錢建升， 李 宇， 竇建衛(wèi)

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科， 陜西 西安 710061； 2陜西省人民醫(yī)院放療科，陜西 西安 710068； 3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院, 陜西 西安 710061)

·短篇論著·

miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖與遷移*

錢建升1△， 李 宇2， 竇建衛(wèi)3

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科， 陜西 西安 710061；2陜西省人民醫(yī)院放療科，陜西 西安 710068；3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院, 陜西 西安 710061)

目的： 觀察高表達(dá)的miR-15a-5p對人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法: 化學(xué)合成加入EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位點的miR-15a-5p寡聚核苷酸，并進(jìn)行測序確認(rèn)；利用pcDNA6.2-GW/Em-GFP質(zhì)粒構(gòu)建miR-15a-5p真核表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，實時熒光定量PCR檢測miR-15a-5p的表達(dá)；CCK-8法和臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計數(shù)檢測SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果: 設(shè)計的miR-15a-5p序列與寡核苷酸測序結(jié)果匹配達(dá)100%；真核表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后人肝癌SMMC-7721細(xì)胞miR-15a-5p的表達(dá)量與對照組相比顯著增加(P<0.05)；miR-15a-5p高表達(dá)SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力與對照組相比均顯著下降(P<0.05)；miR-15a-5p高表達(dá)組細(xì)胞遷移速度低于對照組。結(jié)論: 高表達(dá)的miR-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖和遷移能力。

miR-15a-5p； 肝細(xì)胞癌； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移

肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率處于惡性腫瘤中的第6位，死亡率位于第3位[1]，由于惡性程度高、發(fā)病隱匿、病情進(jìn)展快、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特性，絕大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)進(jìn)入晚期，導(dǎo)致了包括手術(shù)、化療等治療手段的無力。在我國，肝癌的發(fā)病率位于惡性腫瘤的第4位，死亡率高居第2，僅次于肺癌。因此肝癌的防治是中國乃至全世界研究人員所面臨的重任。

微小RNA(microRNA, miR)-15a-5p是miR-15家族的一個成員，由位于染色體 13q14 區(qū)域內(nèi)的基因編碼。既往研究認(rèn)為miR-15a主要起到抑制腫瘤發(fā)生的作用，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，可能成為抗腫瘤治療的新靶標(biāo)[2]。但目前miR-15a-5p與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不清楚。本研究通過觀察miR-15a-5p對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖和遷移的影響，以期為尋找抑制肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子靶點提供新的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

SMMC-7721細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞所；菌株選用本室保存的TOP10 菌株；氨芐青霉素(新泰生物公司)；DNA無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)；膠回收試劑盒(Tiangen)；pcDNA6.2-GW/Em-GFP質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000和RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen)；T4 DNA連接酶及EcoR Ⅰ、HindⅢ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)；PCR引物(上海生工)。

2 方法

2.1 化學(xué)合成miR-15a-5p寡聚核苷酸 在miRbase(http://mirbase.org/)網(wǎng)站查詢miR-15a-5p的前體序列，并分別在兩端添加EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點，委托上海生工生物工程股份有限公司合成以上單鏈核酸，將各單鏈核酸稀釋至100 μmol/L， 65 ℃ 5 min形成DNA雙鏈，-20 ℃保存待用于載體構(gòu)建。

2.2 載體構(gòu)建 用EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切pcDNA6.2-GW/Em-GFP-pre-miR-15a-5p 質(zhì)粒，然后用1%瓊脂糖凝膠分離雙酶切目的產(chǎn)物，用膠回收試劑盒按說明書操作回收大片段DNA。用T4 DNA連接酶連接目標(biāo)片段和酶切載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，克隆后選擇陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序。構(gòu)建載體所用引物序列見表1。

表1 載體構(gòu)建所用引物序列

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM中。放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。按每孔2×105個細(xì)胞鋪6孔板，24 h后進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染miR-15a-5p的細(xì)胞命名為實驗組(experiment組)，轉(zhuǎn)染無義序列的載體命名為空載體組(scramble組)，無質(zhì)粒僅使用轉(zhuǎn)染試劑處理組命名為對照組(mock組)，無任何處理組命名為空白組(blank組)。轉(zhuǎn)染4 h后換液，進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.4 Real-time PCR檢測miR-15a-5p在細(xì)胞中的表達(dá) TRIzol提取SMMC-7721細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒對所提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR實驗，實驗步驟參照試劑盒說明書，PCR引物序列見表2。根據(jù)總miRNA測定濃度，計算并調(diào)整各組總miRNA用量，按試劑盒操作規(guī)范加入miRNA特異反轉(zhuǎn)錄引物，于42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min、冰浴5 min，將miRNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。cDNA可于-20 ℃保存2周。按SYBR Green/ROX qPCR Master Mix說明書步驟將第一鏈cDNA(按總RNA 100 ng～200 ng換算)、miRNA特異的上游引物、miRNA共同下游引物與預(yù)混的PCR試劑按25 μL體系混合，然后于PCR儀中進(jìn)行“95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s， 40個循環(huán)”的PCR擴增。采用2-ΔΔCt法分析real-time PCR的實驗數(shù)據(jù)。

表2 miR-15a-5p的引物序列

2.5 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力 調(diào)整細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔種約3 000個細(xì)胞，設(shè)對照組和實驗組，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后從培養(yǎng)箱取出，每孔100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后取出，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔吸光度(A)值，反映細(xì)胞活力。細(xì)胞活力 (%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。A(加藥)：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；A(0加藥)：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

2.6 臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計數(shù)實驗 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞利用0.25%胰酶消化成單個細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×107/L，于96孔板鋪板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁后分別向不同分組的孔中轉(zhuǎn)染對應(yīng)質(zhì)?；蛞种谱?，轉(zhuǎn)染4 h后換液，隨后將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染完成后24 h、48 h和72 h 3個時點，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)染色，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。

2.7 細(xì)胞劃痕遷移實驗 在向培養(yǎng)板接種細(xì)胞之前，先用標(biāo)記筆于6孔板背面輕點在兩端做標(biāo)記。將培養(yǎng)好的細(xì)胞消化后接入6孔板培養(yǎng)，數(shù)量以貼壁后鋪滿板底為宜(數(shù)量少時可培養(yǎng)一段時間至鋪滿板底)。待細(xì)胞長滿板底后，用10 μL槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕(可用培養(yǎng)板上蓋做尺子，使得劃痕筆直)，盡量保證每孔劃痕寬度一致。棄去劃畢孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗孔板3次，洗去細(xì)胞碎片。向PBS沖洗完畢的孔中加入2 mL無血清培養(yǎng)基。分別向不同分組的孔中轉(zhuǎn)染對應(yīng)質(zhì)?；蛘咭种谱?，轉(zhuǎn)染4 h后換液，拍照記錄。將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h、48 h和72 h取出拍照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 測序鑒定

通過Chromas軟件和應(yīng)用NCBI的BLAST功能，分別將設(shè)計的miR-15a-5p序列與測序結(jié)果比對。結(jié)果顯示匹配程度達(dá)100%，見圖1。

Figure 1.The sequencing result of miR-15a-5p.

圖1 miR-15a-5p的測序結(jié)果

2 SMMC-7721細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果

在6孔板中培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用瞬時轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的miR-15a-5p載體。48 h后提取RNA, real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-15a-5p的表達(dá)量。與空載組、對照組及空白組相比，實驗組中miR-15a-5p的表達(dá)量分別增加145.21%±10.32%、112.38%±12.25%和138.44±15.34%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression level of miR-15a-5p. The cells transfected with pre-miR-15a-5p was named experiment group; the cells transfected with the vector of nonsense sequences was named scramble group; the cells treated with the transfection reagent was named mock group; the cells treated without any reagent was named blank group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsexperiment group.

圖2 各組miR-15a-5p表達(dá)水平的比較

3 高表達(dá)miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖

轉(zhuǎn)染miR-15a-5p后用CCK-8法檢測其對SMMC-7721細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后實驗組SMMC-7721細(xì)胞的活力與空載組、對照組及空白組相比均有顯著下降。24 h時，實驗組細(xì)胞的活力分別為空載組、對照組及空白組細(xì)胞總數(shù)的50.23%±3.21%、51.75%±2.26%和52.32%±1.78%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。48 h時，實驗組細(xì)胞活力分別為空載組、對照組及空白組細(xì)胞活力的40.59%±7.11%、33.33%±4.52%和34.38%±6.55%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。72 h時，實驗組細(xì)胞活力分別為空載組、對照組及空白組細(xì)胞活力的44.89%±8.32%、44.45%±8.69%和39.53%±6.21%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3A。

在活細(xì)胞計數(shù)實驗中，實驗組細(xì)胞的增殖情況與對照組相比明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B。

Figure 3.Over-expression of miR-15a-5p inhibited the viability and growth of SMMC-7721 cells. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B: the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsexperiment group.

圖3 高表達(dá)miR-15a-5p抑制肝癌細(xì)胞的增殖

4 高表達(dá)miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移

每24 h觀察遷移的細(xì)胞，結(jié)果顯示，在48 h及72 h時，實驗組與空載組、對照組及空白組相比，細(xì)胞遷移速度顯著降低，測量數(shù)據(jù)經(jīng)分析差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

討 論

miR-15a-5p與多種腫瘤增殖和遷移明確相關(guān)。目前僅國內(nèi)一項研究發(fā)現(xiàn)miR-15a-5p對肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用[3]，暫無其它研究報道m(xù)iR-15a-5p對肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。本研究中通過構(gòu)建pre-miR-15a-5p過表達(dá)載體并瞬轉(zhuǎn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，可顯著提高miR-15a-5p表達(dá)。進(jìn)一步檢測證實高表達(dá)miR-15a-5p可抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖及遷移能力。這些結(jié)果提示miR-15a-5p表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖與遷移能力呈負(fù)相關(guān)。本研究中miR-15a-5p對肝癌細(xì)胞增殖的抑制能力結(jié)果與國內(nèi)文獻(xiàn)報道相一致[4]。

Figure 4.Up-regulation of miR-15a-5p expression inhibited the migration ability of SMMC-7721 cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsexperiment group.

圖4 上調(diào) miR-15a-5p表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的遷移能力

既往研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸瘤細(xì)胞 SW620 中，miR-15a-5p 與細(xì)胞周期蛋白 B1的 mRNA 3′ UTR 結(jié)合，抑制細(xì)胞周期蛋白 B1蛋白的合成，從而抑制結(jié)腸瘤細(xì)胞生長和增殖[5]。在頭頸部鱗癌中miR-15a-5p與細(xì)胞周期蛋白 E(cyclin E，CCNE)mRNA 的3′ UTR 結(jié)合，抑制CCNE 的合成，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5]。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤，miR-15a-5p直接作用于伴有Kazal域的富含半胱氨酸逆誘導(dǎo)蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK)，調(diào)控細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)一步證實可能與影響RECK下游基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)與分泌有關(guān)[6]。在Dai等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-15a-5p可抑制骨肉瘤細(xì)胞SOSP-9607的快速增殖，可能通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白D1。在Alderman等[8]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-15a會引起細(xì)胞周期停止在G1/G0期，并且會下調(diào)SK-MEL-28以及CRL-2808黑色素瘤細(xì)胞系中AKT3(AKT亞家族成員)和CDCA4(E2F家族成員)的表達(dá)，這2種蛋白均與細(xì)胞的增殖相關(guān)。而過表達(dá) miR-15a 時，miR-15a尚可與成纖維細(xì)胞生長因子2 (fibroblast growth factor 2, FGF2) mRNA的 3′ UTR結(jié)合抑制FGF2的表達(dá)，最終抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[9]。因此，我們推測miR-15a-5p可能通過直接調(diào)控多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白從而影響肝癌細(xì)胞增殖，而通過RECK影響MMP-9表達(dá)從而調(diào)控肝癌細(xì)胞遷移能力。另外Tian等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤細(xì)胞MG-63中，miR-15a的過表達(dá)會通過直接抑制TNFAIP1達(dá)到抑制腫瘤的增殖、遷移以及侵襲的目的。

綜上所述，我們的研究證實了高表達(dá)miR-15a-5p在人肝癌細(xì)胞中能抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。但miR-15a-5p抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移的機制，以及能否真正成為肝癌的藥物干預(yù)靶點及獨立的預(yù)后指標(biāo)還需要進(jìn)一步的研究證實。

[1] Bruix J, Sherman M. Management of hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2005, 42(5):1208-1236.

[2] 韓 旭， 陳 松， 張 濟， 等. miR15a靶蛋白依賴性的功能研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究, 2013, 17(5): 441-446.

[3] 羅耀玲，馬華謀，黃鈾新，等. miR-15a對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和DLK1表達(dá)的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2014, 35(7):985-988.

[4] Cai CK, Zhao GY, Tian LY, et al. miR-15a and miR-16-1 downregulate CCND1 and induce apoptosis and cell cycle arrest in osteosarcoma[J]. Oncol Rep, 2012, 28(5):1764-1770.

[5] Cohen EE, Zhu H, Lingen MW, et al. A feed-forward loop involving protein kinase Cα and microRNAs regulates tumor cell cycle[J]. Cancer Res, 2009, 69(1):65-74.

[6] Xin C, Buhe B, Hongting L, et al. microRNA-15a promotes neuroblastoma migration by targeting reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) and regulation matrix metalloproteinase-9 expression[J]. FEBS J, 2013, 280(3):855-866.

[7] Dai L, Wang W, Zhang S, et al. Vector-based miR-15a/16-1 plasmid inhibits colon cancer growthinvivo[J]. Cell Biol Int, 2012, 36(8):765-770.

[8] Alderman C, Sehlaoui A, Xiao Z, et al. MicroRNA-15a inhibits the growth and invasiveness of malignant melanoma and directly targets on CDCA4 gene[J]. Tumour Biol, 2016, 37(10):13941-13950.

[9] Musumeci M, Cpoopla V, Addario A, et al. Control of tumor and microenvironment cross-talk by miR-15a and miR-16 in prostate cancer[J]. Oncogene, 2011, 30(41):4231-4242.

[10]Tian X, Zhang J, Yan L,et al. MiRNA-15a inhibits proliferation, migration and invasion by targeting TNFAIP1 in human osteosarcoma cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6):6442-6449.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

miR-15a-5p inhibits proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells

QIAN Jian-sheng1, LI Yu2, DOU Jian-wei3

(1DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofRadiationOncology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;3PharmaceuticalCollegeofXi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,Xi’an710061,China.E-mail:jianshengqian@163.com)

AIM: To observe the influence of high expression of miR-15a-5p on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. METHODS: The miR-15a-5p oligonucleotide, which was reconstructed with additional restriction sites ofEcoR Ⅰ andHindⅢ, was chemically synthesized and confirmed by sequencing. The miR-15a-5p eukaryotic expression system was constructed by pcDNA6.2-GW/Em-GFP-pre-miR-15a-5p plasmid. The miR-15a-5p was transfected into the SMMC-7721 cells transiently by plasmid, and quantified by quantitative real-time PCR at the mRNA level. The cell viability was measured by CCK-8 assay, and the living cell counting was performed by the method of Trypan blue exclusion. The migration ability of the SMMC-7721 cells with high expression of miR-15a-5p was detected by wound healing test. RESULTS: The sequence of miR-15a-5p oligonucleotide 100% matched the designed sequence. Compared with control group, the miR-15a-5p expression was increased significantly (P<0.05). The viability, the living cell number and the migration ability of the SMMC-7721 cells were decreased in high expression of miR-15a-5p group with statistically significant difference (P<0.05).CONCLUSION: The abilities of proliferation and migration in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells are decreased by high expression of miR-15a-5p.

miR-15a-5p; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Cell migration

1000- 4718(2017)02- 0344- 06

2016- 09- 13

2016- 11- 21

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81573983)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.024

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