張偉陽(yáng)，鐘建平，楊國(guó)彪，金法祥，許文芳，王華鈞

（紹興市立醫(yī)院，浙江紹興 312000，1.感染科；2.檢驗(yàn)科）

·臨 床 經(jīng) 驗(yàn)·

LAMP和Xpert Mtb/RIF早期診斷肺結(jié)核傳染源的價(jià)值比較

張偉陽(yáng)1，鐘建平1，楊國(guó)彪1，金法祥2，許文芳2，王華鈞1

（紹興市立醫(yī)院，浙江紹興 312000，1.感染科；2.檢驗(yàn)科）

目的：評(píng)價(jià)DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)和Xpert Mtb/RIF早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核傳染源的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：采用Xpert Mtb/RIF檢測(cè)試劑盒、MGIT液體培養(yǎng)和LAMP技術(shù)對(duì)肺結(jié)核300份痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中涂陽(yáng)標(biāo)本100例。結(jié)果：肺結(jié)核涂陽(yáng)標(biāo)本100例，LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（MTB），陽(yáng)性96例，陽(yáng)性率為96.0%，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)MTB，陽(yáng)性97例，陽(yáng)性率為97.0%，涂陽(yáng)標(biāo)本2種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。涂陰標(biāo)本200例，LAMP技術(shù)檢測(cè)MTB，陽(yáng)性107例，陽(yáng)性率為53.5%，Xpert Mtb/RIF檢測(cè)MTB，陽(yáng)性50例，陽(yáng)性率為25.0%，涂陰標(biāo)本2種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：在診斷肺結(jié)核涂陽(yáng)標(biāo)本時(shí)，LAMP技術(shù)與Xpert Mtb/RIF的敏感性相似；診斷涂陰標(biāo)本時(shí)，LAMP技術(shù)優(yōu)于Xpert Mtb/RIF。

抗酸桿菌；結(jié)核分枝桿菌；核酸擴(kuò)增技術(shù)；診斷

結(jié)核病嚴(yán)重危害人類健康。近10年來(lái)，由于艾滋病的流行、移民和流動(dòng)人口的增加、耐多藥結(jié)核桿菌的增多，以及不少國(guó)家和地區(qū)對(duì)結(jié)核病控制的忽視等因素，全球結(jié)核病形勢(shì)急劇惡化[1]。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病，早期發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核傳染源是預(yù)防和控制結(jié)核病傳播的重要措施之一。本研究采用DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)（loopmediatedisothermalamplifyication，LAMP）技術(shù)及XpertMtb/RIF試劑盒對(duì)MTB進(jìn)行檢測(cè)，并與MGIT液體培養(yǎng)法比較各檢測(cè)法的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源標(biāo)本均來(lái)自我院2014年住院診斷為肺結(jié)核病的患者（男195例，女105例，平均年齡43.7歲），每人送檢一份合格痰標(biāo)本，共300份，其中涂陽(yáng)標(biāo)本100例，涂陰標(biāo)本200例。

1.2 試劑與儀器LAMP試劑（廣州華峰生物科技有限公司），GeneXpertMtb/RIF檢測(cè)儀及試劑盒（美國(guó)Cepheid公司），顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），生物安全柜（美國(guó)Nuaire公司）。

1.3 分枝桿菌菌株14株非MTB（包括胞內(nèi)分枝桿菌5株、鳥分枝桿菌3株、膿腫分枝桿菌1株、瘰疬分枝桿菌1株、堪薩斯分枝桿菌2株、海分枝桿菌1株、偶發(fā)分枝桿菌1株），均為本院臨床分離株，通過(guò)DNA微陣列芯片法進(jìn)行菌種鑒定；H37RvMTB標(biāo)準(zhǔn)株1株來(lái)自浙江省結(jié)核病防治研究所。

1.4 檢驗(yàn)方法每份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行MGIT液體培養(yǎng)、XpertMtb/RIF檢測(cè)及LAMP技術(shù)檢測(cè)。

1.5 MGIT液體培養(yǎng)采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉（NALC-NaOH）處理中和離心法培養(yǎng)MTB。

1.6 LAMP技術(shù)

1.6.1 DNA制備：根據(jù)痰液標(biāo)本量，加入2倍體積4%NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化30min；吸取1mL液化液加入無(wú)菌1.5mL離心管中，15000r/min離心5min，棄上清；沉淀用1mL0.9%氯化鈉溶液洗滌，15000r/min離心5min，棄上清，沉淀用1mL0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15000r/min離心5min，棄上清，沉淀用于模板提取；分別加入100μLDNA提取液I和0.25μLProteinaseK，56℃溫浴30min，再沸水浴10min；加入12.5μLDNA提取液I I，混勻，12000r/min離心5min，上清即為DNA模板。

1.6.2 核酸擴(kuò)增：取出HF管于室溫解凍。向上述反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對(duì)照、待檢模板和陽(yáng)性對(duì)照各2.5μL；置65℃恒溫反應(yīng)60min。反應(yīng)結(jié)束，將HF管倒置甩動(dòng)2次，再正置甩動(dòng)2次，使工作液與顯色液充分混合，冷卻至室溫后觀察。

1.6.3 結(jié)果判讀：待檢標(biāo)本反應(yīng)管液體呈綠色，結(jié)果為MTB陽(yáng)性；待檢標(biāo)本反應(yīng)管液體呈橙色，則報(bào)告MTB檢驗(yàn)結(jié)果為陰性。

1.7 Xpert Mtb/RIF檢測(cè)檢測(cè)試劑由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)，PCR檢測(cè)所需的3個(gè)步驟（DNA提取、擴(kuò)增和檢測(cè)）自動(dòng)化，WHO于2010年批準(zhǔn)了該法的應(yīng)用，按試劑說(shuō)明書操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP和Xpert Mtb/RIF檢測(cè)結(jié)果涂陽(yáng)標(biāo)本100例，LAMP檢測(cè)MTB陽(yáng)性率為96.0%，XpertMtb/ RIF檢測(cè)MTB陽(yáng)性率為97.0%，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.15，P＞0.05），見表1。

表1 涂陽(yáng)標(biāo)本檢測(cè)MTB結(jié)果

涂陰標(biāo)本200例，LAMP檢測(cè)MTB陽(yáng)性率為53.5%，XpertMtb/RIF檢測(cè)MTB陽(yáng)性率為25.0%，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.1，P＜0.01），見表2。

表2 涂陰標(biāo)本檢測(cè)MTB結(jié)果

涂陰標(biāo)本200例，LAMP技術(shù)檢測(cè)MTB的陽(yáng)性率與MGIT液體培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=42.2，P＜0.01）；XpertMtb/RIF檢測(cè)與MGIT液體培養(yǎng)法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.5，P＞0.05）。

2.2 非MTB檢測(cè)結(jié)果LAMP技術(shù)和XpertMtb/RIF檢測(cè)14株非MTB（胞內(nèi)分枝桿菌5株，鳥分枝桿菌3株，膿腫分枝桿菌1株，瘰疬分枝桿菌1株，堪薩斯分枝桿菌2株，海分枝桿菌1株，偶發(fā)分枝桿菌1株），結(jié)果均未檢出。XpertMtb/RIF檢測(cè)MTBH37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，結(jié)果MTB陽(yáng)性，利福平耐藥基因rpoB未檢測(cè)到突變結(jié)果，即對(duì)利福平敏感；LAMP技術(shù)檢測(cè)MTBH37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，結(jié)果陽(yáng)性。

2.3 LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)果300例痰液標(biāo)本，陽(yáng)性203例，陽(yáng)性率為67.7%，檢測(cè)結(jié)果肉眼判斷，沒(méi)有靶序列DNA的則為橙色，含有靶序列DNA管中有大量的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物而顯綠色，結(jié)果觀察見圖1。

3 討論

圖1 LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)果（綠色為陽(yáng)性，橙色為陰性）

結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)[2]。痰涂片染色法臨床中應(yīng)用最普遍，但敏感性低，漏檢率較高，且無(wú)法區(qū)分MTB和非MTB，也不能確定菌體是活菌還是死菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，建立在核酸擴(kuò)增基礎(chǔ)上的檢測(cè)法推動(dòng)更多科學(xué)研究，全球已經(jīng)開發(fā)了多種新型的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)，其中LAMP技術(shù)反應(yīng)2h即可完成核酸擴(kuò)增，通過(guò)目測(cè)可以得到清晰的結(jié)果，不需要長(zhǎng)時(shí)間的循環(huán)溫度，不需要PCR等昂貴的儀器，僅需要一恒溫設(shè)備，檢測(cè)成本大大降低。XpertMtb/RIF是WHO推薦的一種全新的結(jié)核病快速檢測(cè)方法，其采用熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，檢測(cè)MTB利福平耐藥基因rpoB的81bp耐藥核心區(qū)是否發(fā)生突變，從而判斷受檢菌株是否對(duì)利福平耐藥。該檢測(cè)系統(tǒng)所需試劑價(jià)格昂貴，在結(jié)核病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家，其廣泛應(yīng)用還存在困難。本研究結(jié)果顯示，XpertMtb/RIF檢測(cè)陽(yáng)性147例，陽(yáng)性率為49.0%，LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率為67.7%，明顯高于MGIT液體培養(yǎng)法，這與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[3-6]報(bào)道基本一致。

綜上所述，在診斷肺結(jié)核涂陽(yáng)標(biāo)本時(shí)，LAMP技術(shù)與XpertMtb/RIF的敏感性相似；診斷肺結(jié)核涂陰標(biāo)本，LAMP技術(shù)優(yōu)于XpertMtb/RIF，且具有試劑成本低的優(yōu)勢(shì)。LAMP技術(shù)檢測(cè)過(guò)程僅需2h，能早期診斷和鑒別診斷肺結(jié)核，預(yù)防非耐藥結(jié)核病進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幗Y(jié)核病，阻止和減少耐藥MTB在社區(qū)中的播散。因此，LAMP技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)。

[1] 金法祥, 王華鈞, 許文芳, 等. 4種新方法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的臨床研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2015, 25(21): 3638-3639.

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[3] 金法祥, 王華鈞, 孫小軍. DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2011, 21 (12): 2639-2640.

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（本文編輯：丁敏嬌）

Clinical application of LAMP and Xpert Mtb/RIF in early detection of pulmonary tuberculosis infection

ZHANG Weiyang1, ZHONG Jianping1, YANG Guobiao1, JIN Faxiang2, XU Wenfang2, WANG Huajun1. 1.Department of Infectious Diseases, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000; 2.Department of Clinical Laboratory, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000

Objective:To compare the clinical application of DNA loop mediated isothermal amplifcation (LAMP) technology and Xpert MTB/RIF in early detection of the infectious source of pulmonary tuberculosis.Methods:Three hundred TB sputum samples were detected using Xpert Mtb/RIF detection, MGIT liquid culture and LAMP technology, of which 100 cases of smear-positive specimens, 200 cases of smear-negative specimens.Results:In 100 cases of TB smear-positive specimens, the positive rate was 96.0% with LAMP technology, and the positive rate was 97.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＞0.05). In 200 cases of smear-negative specimens, the positive rate was 53.5% with LAMP technology, and the positive rate was 25.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＜0.01).Conclusion:In the diagnosis of smear positive specimens, the sensitivity of LAMP technology and Mtb RIF/Xpert was similar. In the diagnosis of smear negative specimens, LAMP technology is better than Mtb Xpert/RIF.

acid fast bacilli; mycobacterium tuberculosis; nucleic acid amplifcation techniques; diagnosis

R446.5

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.013

2016-05-31

紹興市衛(wèi)生計(jì)生科技計(jì)劃成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2016ZH003）。

張偉陽(yáng)（1965-），男，浙江新昌人，主任醫(yī)師。

金法祥，主任技師，Email：sxjfx0575@126.com。