羅耀玲， 黃鈾新， 賴 平， 張敏鴻

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 3贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

低表達(dá)miR-21對(duì)苦參堿誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響*

羅耀玲1， 黃鈾新2， 賴 平3， 張敏鴻1

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,3贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

目的： 探討miR-21低表達(dá)能否增強(qiáng)苦參堿(matrine，MAT)對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用。方法: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)不同濃度MAT作用HepG2細(xì)胞后miR-21的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-21低表達(dá)對(duì)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響；RT-qPCR和Western blot檢測(cè)miR-21低表達(dá)對(duì)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果: miR-21表達(dá)量隨MAT作用濃度的增加而增加；miR-21低表達(dá)可促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)Bax mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論: miR-21低表達(dá)可通過(guò)抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。

miR-21； 苦參堿； HepG2細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是危害我國(guó)居民健康的主要惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例超過(guò) 40 萬(wàn)，且發(fā)病仍呈上升趨勢(shì)[1]，目前仍未有滿意的治療方法。近年來(lái)，從中藥中提取的抗癌藥物因其抗腫瘤作用確切，副作用小而受到國(guó)內(nèi)外研究的關(guān)注?？鄥A(matrine，MAT)是傳統(tǒng)中藥苦參的有效成分，具有多方面的腫瘤抗性機(jī)制，主要包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等[2-3]。

肝癌的微小RNA(microRNA，miRNA，miR)調(diào)控機(jī)制表明，miRNA既可直接參與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，也可通過(guò)調(diào)節(jié)癌基因和(或)抑癌基因來(lái)參與HCC的發(fā)生[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA 亦參與到中藥抗腫瘤作用過(guò)程中[5-6]，但其作用方式和機(jī)制還不是很清楚。本課題組在研究苦參堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，苦參堿可致miR-21表達(dá)上調(diào)。由此推測(cè)，miR-21可能參與了苦參堿誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。本研究將驗(yàn)證這一推測(cè)并初步探討miR-21參與調(diào)控苦參堿誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑

苦參堿(索萊寶);化學(xué)合成修飾的miR-21抑制物(inhibitor, In)片段(In-miR-21)及其陰性對(duì)照(negative control, NC)片段由上海吉瑪合成；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；細(xì)胞周期凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)；TRIzol試劑(北京雷根)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪)；抗β-actin、Bcl-2、Bax和IgG抗體(中杉金橋)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞系HepG2(本室保存)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(四季青)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)中，所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，存活率大于95%。細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種，待密度達(dá)50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，采用Lipofectamine 2000將In-miR-21及NC轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中，4 h換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-21在不同濃度苦參堿作用的HepG2細(xì)胞中的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化后按每孔2×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，第2天棄培養(yǎng)液，分別加入含新鮮配制的終濃度為0、0.25、0.5、0.75和1 g/L苦參堿的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol提取總RNA，為了提到小RNA,加入異丙醇后-70 ℃放置過(guò)夜；以miR-21和U6的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。逆轉(zhuǎn)錄引物以及miR-21的PCR引物均由上海吉瑪合成。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min; 95 ℃ 12 s, 62 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣本均做3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照組。以U6為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量法，以2-ΔΔCt法來(lái)進(jìn)行分析。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，第2天轉(zhuǎn)染，分未轉(zhuǎn)染(non-transfection, NT)組、陰性片段轉(zhuǎn)染組(NC組)及miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染組(In-miR-21組)；于轉(zhuǎn)染5 h后棄培養(yǎng)液，并加入含新鮮配制的終濃度為0.75 g/L苦參堿(增殖抑制率為40%)的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各孔細(xì)胞(死細(xì)胞與活細(xì)胞都收集)，PBS洗2遍，然后用1×Annexin結(jié)合液調(diào)整濃度至1×109/L，從中取100 μL加5 μL Annexin V和5 μL PI(100 mg/L)，室溫避光作用15 min，加入400 μL 1×Annexin結(jié)合液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)不同處理組中Bcl-2和Bax的 mRNA表達(dá) 采用TRIzol提取不同處理組細(xì)胞中的總RNA。Bcl-2的上游引物為5’-GGAGAGGGTCACAAATCCTAAA-3’，下游引物為5’-TGCCACAGA GTTATTCCATCAA-3’；Bax的上游引物為5’-ATGGGCTGG ACATTGGACT-3’，下游引物為5’-GGGCAGAAGGCACTAATCAAG-3’；β-actin的上游引物為5’-TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3’，下游引物為5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’。PCR條件和數(shù)據(jù)分析同2.2。

2.5 Western blot檢測(cè)不同處理組中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平 用蛋白裂解液冰上裂解各組細(xì)胞30 min，然后12 000 r/min離心5 min，上清即為總蛋白。用BCA定量試劑盒定量后進(jìn)行SDS-PAGE(各組總蛋白上樣量均為30 μg)分離蛋白并電轉(zhuǎn)PVDF膜，通過(guò)封閉液封閉、Ⅰ 抗孵育、洗滌膜、Ⅱ 抗孵育、洗滌膜的過(guò)程，最后ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像儀上拍照，并做灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-21在In-miR-21轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)比較

RT-qPCR結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染了miR-21抑制劑的組中miR-21的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The relative expression levels of miR-21 in the HepG2 cells transfected with In-miR-21. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNT or NC.

圖1 miR-21在非轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和In-miR-21轉(zhuǎn)染組中的相對(duì)表達(dá)量

2 miR-21在不同濃度苦參堿作用的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)比較

RT-qPCR結(jié)果表明，苦參堿作用HepG2細(xì)胞24 h后，隨著苦參堿濃度的增加，miR-21的表達(dá)亦不斷增加，當(dāng)苦參堿濃度達(dá)到0.75 g/L以上時(shí)，與未加藥組相比，miR-21的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-21 in the HepG2 cells treated with different concentrations of matrine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 g/L group.

圖2 miR-21在不同濃度苦參堿作用中的相對(duì)表達(dá)量

3 In-miR-21促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

miR-21是癌基因，可抑制細(xì)胞凋亡。為了了解低表達(dá)miR-21能否促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，我們采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)In-miR-21對(duì)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。定量分析凋亡百分比結(jié)果顯示MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯增高(P<0.01)，與MAT處理的NC組相比無(wú)差異;In-miR-21與MAT共同處理后，細(xì)胞凋亡百分比明顯升高(P<0.05)，見圖3。這說(shuō)明低表達(dá)miR-21可協(xié)同MAT促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 In-miR-21對(duì)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響

為了探討miR-21低表達(dá)后促進(jìn)苦參堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機(jī)制，利用RT-qPCR檢查Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示NT+MAT組、NC+MAT組和In-miR-21+MAT組與NT組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，而Bax的mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)；In-miR-21+MAT組與NC+MAT組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而Bax的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01), 見圖4。

5 In-miR-21對(duì)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax蛋白的影響

灰度值統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明各處理組與NT組相比，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)；In-miR-21+MAT組與NC+MAT組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，見圖5。

Figure 3.In-miR-21 promoted MAT-induced HepG2 cell apoptosis. Mean±SD.n=3.◆P<0.05vsNT;*P<0.05vsNC+MAT.

圖3 In-miR-21促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡

Figure 4.The effect of In-miR-21 on the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNT;##P<0.01vsNC+MAT.

圖4 In-miR-21對(duì)MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞 Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of In-miR-21 on the protein expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNT;##P<0.01vsNC+MAT.

圖5 In-miR-21對(duì)MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

討 論

肝癌的治療目前仍然是以手術(shù)、放療和化療為主，總的5年生存率不高，且預(yù)后差。為此，人們不斷尋找各種新的治療方法，如干細(xì)胞療法[7]、生物免疫療法[8]、基因(包括miRNA)干預(yù)[9-10]、中藥療法等。近年來(lái)研究表明中藥可通過(guò)多種機(jī)制來(lái)影響腫瘤的生長(zhǎng)、代謝過(guò)程，還可以對(duì)機(jī)體免疫力、內(nèi)分泌等進(jìn)行調(diào)控；起到了抑制腫瘤生長(zhǎng)，減輕化療藥物的毒副作用，提高機(jī)體的免疫力的作用，從而提高腫瘤患者的生存周期和質(zhì)量[11-13]。本課題組研究的苦參堿對(duì)肝癌亦具有較好的抗瘤效果，0.75 g/L苦參堿對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為40%(MTT實(shí)驗(yàn)得出,本文未列出該結(jié)果)。

miRNA是一種長(zhǎng)度為 18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶基因的 3’端不完全或完全配對(duì)，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。miR-21是第1個(gè)在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的 miRNA，位于17q23.2；是唯一在所有惡性腫瘤中高表達(dá)的 miRNA，被公認(rèn)為一個(gè)致癌性小RNA[14]。眾多研究表明miR-21的表達(dá)增加會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)細(xì)胞增殖[15-16]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA 亦參與到中藥抗腫瘤作用過(guò)程中，如Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)在人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-21可通過(guò)下調(diào)PTEN抑制姜黃素的抗癌活性。PTEN是抑癌基因，已證實(shí)是miR-21的下游靶基因；當(dāng)miR-21表達(dá)升高可降低PTEN的表達(dá)，使得PTEN/AKT信號(hào)通路持續(xù)活化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21在苦參堿抗凋亡過(guò)程中隨苦參堿作用濃度的增加而表達(dá)增加。由此課題組猜想，降低miR-21的表達(dá)，能否增加苦參堿的抗凋亡作用呢？Annexin V/ PI流式結(jié)果表明，當(dāng)降低HepG2細(xì)胞中miR-21的量時(shí)，與對(duì)照組相比，苦參堿抗凋亡的作用增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡過(guò)程。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控，尤其是對(duì)促凋亡基因和抑凋亡基因的調(diào)控。Bax是最常見的促凋亡基因，Bcl-2是最常見的抑凋亡基因，Bcl-2/Bax比率是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[17]。亦有研究表明Bcl-2是miR-21的一個(gè)靶基因[18]，因此本實(shí)驗(yàn)選用它們作為細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究。RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-21低表達(dá)后，可促進(jìn)苦參堿作用組中Bax mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)?？梢娂?xì)胞中miR-21表達(dá)降低，可增加苦參堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡作用。

目前，miRNA在中藥抗腫瘤中的作用研究較少，miRNA在其中的調(diào)控機(jī)制亦不是很清楚。本課題的初步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21參與了苦參堿抗腫瘤凋亡過(guò)程，過(guò)表達(dá)miR-21可抑制凋亡，而降低miR-21的表達(dá)則可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，將為中藥的miRNA調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)也為中藥與miRNA聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of low expression of miR-21 on apoptosis of HepG2 cells induced by matrine

LUO Yao-ling1, HUANG You-xin2, LAI Ping3, ZHANG Min-hong1

(1ResearchCenterofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,2DepartmentofNuclearMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,3GannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China.E-mail: 15970794928@163.com)

AIM: To explore whether miR-21 low expression enhances the effect of matrine (MAT) on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.METHODS: Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of miR-21 in the HepG2 cells treated with different concentrations of MAT. The effect of miR-21 on MAT-induced HepG2 cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells treated with MAT was determined by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: The expression of miR-21 increased with the increasing concentration of MAT. Low expression of miR-21 promoted MAT-induced apoptosis, and enhanced the expression of Bax at mRNA and protein levels (P<0.05), while inhibited the expression of Bcl-2 at mRNA and protein levels (P<0.05). CONCLUSION: Low expression of miR-21 enhances MAT-induced HepG2 cell apoptosis by inhibiting the expression of Bcl-2 and promoting Bax expression.

miR-21; Matrine; HepG2 cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)02- 0284- 05

2016- 09- 12

2016- 11- 05

贛南醫(yī)學(xué)院校級(jí)課題 (No. YB201402)

R730.20； R730.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.015

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△通訊作者 Tel： 0797-8283981； E-mail: 15970794928@163.com