鄭艷艷

(廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院，廣西 南寧 530021)

胞漿分裂阻滯微核試驗評價接觸職業(yè)危害的研究進(jìn)展

鄭艷艷

(廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院，廣西 南寧 530021)

微核試驗是國際上公認(rèn)的檢測遺傳損傷重要技術(shù)手段之一，而胞漿分裂阻滯微核試驗是近年發(fā)展起來的可觀察到多種遺傳學(xué)終點的試驗，它能分析染色體斷裂、DNA錯誤修復(fù)、基因擴(kuò)增、壞死、凋亡和細(xì)胞分裂抑制等，其在接觸職業(yè)危害評價中得到大量應(yīng)用。

胞漿分裂阻滯微核試驗，微核，職業(yè)危害；遺傳毒性

自從在人體網(wǎng)狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Howell-Jolly小體(即微核試驗中的微核)后，經(jīng)過多年的發(fā)展，微核試驗(micronucleus test，MNT)已成為檢測細(xì)胞遺傳毒性的標(biāo)準(zhǔn)試驗，MNT是公認(rèn)檢測染色體異常簡便的方法，是必做的遺傳毒理學(xué)安全性評價試驗，其原理是由于受到外界因素(物理、化學(xué)、生物)損害后導(dǎo)致染色體丟失或斷片形成出現(xiàn)微核。而胞漿分裂阻滯微核試驗(cytokinesis-block micronucleus cytome assay，CBMN)是將細(xì)胞松弛素B(cytochalasin-B，Cyt-B)加入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，使淋巴細(xì)胞胞質(zhì)分裂受到抑制，核分裂不受影響，從而計數(shù)雙核淋巴細(xì)胞中的微核，該方法排除了細(xì)胞分裂的影響，也可觀察到多種遺傳學(xué)終點，其結(jié)果比常規(guī)微核檢測方法更可信。近年，CBMN已發(fā)展成為可觀察多種損害終點的試驗，一張制好的片里可分析染色體斷裂、DNA錯誤修復(fù)、基因擴(kuò)增、壞死、凋亡和細(xì)胞分裂抑制等[1-3]。本文就CBMN試驗近年來在方法學(xué)上的研究和在接觸職業(yè)危害評價中的應(yīng)用進(jìn)展做如下綜述：

1 CBMN試驗方法

1.1 受試細(xì)胞的選擇 l999年人類微核計劃工作組認(rèn)為原代細(xì)胞及各類細(xì)胞株可用于微核試驗，但目前尚未查到有關(guān)資料認(rèn)為哪類細(xì)胞最適合用于微核試驗。通常情況下依據(jù)試驗?zāi)康?、遺傳背景、細(xì)胞的增殖時間、微核發(fā)生率等選擇細(xì)胞類型。在2002年國際遺傳毒性測試程序工作組推薦使用人體淋巴細(xì)胞和V79、CHL/IU、CHO和L5l78Y嚙齒類細(xì)胞株，一般情況作為職業(yè)暴露人群生物監(jiān)測首選是人體外周血淋巴細(xì)胞[4]。

1.2 植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)和細(xì)胞松弛素B的應(yīng)用 在人淋巴細(xì)胞1640培養(yǎng)液中都含有一定濃度的PHA，PHA是低聚糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，屬高分子糖蛋白，能促使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖。處在G0期大部分淋巴細(xì)胞，在PHA刺激下進(jìn)行有絲分裂，可通過雙核淋巴細(xì)胞和核分裂指數(shù)這兩項指標(biāo)得到試驗的最佳PHA濃度。CBMN試驗中細(xì)胞松弛素B破壞微絲的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并阻止胞質(zhì)分裂，在第一個有絲分裂周期加入Cyt-B，第二個有絲分裂期收獲細(xì)胞，就能獲得一次分裂的雙核細(xì)胞。在進(jìn)行CBMN試驗時，PHA刺激淋巴細(xì)胞后44 h是加入Cyt-B的最佳時間，而Cyt-B最為適宜濃度為2～4 μg/mL[5-6]。

1.3 細(xì)胞低滲處理 CBMN試驗是否成功關(guān)鍵是看制片的效果，一張好的細(xì)胞片背景清晰，并有足夠多細(xì)胞膜完整的雙核淋巴細(xì)胞，這與制片中低滲處理及固定技術(shù)密切相關(guān)。低滲液濃度是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，濃度過低容易導(dǎo)致低滲過度，細(xì)胞胞膜破裂不完整，濃度過高細(xì)胞不膨脹。鄔洪梁[7]采用0.15 mol/L KCL低滲處理紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞適度膨脹但不破裂。也有人提議進(jìn)行多觀察終點的生物監(jiān)測是不進(jìn)行低滲處理，這樣可直接保留細(xì)胞分裂中期凋亡和壞死細(xì)胞的形態(tài)，低滲處理可能破壞凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

1.4 讀片分析 CBMN試驗可計數(shù)微核、核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridges，NPBs)、核 芽 (nuclear buds，NBUDs)、壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和計算核分裂指數(shù)(nuclear division index，NDI)，NDI表示細(xì)胞增生水平，是細(xì)胞分裂抑制效應(yīng)指標(biāo)。之前CBMN檢測僅觀察雙核細(xì)胞中的微核，而忽略可能在體內(nèi)受到損害的凋亡或壞死細(xì)胞。Fenech等[8]提出一般要同時觀察單核淋巴細(xì)胞的微核、雙核淋巴細(xì)胞的微核、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等4個終點才能獲得全面準(zhǔn)確的信息。單核淋巴細(xì)胞中的微核提示細(xì)胞在采血前已受到損傷，雙核淋巴細(xì)胞的微核是原有的微核和體外培養(yǎng)在細(xì)胞分裂過程中染色體損傷所形成的微核，兩者同時計數(shù)可獲得較全面的信息。CBMN試驗現(xiàn)已發(fā)展成為一種可分析染色體斷裂或丟失、雙著絲粒染色體、基因擴(kuò)增、細(xì)胞凋亡、壞死及細(xì)胞分裂不平衡等多種損傷終點的綜合試驗方法，它提供了一個多終點觀察遺傳損傷的技術(shù)。

1.5 實驗中的質(zhì)量控制 陳洋等[9]探討如何在外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)微核試驗中做好質(zhì)量控制，通過采血、接種、培養(yǎng)、收獲等步驟，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實驗操作，不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗，做好室內(nèi)質(zhì)控制、人員的培訓(xùn)、儀器設(shè)備及試劑進(jìn)行規(guī)范化管理。一張片的細(xì)胞數(shù)量多，分散均勻，著色良好，核漿分明，透明度好，這些都可以極大的提高了微核的檢出率和閱片效率。實驗室內(nèi)質(zhì)量控制對提高微核檢出率和閱片速度起很好的作用，能保證質(zhì)量，及時準(zhǔn)確地反映細(xì)胞損傷情況，為生物劑量估算、放射損傷診斷與治療以及職業(yè)健康監(jiān)護(hù)提供依據(jù)。

2 CBMN試驗方法新的觀測指標(biāo)

2.1 核質(zhì)橋(NPBs)NPBs是指CBMN試驗雙核細(xì)胞中兩個細(xì)胞核之間相連的橋狀核，寬度小于核直徑的1/4，并且顏色與主核一致，有時在雙核之間可觀察到多個NPB。有研究提出核質(zhì)橋形成機(jī)制[10]，是DNA鏈斷裂后的錯誤修復(fù)和由于端?？s短或缺少端粒結(jié)合蛋白所導(dǎo)致的端粒末端融合，在有絲分裂后期中心粒被拉向細(xì)胞兩極而產(chǎn)生核質(zhì)橋。正常細(xì)胞隨著細(xì)胞分裂核質(zhì)橋會斷裂，因此在普通微核試驗中無法觀察到核質(zhì)橋，但在CBMN試驗中，因胞質(zhì)分裂被阻滯所以較易觀察到雙核細(xì)胞中的核質(zhì)橋。斷裂的核質(zhì)橋也有可能是微核形成的機(jī)制之一，NPBs的出現(xiàn)表明由于DNA鏈斷裂錯誤修復(fù)而導(dǎo)致的遺傳損傷。Thomas等[11]提出CBMN試驗應(yīng)該記錄雙核細(xì)胞中的核質(zhì)橋，來判定染色體的重組情況。

2.2 核芽(NBUDs)NBUDs是指CBMN試驗雙核細(xì)胞中與細(xì)胞核連接的一個芽突狀物質(zhì)，顏色與主核一致，是基因擴(kuò)增的生物標(biāo)志物。核芽是在DNA雙鏈斷裂后，錯誤修復(fù)或細(xì)胞清除擴(kuò)增的DNA形成的。Haaf等[12]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞照射γ射線3 h后DNA修復(fù)相關(guān)基因Rad51重組蛋白復(fù)合體會聚集在某個特定位置，并通過核芽的方式形成微核而被清除，此研究表明核芽的產(chǎn)生與DNA損傷修復(fù)有極大關(guān)聯(lián)。核芽也被認(rèn)為是微核形成的機(jī)制之一，但還需要做進(jìn)一步研究。

2.3 核分裂指數(shù)(NDI)CBMN試驗中需要觀察500個細(xì)胞來計算核分裂指數(shù)，在顯微鏡下觀察并計數(shù)單核、雙核、三核、四核細(xì)胞，計算參考公式：NDI=(單核數(shù)+2×雙核數(shù)+3×三核數(shù)+4×四核數(shù))/細(xì)胞總數(shù)。NDI是評價細(xì)胞增殖情況，核分裂指數(shù)越高，細(xì)胞增殖越良好。

2.4 細(xì)胞凋亡和壞死 凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞已經(jīng)納入CBMN試驗的檢測新指標(biāo)。早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)有濃縮染色質(zhì)、完整胞質(zhì)和核膜；而晚期凋亡細(xì)胞有完整胞質(zhì)和胞質(zhì)膜、但核碎片已成為核小體；凋亡細(xì)胞核染色比活細(xì)胞深。早期壞死細(xì)胞細(xì)胞胞質(zhì)染色淡、胞質(zhì)或核含多個空泡、胞質(zhì)膜受損但核清晰完整；晚期壞死細(xì)胞胞質(zhì)缺失、核膜受損或不完整、只有部分完整的核結(jié)構(gòu)、可見核質(zhì)外泄；壞死細(xì)胞的核染色一般比活細(xì)胞淺。凋亡和壞死細(xì)胞的比例可反映外界理化因素對細(xì)胞的毒性。

在毒性評價上NDI和壞死、凋亡細(xì)胞這些指標(biāo)能為細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞毒性提供重要信息。新發(fā)展的觀察指標(biāo)體現(xiàn)了CBMN試驗中細(xì)胞組學(xué)方法的重要性，僅在一個實驗中就能檢測到遺傳毒性、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞生長抑制等現(xiàn)象。CBMN試驗的發(fā)展擴(kuò)大它的評價內(nèi)容和應(yīng)用范圍，例如在營養(yǎng)毒理學(xué)、腫瘤研究、職業(yè)暴露人群生物監(jiān)測等領(lǐng)域均得到較多的應(yīng)用。

3 CBMN試驗在接觸職業(yè)危害評價中的應(yīng)用

3.1 職業(yè)暴露人群的生物監(jiān)測 CBMN試驗廣泛應(yīng)用于職業(yè)暴露人群的監(jiān)測，微核率是評價職業(yè)人群暴露于遺傳毒物的早期生物效應(yīng)敏感指標(biāo)。Veronika等[13]發(fā)現(xiàn)，暴露于五氧化二釩工人的微核率與陰性對照組比增加2.5倍、核質(zhì)橋是陰性對照組的7倍、核芽是陰性對照組的3倍，細(xì)胞壞死也顯著增高。金力奮等[14]檢測24名接觸腫瘤藥物的護(hù)士外周血淋巴細(xì)胞的遺傳損傷時用CBMN試驗和彗星試驗，發(fā)現(xiàn)其微核細(xì)胞率和彗星尾長均明顯高于同一醫(yī)院非接觸抗腫瘤藥物的24名女醫(yī)生。陸垚等[15]研究鉛暴露工人外周學(xué)淋巴細(xì)胞遺傳損傷，研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)分裂阻滯微核試驗暴露組工人雙核微核率和微核細(xì)胞數(shù)均高于陰性對照組，且雙核微核率、微核細(xì)胞率、核橋率與工齡呈正相關(guān)。

3.2 放射性物質(zhì)接觸評價 有研究證明，淋巴細(xì)胞微核率及染色體畸變率與放射性物質(zhì)累積劑量及放射工齡呈線性相關(guān)。目前，有關(guān)放射性物質(zhì)微核試驗的報道文獻(xiàn)也比較多，微核分析可以作為輻射損傷的遺傳學(xué)效應(yīng)的初篩指標(biāo)。Sari-Minodier等[16]用CBMN試驗評價長期暴露于低劑量輻射的醫(yī)務(wù)人員的染色體損傷情況，結(jié)果顯示，暴露組染色體損傷所致的微核發(fā)生率明顯高于陰性對照組。祝俊等[17]采集醫(yī)用X射線工作人員微量全血，用胞漿分裂阻滯微核法檢測其長期受小劑量輻射的遺傳學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其微核率顯著高于陰性對照組的14.6‰，并且微核率隨放射工齡的增加而增高，呈現(xiàn)累積劑量-反應(yīng)關(guān)系，反映受照者的遺傳損傷程度。

3.3 有害重金屬接觸評價 對有害重金屬接觸作業(yè)人群的遺傳毒性效應(yīng)監(jiān)測，CBMN試驗快速而準(zhǔn)確。易娟等[18]對29名鎘作業(yè)者、35名健康人的靜脈血進(jìn)行微核試驗，比較淋巴細(xì)胞胞漿分裂阻斷微核法與普通微核法的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CBMN法的微核率明顯高于普通微核法(P＜0.01)，說明了CBMN試驗在接觸有害重金屬作業(yè)人群中的實用性。張杰等[19]采用CBMN試驗觀察不同劑量氟、砷單獨及聯(lián)合作用對正常人淋巴細(xì)胞染色體的損傷情況，研究表明不同劑量亞砷酸鈉與氟化鈉均可引起淋巴細(xì)胞染色體損傷；兩者聯(lián)合染毒只是簡單相加作用。

3.4 有機(jī)物接觸評價 Noel等[20]采用人外周血淋巴細(xì)胞CBMN試驗對5,7,4'-三羥黃酮進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，5,7,4'-三羥黃酮可能存在潛在的遺傳毒性，微核率隨劑量的增高而增高，證明了高劑量的黃酮類化合物為斷裂劑。在研究l,2,4-苯對人淋巴細(xì)胞的遺傳毒性時，Chung等[21]用CBMN試驗結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)苯致淋巴細(xì)胞微核率升高，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。廖靜等[22]應(yīng)用胞漿分裂阻滯微核法檢測三鹵甲烷和鹵乙腈的遺傳毒性，及其消毒副產(chǎn)物對人來源的肝腫瘤細(xì)胞HepG2微核率和核分裂指數(shù)(NDI)的影響，結(jié)果三鹵甲烷和鹵乙腈對HepG2細(xì)胞染色體具有斷裂作用。趙五紅等[23]采用人外周血淋巴細(xì)胞胞質(zhì)分裂阻滯微核試驗探討了大氣中常見的5種多環(huán)芳烴的致突變性，分別檢測不同濃度5種多環(huán)芳烴對人淋巴細(xì)胞的微核誘導(dǎo)作用，結(jié)果表明不同濃度5種多環(huán)芳烴微核率與陰性對照組比較有顯著性差異，并且存在明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，說明多環(huán)芳烴具有一定的潛在危害。

4 展望

微核試驗已從早期的普通微核試驗發(fā)展為精確的胞質(zhì)分裂阻滯微核試驗，現(xiàn)作為檢測遺傳損傷的重要手段，能更全面準(zhǔn)確反映多種細(xì)胞損傷，是一種多觀察終點的生物檢測方法。CBMN試驗計算微核率時僅計數(shù)雙核淋巴細(xì)胞的微核，比傳統(tǒng)的微核試驗更精確、便于識別。CBMN試驗克服了常規(guī)微核法不夠精確的缺點，且比經(jīng)典的染色體畸變分析簡便。隨著社會的逐漸重視，CBMN試驗為化學(xué)致癌因素的危險度評價以及預(yù)測腫瘤的發(fā)展和預(yù)后提供細(xì)胞組學(xué)生物學(xué)標(biāo)志，可以廣泛應(yīng)用于職業(yè)暴露人群的健康監(jiān)護(hù)領(lǐng)域，其具有推廣價值。

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R394

A

1003—6350（2017）19—3195—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.033

廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題（編號：Z2014239）

鄭艷艷。E-mail：zhengyy-001@163.com

2016-10-26)