高靜 徐曉霞 陳平（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010010）

·綜述·

胃腸道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

高靜 徐曉霞 陳平
（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010010）

胃腸道平滑肌原代細(xì)胞培養(yǎng)基本保留了體內(nèi)生長特性，作為一種體外研究模型，在生理學(xué)、病理學(xué)、胃腸動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)等較多研究領(lǐng)域顯示出細(xì)胞株所不具備的優(yōu)越性。本文就胃腸道平滑肌原代細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定方法方面進(jìn)行了綜述，為研究消化系統(tǒng)疾病培養(yǎng)胃腸道平滑肌細(xì)胞方法的選擇提供參考。

胃腸道平滑肌細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；純化；鑒定

胃腸道平滑肌組織在人和動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，是構(gòu)成人體消化道的重要空腔臟器，通過收縮蠕動(dòng)來協(xié)助器官的功能發(fā)揮。胃腸道平滑肌原代細(xì)胞由于剛剛從活體組織分離出來，生物學(xué)特性還未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，可反映出體內(nèi)生長的一般性質(zhì)，適合用于胃腸動(dòng)力學(xué)、運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制及藥物研究等[1]。但由于獲得胃腸道原代細(xì)胞的過程較復(fù)雜、培養(yǎng)困難，使得原代細(xì)胞還不能成為實(shí)驗(yàn)材料的首選對象。原代細(xì)胞是否培養(yǎng)成功主要與細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法有關(guān)，因此有效分離原代細(xì)胞并保持其相應(yīng)的生物學(xué)特性，找到適合其生長的環(huán)境尤為重要。

1 取材

胃腸道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)主要來自于SD乳鼠、小鼠、大鼠、豚鼠及家兔等，取材前務(wù)必將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h以上（未進(jìn)食的可直接用于實(shí)驗(yàn)），分離材料時(shí)應(yīng)在手術(shù)顯微鏡或解剖顯微鏡下進(jìn)行，以達(dá)到分離完全的目的，分離后應(yīng)用4℃含雙抗（青霉素，鏈霉素）的PBS液反復(fù)沖洗，直至組織塊發(fā)白，再用不含血清的培養(yǎng)基沖洗1～2遍，將洗好的組織剪成1～2mm3大小組織塊，在剪碎的過程中要保持濕潤，最好使用不含血清的培養(yǎng)基，使用的刀剪盡量鋒利，預(yù)防對組織的撕拉等造成損傷，應(yīng)盡量縮短取材的時(shí)間。避免污染是GSMC培養(yǎng)的基礎(chǔ)，操作過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。

2 胃腸道平滑肌原代細(xì)胞的分離方法

2.1 組織塊培養(yǎng)法：組織塊培養(yǎng)法就是將組織剪成小塊后，直接接種到一定的培養(yǎng)基質(zhì)上，培養(yǎng)4～14 d后，細(xì)胞就會(huì)從這些組織塊四周游出，10～14 d細(xì)胞融合。組織塊培養(yǎng)法是分離胃腸道平滑肌細(xì)胞（Gastrointestinal smooth muscle cells，GSMC）最簡單的方法，具有經(jīng)濟(jì)、操作簡單、可反復(fù)利用組織塊等優(yōu)點(diǎn)[2]，能夠獲得高純度的單細(xì)胞，且分離的GSMC由于未經(jīng)過酶處理其活性較好、增殖能力也較強(qiáng)。缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期長且難傳代[3]，易被成纖維細(xì)胞污染。適用于較少組織的細(xì)胞培養(yǎng)和易被消化酶影響電活動(dòng)的細(xì)胞培養(yǎng)，如oddi括約肌和Cajal間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。吳志軒等[4]用組織塊法成功培養(yǎng)出Cajal間質(zhì)細(xì)胞，并證實(shí)了該方法短期培養(yǎng)的細(xì)胞保持了節(jié)律性內(nèi)向電流的特性，可以用來研究起搏電活動(dòng)。Thuneberg認(rèn)為[5]，酶的濃度過高或者消化時(shí)間過長，均會(huì)對Cajal間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生損害，應(yīng)該降低酶的濃度或在低溫下消化，但消化不充分達(dá)不到分散細(xì)胞的目的，因此組織塊培養(yǎng)法是目前研究Cajal間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程和功能特性的比較理想的模型[6]。

2.2 酶消化法：酶消化法是將組織用酶進(jìn)行消化，使細(xì)胞分散，并去除妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)等。酶消化法培養(yǎng)周期短，短期內(nèi)細(xì)胞收獲量大（可在消化1～6 h后即可獲得較純的GSMC，5 d左右細(xì)胞融合），但酶濃度和作用時(shí)間不易掌握，且消化酶本身對細(xì)胞有毒性作用，可致培養(yǎng)失敗。由于酶消化法能在短期內(nèi)獲得大量原代細(xì)胞，大大的節(jié)約了時(shí)間，故學(xué)者們多采用酶消化法分離原代細(xì)胞。膠原酶僅對細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對GSNC的影響不大可使細(xì)胞有效分離，是分離SMC最常用的酶，常用的主要有Ⅰ、Ⅱ型膠原酶。蔣鋒利等[7]用Ⅱ型膠原酶成功培養(yǎng)出SD乳鼠胃腸平滑肌細(xì)胞，并證明培養(yǎng)的細(xì)胞95%以上為GSMC。祝捷等[8]用Ⅱ型膠原酶成功培養(yǎng)出豚鼠近段結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，并做穿孔全細(xì)胞模式膜片鉗實(shí)驗(yàn)。為了達(dá)到更好的消化效果，近年來很多學(xué)者嘗試采用聯(lián)合酶消化法。劉東海[9]等用Ⅰ型膠原酶聯(lián)合木瓜蛋白酶成功分離出小鼠胃竇平滑肌細(xì)胞。丁術(shù)旺等[10]用Ⅱ型膠原酶聯(lián)合胰酶成功解離出家兔oddi括約肌細(xì)胞，并將其傳代培養(yǎng)。還可在酶消化的過程中加入大豆胰蛋白酶抑制劑（避免實(shí)驗(yàn)中破碎的細(xì)胞釋放大量的胰蛋白酶被激活對實(shí)驗(yàn)造成影響）、牛血清白蛋白、二硫蘇糖醇等。

3 胃腸道平滑肌原代細(xì)胞的培養(yǎng)

平滑肌細(xì)胞的基本功能相同，但不同器官來源的平滑肌細(xì)胞在形態(tài)、特定功能和基因表達(dá)方面都存在根本差異，而且細(xì)胞生長所需要的環(huán)境也有區(qū)別，因此對培養(yǎng)條件的要求也會(huì)存在一定的差別。在進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，要根據(jù)平滑肌的來源選擇合適的培養(yǎng)條件以盡可能地模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能較好生長和繁殖。

3.1 培養(yǎng)液的組成：GSMC原代培養(yǎng)時(shí)用10%～20%的胎牛血清，GSMC培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)液為DMEM、M199、1640等，蔣鋒利等[7]認(rèn)為對于GSMC的分離培養(yǎng)，M199作為基本培養(yǎng)基優(yōu)于DMEM。其中還可添加抗生素，常用的有青霉素/鏈霉素等，如果配制的培養(yǎng)基超過2周時(shí)，可加入L-谷氨酰胺。

3.2 細(xì)胞的傳代：當(dāng)原代細(xì)胞生長達(dá)培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí)或80%細(xì)胞融合時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，0.25%胰酶（含EDTA）是傳代時(shí)常用的消化酶，加入適當(dāng)胰酶鏡下觀察至胞質(zhì)回縮，間隙增大時(shí)及時(shí)終止消化。傳代時(shí)用1∶2的形式傳代，傳至5代以后細(xì)胞開始出現(xiàn)老化且活性降低甚至失去分裂能力。因此應(yīng)選取3～5代作為試驗(yàn)用細(xì)胞來源。

4 胃腸道平滑肌原代細(xì)胞的純化

原代GSMC分離時(shí)由于黏膜組織及表面結(jié)締組織剝離不盡，容易混入成纖維細(xì)胞，在傳代過程中成纖維細(xì)胞的生長速度快，會(huì)很快取代GSMC，因此需要純化GSMC。由于成纖維細(xì)胞和GSMC的貼壁時(shí)間不同及對胰酶的敏感性不同（成纖維細(xì)胞能較快貼壁，而GSMC貼壁時(shí)間在1～4h以上，成纖維細(xì)胞先于GSMC脫壁，特別是在原代和培養(yǎng)早期的細(xì)胞這種差別尤為明顯），因此可以利用反復(fù)貼壁法和胰酶/EDTA差時(shí)消化法來純化GSMC。當(dāng)GSMC的組織量多于成纖維細(xì)胞的組織量時(shí)，可利用自然純化法純化GSMC（因GSMC的增殖優(yōu)勢抑制成纖維細(xì)胞的生長），GSMC的純度會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸增高。為了更好地純化細(xì)胞，可根據(jù)實(shí)際情況聯(lián)合應(yīng)用幾種純化方法進(jìn)行純化。

5 胃腸道平滑肌原代細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng)的GSMC生長均一，大部分呈梭形狀，胞核位于中央，根據(jù)丁術(shù)旺等[10]報(bào)道的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)成功后的oddi括約肌純度通過檢測證實(shí)陽性，aactin染色陽性。成纖維細(xì)胞由于和GSMC形態(tài)具有相似性[11]，故尚需進(jìn)行GSMC的鑒定。鑒定GSMC的方法有倒置顯微鏡觀察、免疫組化法、免疫熒光染色法等。

6 胃腸道平滑肌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)機(jī)制

GSMC的運(yùn)動(dòng)是通過GSMC的收縮與舒張實(shí)現(xiàn)的。在此過程中，伴隨離子通道開放、關(guān)閉。離子和離子通道是細(xì)胞興奮性的基礎(chǔ)，亦即產(chǎn)生生物電現(xiàn)象的基礎(chǔ)。目前認(rèn)識(shí)GSMC收縮和舒張的機(jī)制：首先外界的刺激致使細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流，同時(shí)肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存鈣也釋放入胞漿。二者共同使[Ca2+]i顯著升高，宏觀表現(xiàn)為GSMC收縮。然后增高的胞漿鈣主要通過位于細(xì)胞膜和肌漿網(wǎng)上鈣泵及細(xì)胞膜的鈉鈣離子交換泵等途徑逆濃度差的轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外或肌漿網(wǎng)內(nèi)，從而使[Ca2+]i降低，進(jìn)而恢復(fù)到靜息水平，細(xì)胞舒張，宏觀變現(xiàn)為GSMC舒張。

7 小結(jié)與展望

GSMC培養(yǎng)技術(shù)同其它細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一樣正在日臻完善。隨著基因工程及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，GSMC培養(yǎng)的研究必將進(jìn)入分子水平，而膜片鉗技術(shù)的快速發(fā)展為從分子水平了解生物膜離子通道的門控動(dòng)力學(xué)特征及通透性、選擇性等膜信息，提供了最直接的手段，使人們對細(xì)胞膜通道功能的認(rèn)識(shí)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)結(jié)合必將為消化系統(tǒng)疾病的病因、機(jī)理研究發(fā)揮更大作用。

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Culture and Identification of Gastrointestinal Smooth Muscle Cells

Gao JingXu XiaoxiaChen Ping
（Department of Gastroenterology，The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010010，China）

Primary gastrointestinal smooth muscle cells cultured basis retention in vivo growth characteristics，as a model for the in vitro studies，in the Physiology，pathology，gastrointestinal motility and pharmacokinetics of drug large areas show cell lines do not have the advantages of.In this paper，the methods of isolation，culture，purification and identification of gastrointestinal smooth muscle cells were reviewed，which provides references for the study of options of gastrointestinal smooth muscle cells in digestive system diseases.

Gastrointestinal smooth muscle cells；Isolation；Culture；Purification；Identification

R573

A學(xué)科分類代碼：32024

1001-8131（2017）02-0185-03

2016-10-14

國家自然科學(xué)基金＜鈣離子通道在oddi括約肌運(yùn)動(dòng)功能中的調(diào)節(jié)機(jī)制以及在急性胰腺炎發(fā)生過程中的作用＞（81260072）