迫作用造成胚乳養(yǎng)分的分解和供應(yīng)受阻。Mahmood等[13]研究表明香豆素脅迫影響根系統(tǒng)形態(tài)和亞細胞結(jié)構(gòu)，細胞膜遭到破壞導致電解質(zhì)泄漏。Guo等[12]研究表明香豆素對銅綠微囊藻的生長產(chǎn)生‘低促高抑’作用,化感物質(zhì)通過破壞細胞膜、增加超氧陰離子自由基O2·-含量、降低葉綠素a含量等作用抑制藻細胞的生長。從圖2來看，本實驗的研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致。從實驗結(jié)果來看，香豆素不僅可影響種子胚乳養(yǎng)分的分解與供應(yīng)也可破壞胚乳細胞的細胞膜，并且還可破壞幼苗莖細胞的細胞壁或是因為細胞失水導致質(zhì)壁分離。

4 結(jié)論

100 μg/mL的香豆素水溶液在多花黑麥草種子發(fā)芽和幼苗生長初期可以很大限度的起到抑制作用，香豆素能顯著降低多花黑麥草種子的發(fā)芽勢、根長、根干重、莖長和莖葉干重等生長指標以及吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性和葉綠素含量，同時顯著提高了可溶性糖含量，以及4和6 d種子的蛋白質(zhì)濃度，同時，在前期提高了多花黑麥草幼苗的過氧化氫酶(CAT)活性、抑制了過氧化物酶(POD)活性，而后CAT降低,POD先升高后降低，淀粉含量升高。但不足以使其致死。香豆素不僅可以降低種子胚乳中淀粉的轉(zhuǎn)化利用效率,也可破壞胚乳細胞的細胞膜、細胞壁或是因為細胞失水導致質(zhì)壁分離，從而導致種子萌動受阻,幼苗生長滯緩甚至種子不發(fā)芽，但香豆素的抑制作用具有時效性，隨著處理時間的延長黑麥草會通過自身的機制抵抗抑制，逐漸恢復生命力。

References：

[1] Bais H P, Walker T S, Stermitz F R,etal. Enantiomeric-dependment phytotoxic and antimicrobial activity of (+/-)-catechin arhizosecreted racemic mixture from spotted knapweed. Plant Physiology, 2002, 128(4): 1173-1179.

[2] Callaway R M, Aschehoug E T. Invasive plants versus their new and old neighbors: a mechanism for exotic invasion. Science, 2000, 29(20): 521-523.

[3] Zhang F J, Xu X Y, Guo A Y,etal. The influence of volatiles of three invasive plants on the roots of upland rice seedings. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(19): 5832-5838.

[4] Chen G, Zhang D, Wang W L,etal. Advances in research on the allelopathic of plants. Journal of Fujian Forestry Science & Technology, 2015, (1): 246-250. 成鋼, 張丹, 王偉亮, 等. 植物間化感作用機理研究進展. 福建林業(yè)科技, 2015, (1): 246-250.

[5] Li Z, Jiang L G, Tang R H,etal. Identification and allelopathy of chemical compositions of peanut root exudates. Journal of South China Agricultural University, 2015, 36(5): 48-53. 李忠, 江立庚, 唐榮華, 等. 花生根系分泌物的鑒定和化感作用研究. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 36(5): 48-53.

[6] Danwei M A, Wang Y, Wang Y,etal. Advance in allelochemical stress induced damage to plant cells. Acta Ecologica Sinica, 2015, 35(5): 1640-1645.

[7] Liu S J, Zhao G Q, Wu C X,etal. Allelopathic effects of aqueous extracts of legumes on Italian ryegrass. Acta Agrestia Sinica, 2013, 21(6): 1182-1187. 劉蘇嬌, 趙國琦, 鄔彩霞, 等. 幾種豆科牧草水浸提液對多花黑麥草化感作用的機理研究. 草地學報, 2013, 21(6): 1182-1187.

[8] Wu C X, Zhao G Q, Liu S J,etal. The content and effects of coumarin in the aqueous extract of yellow sweet clover. Pratacultural Science, 2014, 31(12): 2262-2269. 鄔彩霞, 趙國琦, 劉蘇嬌, 等. 黃花草木樨水浸液中香豆素的含量及其對7種植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響. 草業(yè)科學, 2014, 31(12): 2262-2269.

[9] Wu C X, Zhao G Q, Liu S J. Isolation and identification of potential allelochemicals in water extract of yellow sweetclover (Melilotusofficinalis). Allelopathy Journal, 2015, 36(1): 75-86.

[10] Wu C X, Zhao G Q, Liu D L,etal. Discovery and weed inhibition effects of coumarin as the predominant allelochemical of yellow sweetclover (Melilotusofficinalis). International Journal of Agriculture & Biology, 2016, 18(1): 168-175.

[11] Razavi S M, Zarrini G, Zahri S,etal. Biological activity of Prangos uloptera DC, roots, a medicinal plant from Iran. Natural Product Research, 2010, 24(9): 797-803.

[12] Guo Y L, Fu H Y, Huang G H,etal. Allelopathy effects of ferulic acid and coumarin on microcystis aeruginosa. Environmental Science, 2013, 34(4): 1492-1497.

[13] Mahmood K, Han M B, Song Y Y,etal. Differential morphological, cytological and biochemical responses of two rice cultivars to coumarin. Allelopathy Journal, 2013, 31(2): 281-296.

[14] Wu C X. Comparative Study of Allelopathy of Legume Forages[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2007. 鄔彩霞. 幾種豆科牧草化感作用的比較研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2007.

[15] Hao L R. Pmetieal Statistiesin SPSS[M]. Beijing: China Water Conservancy and Hydropower Press, 2003: 77-108. 郝黎仁. SPSS實用統(tǒng)計分析[M]. 北京: 中國水利水電出版社, 2003: 77-108.

[16] Cheng X X, He S, Liu Z. Biological effect of rare earth elements in seed germination on sh_2 sweet corn. Journal of the Chinese Society of Rare Earths, 2016, (2): 229-234. 程昕昕, 何松, 劉正. 稀土元素對sh_2甜玉米種子萌發(fā)生物學效應(yīng)影響. 中國稀土學報, 2016, (2): 229-234.

[17] Fan S L, Yuan Z H, Feng L J,etal. Effects of drought stress on physiological and biochemical parameters ofDahliapinnata. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao, 2011, 22(3): 651-657. 范蘇魯, 苑兆和, 馮立娟, 等. 干旱脅迫對大麗花生理生化指標的影響. 應(yīng)用生態(tài)學報, 2011, 22(3): 651-657.

[18] Cai F, Mei L J, An X L,etal. Lipid peroxidation and antioxidant responses during seed germination ofJatrophacurcas. International Journal of Agriculture and Biology, 2011, 13: 25-30.

[19] Sun C H, Li Y, He H Y,etal. Physiological and biochemical responses ofChenopodiumalbumto drought stresses. Acta Ecologica Sinica, 2005, 25(10): 2556-2561. 孫存華, 李揚, 賀鴻雁, 等. 藜對干旱脅迫的生理生化反應(yīng). 生態(tài)學報, 2005, 25(10): 2556-2561.

[20] Fang C, Cheng Z. Research progress on the use of plant allelopathy in agriculture and the physiological and ecological mechanisms of allelopathy. Frontiers in Plant Science, 2015, 1: 6.

[21] Saleh A M, Madany M M Y, González L. The effect of coumarin application on early growth and some physiological parameters in faba bean (ViciafabaL.). Journal of Plant Growth Regulation, 2015, 34(2): 1-9.

[22] Srivastava O P, Huystee R B V. An interrelationship among peroxidase, IAA oxidase, and polyphenol oxi. Canadian Journal of Botany, 1977, 55(20): 2630-2635.

[23] Zhao J, Yang W, Ma F,etal. Effects of high voltage eletrostatic field (HVEF) on proliferation of callus from alfalfa leaf. Shengwu Wuli Xuebao, 1997, 13: 255-260.

[24] Yang X, Wang B, Duan C A,etal. Physiological effect of mechanical vibration on callus of actinidia chinensis planch. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2002, 8(1): 36-40.

[25] Zhang D D. The Study on the Allelopathy Mechanism of the Extract of Celery to the Fusarium Wilt of Cucumber——The Variation of the Enzyme Activities in Cucumber’s Leaves After the Treatment with the Extract of Fresh Root and Rhizosphere Area of Celery[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2013. 張東東. 西芹浸提液對黃瓜枯萎病菌化感作用機理的研究——西芹鮮根及根際物浸提液處理后黃瓜葉片內(nèi)酶活性的變化[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學, 2013.

[26] Shi Y W, Wang Y L, Li W B. Effects of water stress on soluble protein, soluble sugar and proline content inTamarixhispida. Journal of Xinjiang Agricultural University, 2007, 30(2): 5-8.

[27] Li N Y, Gao J F, Wang P H. The characteristics of induced protein in shoots of wheat seedlings under water stress. Acta Photophysiologica Sinica, 1998, 24(1): 65-71. 李妮亞, 高俊鳳, 汪沛洪. 小麥幼芽水分脅迫誘導蛋白的特征. 植物生理學報, 1998, 24(1): 65-71.

[28] Zhu Z, Jiang J Y, Jiang C J,etal. Effects of low temperature stress on SOD activity, soluble protein content and soluble sugar content inCamelliasinensisleaves. Journal of Anhui Agricultural University, 2011, 38(1): 24-26. 朱政, 蔣家月, 江昌俊, 等. 低溫脅迫對茶樹葉片SOD、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 38(1): 24-26.

[29] Chen F. Influence on cold resistance on the contents of the dissociative praline and the dissoluble albumen of aquilegia vulgaris. Northern Horticulture, 2011, (5): 29-31. 陳菲. 低溫脅迫對耬斗菜脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響. 北方園藝, 2011, (5): 29-31.

[30] Liu A R, Zhang Y B, Zhong Z H,etal. Effects of salt stress on the growth and osmotica accumulation ofColeusblumei. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(2): 211-218. 劉愛榮, 張遠兵, 鐘澤華, 等. 鹽脅迫對彩葉草生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的影響. 草業(yè)學報, 2013, 22(2): 211-218.

[31] Rochaix J D. Regulation of photosynthetic electron transport. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2011, 1807(3): 375-383.

[32] Duan R J, Wu C B, Wang L,etal. Contents of proline, soluble sugar, and chlorophyll and accumulations of nitrogen, phosphorus and potassium inPaspalumvaginatumSw. in response to Cd stress. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2016, 32(2): 357-361. 段瑞軍, 吳朝波, 王蕾, 等. 鎘脅迫對海雀稗脯氨酸、可溶性糖和葉綠素含量及氮、磷、鉀吸收的影響. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2016, 32(2): 357-361.

[33] Guo F, Fan W H. Effects of exogenous selenium on physiological effects of germination of mustard seeds under Cd stress. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2013, 28(4): 130-133. 郭鋒, 樊文華. 外源硒對鎘脅迫下芥菜種子萌發(fā)生理效應(yīng)的影響. 華北農(nóng)學報, 2013, 28(4): 130-133.

[34] Einhellig F A. Mechanism of Action of Allelochemicals in Allelopathy[M]. 2nd ed. Washington DC: American Chemical Society, 1995: 96-116.

[35] Patterson D T. Effects of ailelopathic chemicals on growth and physiological response of soybean (Glycinemax). Weed Science, 1981, 29(1): 53-59.

[36] Hejl A M, Einhelig F A, Rasmussen J A. Effects of juglone on growth, photosynthesis and respiration. Journal of Chemical Ecology, 1993, 19(3): 559-568.

[37] Zhang Q J, Zhang A H, Sun J B. Advances of research on allelopathic potencial of terpenoids in plants. Ecology and Environmental Sciences, 2012, 21(1): 187-193. 張秋菊, 張愛華, 孫晶波, 等. 植物體中萜類物質(zhì)化感作用的研究進展. 生態(tài)環(huán)境學報, 2012, 21(1): 187-193.

Effect of coumarin on Italian ryegrass seed germination and seedling growth

YAO Dan-Dan, WANG Jing-Yi, ZHOU Qian, TANG Qian, ZHAO Guo-Qi, WU Cai-Xia*

CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

To study the mechanism of allelopathy, the effects of coumarin on Italian ryegrass seed germination and seedling growth were evaluated in a sand-culture experiment. Compared with the control, coumarin treatment significantly (P<0.05) reduced the germination rate, root length, root dry weight, stem length, stem dry weight, and leaf dry weight of Italian ryegrass. The seedlings treated with coumarin showed significantly decreased indole acetic acid oxidase activity and lower chlorophyll content, compared with those in the control. The coumarin treatment also significantly (P<0.05) increased the water soluble carbohydrate content and protein concentration in seeds on days 4 and 6, increased catalase activity and starch content, and decreased peroxidase activity in Italian ryegrass seedlings during the early growth period. The results showed that an aqueous coumarin solution at a concentration of 100 μg/mL could control Italian ryegrass seed germination and seedling growth at the early stage, but it did not have a lethal effect. Coumarin inhibited endosperm function, disrupted the nutrient supply for seed germination, and destroyed cell membranes and cell walls in the endosperm, possibly leading to plasmolysis with water loss from cells.

coumarin; Italian ryegrass (Loliummultiflorum); allelopathic; mechanism; transmission electron microscope (TEM)

10.11686/cyxb2016303

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-08-17；改回日期：2016-11-04

國家自然科學基金(31101764)資助。

姚丹丹(1989-),女，山東德州人，在讀碩士。 E-mail: 964342551@qq.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: cxwu@yzu.edu.cn

姚丹丹, 王婧怡, 周倩, 湯前, 趙國琦, 鄔彩霞. 香豆素對多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長化感作用的機理研究. 草業(yè)學報, 2017, 26(2): 136-145.

YAO Dan-Dan, WANG Jing-Yi, ZHOU Qian, TANG Qian, ZHAO Guo-Qi, WU Cai-Xia. Effect of coumarin on Italian ryegrass seed germination and seedling growth. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 136-145.